Bifidobacterium의 β-glucosidase 활성과 돌연변이원성

국문 초록 (Abstract)

대부분의 Bifidobacterium은 β-glucosidase 활성을 가지며 식이 또는 장관 물질로부터 생성된 배당체를 분해하여 발암성 물질을 생성하는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 연구에서는 β-glucosidase의 대장내 수준과 Bifidobacterium β-glucosidase가 배당체에 작용하여 돌연변이 물질을 생성함을 Ames test와 SOS chromotest를 통해 확인하고자 하였다. 또한
β-glucosidase가 제거된 변이균주를 생산하고 야생의 β-glucosidase negative 균주를 분리하여 이들 균주의 당 발효 특성을 비교 하였다.
실험 결과 대장에서의 β-glucosidase 수준은 성인이 유아에 비하여 2.7배 높게 나타났다. 한편 성인과 유아로부터 분리된 Bifidobacterium 균주의 각각 90%와 92%가 β-glucosidase생산 균주로 거의 차이가 없게 나타났으나 균주의 효소활성도에서는 성인에서 분리된 균주가 유아로부터 분리된 균주보다 3.4배 높게 나타났다.
ATCC로부터 구입한 Bifidobacterium의 β-glucosidase 활성을 비교한 결과에서는 B. infantis, B. adolescentis 그리고 Bifidobacterium sp. Int-57에서는 높은 활성을 보였으며 B. bifidum과 B. longum에서는 상대적으로 낮은 활성을 보였다.
Bifidobacterium sp. Int-57은 cellobiose와 propionate에 의해 효소활성이 증가되었으며 효소생산 유도 조사 결과 cellobiose는 효소생산을 유도하나 glucose는 억제하는 것으로 나타났고 cAMP 와 dibutyryl cAMP에 의한 유도효과는 없는 것으로 나타났다.
효소 활성도가 높은 균주인 Bifidobacterium sp. Int-57을 사용하여 효소를 생산한 뒤 gel filtraion, ion-exchange chromatography를 통하여 효소를 정제하였다. 또한 이 효소를 사용하여 cycasin과 작용시킨 뒤 TLC를 통해 분해산물을 살펴본 결과 반응 2시간 후에는 glucose가 유리됨을 알 수 있었다.
한편, Ames test 및 SOS chromotest를 통한 돌연변이원성 시험결과 Bifidobacterium β-glucosidase와 cycasin을 함께 반응시킨 경우에 돌연변이성이 나타남을 확인하였다.
Bifidobacterium sp. Int-57에 Chemical mutagen, EMS를 처리하여 β-glucosidase가 제 거된 균주를 생산하였으며 이 균주와 wild type의 β-glucosidase negative균주들의 당 발효능력을 조사하여 동정한 결과 이들 균주들은 β-glucosidase의 기질로 알려진 arbutin, cellobiose, esculin, naringin, salicin등을 이용하지 못하는 것으로 나타났다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Most of the Bifidobacterium strains possess β-glucosidase which is known to hydrolyze cellobiose as well as to produce carcinogenic aglycones from non-carcinogenic glycones originating from diets or enterohepatic circulatory materials.
This study was undertaken to examine whether Bifidobacterium β-glucosidase produced mutagenic compound from amutagenic glycosides using the partially purified enzyme.
The level of β-glucosidase in the feces of adults was 2.7 times higher than that of infants. There was no difference in the percentage of β-glucosidase positive strains among the Bifidobacterium isolates between adults and infants, corresponding to 90% and 92% respectively. However the strains from adults showed 3.4 times higher activity than those from infants. Generally B. adolescentis showed higher activity than B. infantis, B. breve, B. bifidum or B. longum.
Bifidobacterium sp. Int-57 was chosen in this study because it was one of the strong producer of β-glucosidase. The β-glucosidase production of Int-57 was increased by adding cellobiose and propionate into the growth medium while lowered by glucose. cAMP and dibutyryl cAMP had no effect.
The enzyme was extracted from sonicated Int-57 cells and purified by Sepharose CL-6B gel filtration and DEAE-cellulose ion-exchange chromatography.
The hydrolysis products of cycasin by the partially purified enzyme were analyzed using thin-layer chromatography. The results showed that Bifidobacterium β-glucosidase can hydrolyze cycasin and activated cycasin to a mutagen in Salmonella mutagenicity test (Ames test) and SOS chromotest. This is a first report that Bifidobacterium β-glucosidase is involved in the production of mutagenic compound.
A stable β-glucosidase negative mutant was obtained by the treatment of Int-57 with a chemical mutagen, EMS. Investigation of the carbohydrate fermentation showed that β-glucosidase negative mutant and wild type strains were not able to use β-glucosidase substrates such as arbutin, cellobiose, esculin and salicin for fermentation.

목차 (Table of Contents)

• 목차
• 국문요약 = ix
• I. 서론 = 1
• II. 실험재료 및 방법 = 7
• 1. 실험재료 = 7
• (1) 사용균주 = 7
• (2) 사용시약 = 7
• (3) 사용배지 = 8
• 2. 실험방법 = 9
• (1) Bifidobacterium의 분리 = 9
• (2) Bifidobacterium의 배양 = 9
• (3) F6PPK Test = 9
• (4) β-Glucosidase 활성 측정 = 10
• (5) 대장에서 β-glucosidase 수준 및 Bifidobacterium의 β-glucosidase 보유균주 분포 = 11
• (6) 장내균주 및 Bifidobacterium의 β-glucosidase 활성도 = 11
• (7) Bifidobacterium sp. Int-57로부터 β-glucosidase 생산 = 12
• 1) Cellobiose 및 propionate의 효과 = 12
• 2) 대사유도제의 효과 = 12
• 3) Jar-fermentor로부터 β-glucosidase 생산 = 13
• (8) β-Glucosidase 분리 및 정제 = 13
• 1) Sepharose-6B gel filtration = 14
• 2) DEAE cellulose ion-exchange chromatography = 14
• (9) β-Glucosidase 돌연변이원성 실험 = 14
• 1) 배당체와의 작용양상 = 14
• 2) Ames test(Salmonella mutagenicity test) = 15
• 3) SOS chromotest = 16
• (10) β-Glucosidase가 실활된 변이 균주 생산 = 17
• (11) β-Glucosidase 생산능력에 따른 균주들의 발효특성 = 17
• III. 실험결과 및 고찰 = 18
• 1. 대장에서 β-glucosidase 수준 및 Bifidobacterium의 β-glucosidase 보유 분포 = 18
• 2. 장내균주 및 Bifidobacterium의 β-glucosidase 활성도 = 21
• 3. Bifidobacterium sp. Int-57로부터 β-glucosidase 생산 = 28
• (1) Cellobiose 및 propionate의 효과 = 28
• (2) 대사유도제의 효과 = 31
• (3) Jar-fermentor로부터 β-glucosidase 생산 = 31
• 4. β-Glucosidase 분리 및 정제 = 34
• (1) Sepharose-6B gel filtraion = 34
• (2) DEAE cellulose ion-exchange chromatography = 37
• 5. β-Glucosidase 돌연변이원성 실험 = 37
• (1) 배당체와의 작용양상 = 37
• (2) Ames test(Salmonella mutagenicity test) = 40
• (3) SOS chromotest = 40
• 6. β-Glucosidase가 실활된 변이 균주 생산 = 43
• 7. β-Glucosidase 생산능력에 따른 균주들의 발효특성 = 43
• IV. 요약 및 결론 = 45
• 참고문헌 = 47
• APPENDIX = 57
• ABSTRACT = 67