한약재의 생리활성성분 분리 및 효능유전자 확인 연구 : 고삼, 갈근, 2006 = Study on the Isolation of Bioactive Components and the Identification of Biomaker Genes from Oriental Herbal Medicines : Sophora flavescens, Pueraria lobata

국문 초록 (Abstract)

고삼과 갈근의 유효성분 중심의 관리를 위하여 고삼과 갈근을 70% EtOH로 추출, 각각 CH2Cl2, EtOAc, n-BuOH 및 H₂O fraction로 분획하여 각각 고삼에서 24종의 화합물을 분리하였으며, 갈근에 서 16종의 생리활성성분을 분리, 분리된 화합물의 구조는 MS, IR, UV, ¹H-NMR, ¹³C-NMR 등의 분광학적 분석을 통하여 정확하게 구조 동정하였다. 이들 분리된 화합물들의 순도는 각각 95% 이상이다. 또한 고삼과 갈근에 함유된 생리활성물질들 (고삼은 LC-MS/MS법, 갈근은 HPLC/UV 법)의 동시정량법을 HPLC/UV 법과 LC-MS/MS 법으로 새로이 개발하였다. 동시정량법에 대한 validation을 실시함으로써 동시분석법에 대한 타당성을 확립하였다. 시중 유통품과 수집시료 등 고삼은 10종과 갈근은 13종에 대해 활성성분의 함량을 측정하였다. 염증억제 효능 탐색 연구 결과로부터 DNA chip분 석에 사용할 약물은 고삼과 갈근 70%에탄올 추출물과 고삼 유효성분 Desmethylanhydroicaritin과 Kurarinone 그리고 고삼에 가장 많이 포함되어 있는 Matrine으로 결정하였고, 갈근 유효성분 중 Genistein, Daidzen, Puerarin, 그리고 Allantoin으로 결정하였다. 고삼 효능성분들을 인간 혈관내피세 포에 처리 시, 유의성 있게 변화는 유전자를 6시간에 1,600개, 20시간에 3,094개 확인하였다. 이들 중 공통으로 발현이 차별화된 유전자 62개를 확보하였다. 마찬가지로 갈근의 효능성분들을 내피세포에 6 그리고 18시간 처리하고 DNA chip을 분석한 결과, 유의성 있게 변화된 유전자는 6시간에 3,296개, 18 시간에 3,231개로 확인되었다. 이들 유전자 중에 처리한 약물 간에 중복성 유무를 확인한 결과, 발현의 변화가 가장 유의성 있는 유전자 70개를 확보하였다. 고삼의 70% 에탄올 추출물, 3종의 효능성분에 의해 발현의 변화가 있는 유전자 62개 중 RT-PCR로 15개를 확인하였으며, 또한 Kurarinone으로 11개의 유전자를 확인하여 차별화된 26개의 유전자를 확보하였다. 이들 유전자 중 염증, 세포 사멸억제에 가장 효과가 좋은 유전자를 택하여 신호 전달 체계를 확인 하였다. 갈근 성분들 또한 공통 발현 유전자 중 RT-PCR을 통하여 17개의 차별화된 유전자를 확보하였다. 위 결과를 종합해 볼 때 고삼과 갈근 효능성분들이 혈관 신생에 관련되는 유전자의 발현은 증가시키고 염증 반응에 관련된 유전자의 발현은 감소시킴으로 인해 동맥경화나 고혈압과 같은 염증성 혈관 질환의 발병을 억제 해주는 것으로 사료된다.○ 연구목표 : 고삼과 갈근의 유효성분 중심의 관리를 위하여 고삼과 갈근으로부터 생리활성성분을 분리(10종 이상)하고, LC/MS/MS를 활용한 유효 성분 중심의 한약재 관리에 필요한 고삼과 갈근 생리활성성분의 동시 다분석을 위한 정성․정량 분석법을 개발, 고삼과 갈근 유효성분 표준품의 LC/MS/MS 확인 분석을 한다. 그리고 고삼과 갈근으로부터 분리한 생리활성성분에 의해 발현이 차별화된 유전자를 DNA chip에서 분석 및 확보한다. 확보한 유전자의 차별화된 발현을 human 및 mouse로부터 유래된 세포주 혹은 primary cell에서 RT-PCR 방법으로 재확인한 후 선별된 유전자를 동물세포 발현벡터에 클로닝, 확보된 유전자를 인간 혹은 동물세포에 과잉 발현하여 유전자의 기능을 규명하여 유효성분을 투여한 동물의 각 장기에서 선별된 유전자의 발현변화를 검색한다. 또한 생리활성 성분의 in vivo 약리 효능을 확보된 유전자의 발현 수준과의 상관성을 검색하고 확보 유전자의 기능 및 효능별 DB화, 유전정보시스템 구축 및 biomarker를 개발한다.
