Genome editing approaches and iPSC-based disease modeling for nucleotide repeat expansion disorders

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Nucleotide repeat expansion disorders (NREDs) are caused by the pathogenic expansions of short tandem repeats (STRs) within coding or noncoding genomic regions, leading to transcriptional dysregulation and the accumulation of toxic RNA or protein species. Although the molecular consequences of repeat expansion are increasingly well characterized, therapeutic progress has been hindered by the lack of precise and durable strategies to contract pathogenic repeats.
In this study, we developed PE-CORE, a paired prime-editing platform that enables accurate correction of expanded repeat tracts. PE-CORE to induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from patients with spinal and bulbar muscular atrophy (SBMA) or spinocerebellar ataxia type 1 (SCA1) resulted in efficient repeat correction without compromising pluripotency or genomic stability. Upon differentiation into spinal motor neurons, isogenic control lines exhibited normalized transcriptional signatures and reduced disease-associated hallmarks, indicating functional rescue following repeat correction.
To investigate systemic manifestations of SBMA, we additionally established a cardiac disease model using CRISPR–Cas9–engineered isogenic control iPSCs. SBMA iPSC-CMs displayed a hypertrophic-like phenotype accompanied by shortened field potential duration, reduced beat rate, and impaired intracellular calcium handling. Transcriptome profiling identified dysregulated calcium-dependent pathways and gene programs associated with cardiomyopathic remodeling, demonstrating that SBMA-associated cardiac dysfunction arises independently of ligand activation.
Together, these findings demonstrate that PE-CORE provides a precise and programmable approach for correcting nucleotide repeat expansions, and that patient-specific iPSC-based cardiac modeling offers mechanistic insight into SBMA-associated cardiomyopathy while expanding the utility of iPSC platforms for studying NREDs.

국문 초록 (Abstract)

염기서열 반복 확장 질환은 단백질 코딩 또는 비코딩 영역 내 단순 반복서열의 비정상적 연장에서 비롯되며, 그 결과 전사 조절 이상과 독성 RNA·단백질 축적 등이 유발된다. 반복 확장의 병리 기전은 점차 밝혀지고 있으나, 병원성 반복서열을 정밀하고 지속적으로 축소할 수 있는 치료 전략은 여전히 미흡하다.
본 연구에서는 반복 확장 교정을 위해 Prime editing 기반의 PE-CORE 플랫폼을 구축하였다. PE-CORE를 척수연수근위축증(Spinal and bulbar muscular atrophy, SBMA) 및 척수소뇌실조증 1형(Spinocerebellar ataxia type 1, SCA1) 환자 유래 유도만능줄기세포(iPSCs)에 적용한 결과, 줄기세포의 전분화능과 유전체 안정성을 유지한 상태에서 병원성 반복서열을 높은 정확도로 교정할 수 있음을 확인하였다. 교정된 iPSCs를 운동신경세포로 분화한 뒤 분석한 결과, 전사체 수준의 이상 신호가 정상화되고 질환 관련 세포 표현형이 완화되는 등 기능적 회복이 관찰되었다.
또한 SBMA의 전신적 병태를 규명하기 위해 유전적 대조군(isogenic control iPSC)을 확립하고 이를 심근세포(iPSC-CMs)로 분화하여 심장 질환 모델을 구축하였다. SBMA 유래 심근세포는 세포 비대, 단축된 field potential duration, 느려진 beat rate, 세포 내 칼슘 처리 이상 등 특징적인 심근병증 관련 변화를 보였다. 전사체 분석에서도 칼슘 신호 전달, 세포골격 조절, 심근 재형성과 연관된 유전자군이 광범위하게 교란되어 있었으며, 이는 SBMA의 심장 표현형이 기존의 신경·근육 조직에서 보고된 병리 특성과 일관됨을 보여준다.
주목할 점은 이러한 심근세포의 병적 변화가 안드로젠(호르몬) 자극이 없어도 자연적으로 나타나는 ‘리간드 비의존적(ligand-independent)’ 특성을 보였다는 것이다. 이는 SBMA에서 돌연변이 AR이 리간드 결합 없이도 세포 기능 이상을 유발할 수 있다는 선행 연구들과 부합하는 결과이다.
종합하면, 본 연구는 PE-CORE가 병원성 반복서열 확장을 정밀하게 교정할 수 있는 유효한 도구임을 제시하며, 환자 맞춤형 iPSC 기반 심장 모델이 SBMA의 심근병증 기전을 규명하는 데 기여할 수 있음을 입증하였다. 본 연구는 반복 확장 질환의 유전교정 전략 개발뿐 아니라 다양한 세포 유형에서의 질환 기전 탐구에 중요한 기반을 제공할 것으로 기대된다.

목차 (Table of Contents)

• General Introduction 1
• 1. Nucleotide repeat expansion disorders 1
• 2. Genome editing approaches for correcting repeat expansions 3
• 3. Disease modeling using induced pluripotent stem cells 5
• 4. Spinal and bulbar muscular atrophy 7
• 5. Aims of this thesis 9
• Chapter 1. 10
• I. Correction of nucleotide repeat expansions using paired prime editors 10
• I.1. Introduction 11
• I.2. Materials and Methods 14
• I.3. Results 21
• A. Generation of iPSCs from patients with nucleotide repeat expansion disorder 21
• B. Correction of repeat expansions in SCA1 and SBMA patient-derived iPSCs using PE-CORE 24
• C. Differentiation of disease and isogenic control iPSCs into spinal motor neurons 29
• D. Isogenic control iPSCs derived spinal motor neurons show reduced disease associated hallmarks 33
• I.4. Discussion 39
• I.5. Graphical summary 42
• Chapter 2. 43
• II. Disease modeling and mechanism study of a nucleotide repeat expansion disorder 43
• II.1. Introduction 44
• II.2. Materials and Methods 46
• II.3. Results 52
• A. Generation of SBMA patient-derived iPSCs and CRISPRCas9engineered isogenic control lines 52
• B. SBMA iPSC-derived cardiomyocytes exhibit hypertrophic-like phenotype 56
• C. SBMA iPSC-CMs display abnormal electrophysiological properties 63
• D. Transcriptomic profiling identifies cardiomyopathy-related gene signatures in SBMA iPSC-CMs 67
• II.4. Discussion 74
• II.5. Graphical summary 77
• Tables 78
• References 81
• 국문 요약 98