토마토 원형질체 기반 gRNA 평가 시스템 개발 = Development of gRNA Efficiency Assessment System using Protoplast in Tomato

국문 초록 (Abstract)

본 연구의 목적은 토마토(Solanum lycopersicum)에서 CRISPR/Cas9 기반 유 전자 편집을 위한 gRNA 효율 평가를 신속하고 정확하게 수행할 수 있는 원형질 체 기반 분석 시스템을 구축하는 것이다. 토마토 짧은 생활주기와 높은 유전적 다양성, 그리고 기능성 성분을 다량 함유하는 경제적 중요성으로 인해 유전자 기 능 분석 및 품종 개량 연구에 널리 활용되는 모델 작물이다. 그러나 토마토에서 CRISPR/Cas9 전달 및 편집 식물 생산에는 최소 수 개월에서 1년 이상의 시간 이 소요되기 때문에, 편집 효율을 결정하는 gRNA의 초기 검증 단계를 정밀하게 수행하는 것이 필수적이다. 기존 Agrobacterium 매개 형질전환 기반의 gRNA 평가 방식은 시간이 오래 걸리며 DNA 삽입에 다른 제약이 존재한다. 반면 원형질체 기반 시스템은 DNA, RNA, RNP 등 다양한 형태의 분자를 전달할 수 있고 빠르게 편집 여부를 확인 할 수 있으나, 토마토 원형질체 분리 및 형질감염 조건이 표준화되어 있지 않아 재현성이 낮다는 문제가 있었다. 이에 본 연구에서는 토마토 원형질체 수율·생존 율·형질감염 효율을 향상시키기 위해 황화 묘목을 이용한 프로토콜을 확립하였다. 그 결과, 비황화 조건 대비 원형질체 수율과 생존율, PEG 매개 형질감염 효율이 모두 유의하게 증가함을 확인하였다. 또한 gRNA 효율을 보다 정확하게 평가하기 위해, Cas9과 tracrRNA를 토마토 세포 내에서 미리 발현시킨 뒤 외부에서는 짧은 crRNA만을 주입하는 새로운 평 가 전략을 제시하였다. 이는 형질감염 시 투입되는 DNA의 크기를 크게 감소시 켜 전달 효율을 높일 수 있다는 장점이 있다. 유전자 편집을 통해 기존의 방법과 비교하여 본 시스템이 유효함을 검증하였다. 결론적으로, 본 연구는 토마토 원형질체 기반의 gRNA 평가 시스템을 최적화 하고, Cas9·tracrRNA pre-expression 전략을 도입하여 gRNA 효율을 더욱 신 속하고 정확하게 측정할 수 있는 플랫폼을 확립하였다. 본 시스템은 토마토 유전 자 편집 연구에서 gRNA 스크리닝 단계를 획기적으로 단축시키며, 향후 고효율 유전자 편집 작물 기반의 기반 기술로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The aim of this study was to establish a protoplast-based analytical platform that enables rapid and accurate evaluation of gRNA efficiency for CRISPR/Cas9-mediated genome editing in tomato (Solanum lycopersicum). Tomato is widely used as a model crop for gene function analysis and trait improvement due to its short life cycle, high genetic diversity, and significant economic value as a functional food rich in vitamins, minerals, and antioxidant compounds. However, CRISPR/Cas9 delivery and the regeneration of edited plants typically require several months to over a year, making precise evaluation of gRNA efficiency at the early experimental stage essential.
Conventional Agrobacterium-mediated transformation is commonly used for gRNA validation but is time-consuming and limited by the requirement for transgene insertion. In contrast, protoplast-based systems allow the delivery of diverse molecular forms—including DNA, RNA, and RNPs—and enable rapid assessment of editing outcomes. Nevertheless, the lack of standardized protoplast isolation and transfection conditions in tomato has resulted in poor reproducibility. To address this issue, we optimized a protoplast protocol using etiolated seedlings, which significantly improved protoplast yield, viability, and PEG-mediated transfection efficiency compared to non-etiolated controls.
To further enhance the accuracy of gRNA efficiency measurement, we developed a new evaluation strategy in which Cas9 and tracrRNA are pre-expressed within tomato cells, while only a short crRNA is supplied exogenously. This approach markedly reduces the size of delivered nucleic acids, thereby increasing delivery efficiency and minimizing size-dependent variability. The effectiveness of this system was validated by comparing genome editing outcomes with those obtained using conventional sgRNA plasmid-based methods.
In conclusion, this study establishes an optimized tomato protoplast system combined with a Cas9–tracrRNA pre-expression strategy, enabling faster and more precise assessment of gRNA performance. The proposed platform significantly shortens the gRNA screening process in tomato genome editing workflows and is expected to serve as a foundational technology for the development of highly efficient gene-edited tomato varieties.

목차 (Table of Contents)

• 1. 서론 1
• 2. 재료 및 방법 5
• 가. 식물 재료 및 배양 조건 5
• 나. 원형질체 분리 및 형질감염 5
• 다. gRNA 설계 6
• 라. 재조합 벡터 제작 7
• 마. 토마토에서 일시적 발현 7
• 바. 토마토 형질전환 8
• 사. 식물 genomic DNA 추출 9
• 아. 유전자 교정 효율 분석 10
• 자. 식물 RNA 추출 및 RT-qPCR 분석 10
• 3. 결과 13
• 가. 토마토 원형질체 분리 및 형질감염 프로토콜 확립 13
• 1) 비황화/황화 원형질체 수율 및 생존력 측정 13
• 2) 황화 원형질체의 향상된 형질감염 효율 16
• 나. gRNA 효율 평가 시스템 구축 18
• 1) Cas9&tracrRNA 발현 토마토 제작 및 Cas9 발현 확인 18
• 2) Agroinfiltration 결과 20
• 4. 고찰 23
• 참고문헌 26
• Abstract(영문 초록) 32