○ 연구내용 : 고삼과 갈근의 유효성분 중심의 관리를 위하여 고삼과 갈근을 70% EtOH로 추출, 각각 CH2Cl2, EtOAc, n-BuOH 및 H2O fraction로 분획하여 각각 고삼에서 24종의 화합물을 분리하였으며, 갈근에 서 16종의 생리활성성분을 분리, 분리된 화합물의 구조는 MS, IR, UV, 1H-NMR, 13C-NMR 등의 분광학적 분석을 통하여 정확하게 구조 동정하였다. 또한 고삼과 갈근에 함유된 생리활성물질들 (고삼은 LC-MS/MS법, 갈근은 HPLC/UV 법)의 동시정량법을 HPLC/UV 법과 LC-MS/MS 법으로 새로이 개발하였다. 동시정량법에 대한 validation을 실시함으로써 동시분석법에 대한 타당성을 확립하였 다. 갈근의 시중 유통품과 수집시료 등 13종에 대해 활성성분의 함량을 측정하였다. 염증억제 효능탐색 연구 결과로부터 DNA chip분석에 사용할 약물은 고삼과 갈근 70%에탄올 추출물과 고삼 유효 성분 desmethylanhydroicaritin과 kurarinone 그리고 고삼에 가장 많이 포함되어 있는 matrine으로 결 정하였고, 갈근 유효성분 중 genistein, daidzen, puerarin, 그리고 allantoin으로 결정하였다. 고삼 효능성분들을 인간 혈관내피세포에 처리하였을 때 유의성 있게 발현이 변화되는 유전자는 6시간에 1,600개, 20시간에 3,094개 확인하였다. 이들 중 공통으로 발현이 차별화된 유전자 62개였으며, 고삼의 약리효능과 관련성이 있는 공통 유전자 21개를 RT-PCR로 재확인하였다. 동일한 방법으로 갈근의 효능성분들 분석한 결과, 유의성 있게 변화된 유전자는 6시간에 3,296개, 18시간에 3,231개로 확인되었다. 이들 유전자 중 발현의 변화가 가장 유의성 있는 유전자 70개를 확보하였고, 갈근의 약리효능과 관련성이 있는 공통 유전자 17개를 RT-PCR로 재확인하였다. 확보된 이들 유전자는 고산과 갈근의 품질과 효능의 표준화․과학화의 기초자료 및 biomaker로 활용될 수 잇을 것으로 사료된다. 이러한 결과는 고삼과 갈근 효능성분들이 혈관신생과 염증반응과 관련된 유전자의 발현을 조절함으로 동맥경화나 고혈압과 같은 혈관질환을 제어하는 약리효능이 있음을 유전자 수준에서 확인하는 것이다.
○ 연구성과(응용분야 및 활용범위포함) : 고삼과 갈근의 유효성분 중심의 관리를 위하여 고삼과 갈근을 70% EtOH로 추출, 각각 CH2Cl2, EtOAc, n-BuOH 및 H2O fraction로 분획하여 각각 고삼에서 24종의 화합물을 분리하였으며, 갈근에 서 16종의 생리활성성분을 분리, 분리된 화합물의 구조는 MS, IR, UV, 1H-NMR, 13C-NMR 등의 분광학적 분석을 통하여 정확하게 구조 동정하였다. 그리고 고삼과 갈근의 생리활성 성분의 정성 정량분석을 위하여 내부표준물질을 선정하여 확인된 유효물질의 HPLC분리 조건 및 정량을 위한 MS분석조건을 확립, 분석법에 대한 validation(특이성, 직선성, 범위, 정확성, 정밀성, 검출한계, 정량한계, 완건성, 시스템적합성 시험)을 실행하였다. 또한 고삼과 갈근으로부터 70.% EtOH추출물과 순수 분리한 10여종의 유효성분에 의 해 대식세포 및 혈관내피세포에 효능검색 및 특이유전자 발현조절 시스템을 확립하고, 확보된 유전자의 기능을 확인하였고, 고삼과 갈근 효능성분들이 혈관신생과 염증반응과 관련된 유전자의 발현을 조절함으로 동맥경화나 고혈압과 같은 혈관질환을 제어하는 약리효능이 있음을 유전자 수준에서 확인하는 것이다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Sophorae Radix, the dried roots of Sophora flavescens, a well-known Chinese traditional medicine has been used as a diuretic, stomachic, antipyretic, anthelmintic and eczema. From the CH2Cl2-soluble fraction and EtOAc fraction of the roots of S. flavescens was isolated compounds 1-24. Also, Puerariae Radix, the root of Pueraria lobata is one of the most important oriental crude drugs used as a antipyretic and antispasmodic agent. From the whole soluble fraction of the roots of P. lobata was isolated compounds 1-16. Their structural identification of these compounds was performed by analysis of 1D (¹H- and ¹³C-NMR) and 2D NMR (HMQC and HMBC) spectral data, and by comparisons w ith p ublished spectral d ata. The second sub-project have developed a HPLC or a LC-MS/MS analytical method to determine twelve marker compounds from S. flavescens Ait. (Sophorae Radix, Leguminosae) and five those from P. lobata (Wild.) Ohwi (Puerariae Radix, Leguminosae). Calibration graph showed good linearity across wide concentration ranges of the marker compounds. The simple analytical procedure has shown good accuracy and precision, and therefore is proposed an efficient method for fingerprinting analysis as well as quality control of the herbal drug. Quantities of marker compounds from collected and purchased samples of Sophorae Radix and Puerariae Radix were evaluated. In the present study, a cDNA microarray was performed to investigate the targeted genes of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) affected by S. flavescens. As a result, a total of 4,694 genes showed an altered expression of more than twofold by S. flavescens: 15 genes were validated by RT-PCR. The broad spectrum of the differentially expressed genes, including those associated with inflammation, immune response, apoptosis, as well as others, such as TXNIP, PRKCD, MPP2, LST1, DAP. FKSG2, TNFSF10, and PARRES3, indicate overall cellular response to Kurarinone treatment. Moreover, Kuarinone markedly suppressed the TNF-α-induced increase in levels of VCAM-1 and ICAM-1 mRNA and proteins. Our results suggest that the anti-inflammatory effect of S. flavescens may be related to TXNIP down-expression, and over-expression of DAP. We also investigate the tageted genes of HUVECs affected by Pueraria thunbergiana. Based on differential expression, 70 genes were selected for turther analysis from 6,527 candidate genes in the microarray; 17 genes were validated by RT-PCR. Among them were the genes related to cell angiogenesis, anti-inflammation, and functionally unknown. The up-regulation of angiogenesis-related genes, including SRCAP, NEDD4, GRIK2, and ACVRIB. Also down-regulation of inflammation-related genes, including BCAT1, CCL3L3, and ACK1. Moreover, Genistein markedly suppressed the TNF-α-induced increase in levels of VCAM-1 and ICAM-1 mRNA and proteins. Our results suggest that anti-inflammatory effect of Pueraria thunbergiana. may be reated to BCAT1, CCL3L3, and ACK1 down-expression.