Characterization of the major dehydrogenase related to D-lactic acid synthesis in Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ATCC 8293 : Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ATCC 8293 유래 D형젖산 생성에 관여하는 주요 단백질에 대한 특성 분석

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The demand for lactic acid has been increasing considerably because of its use as a monomer for the synthesis of polylactic acid (PLA), which is a promising and environment-friendly alternative to the petroleum-derived plastics. Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ATCC 8293 is a lactic acid bacterium that converts pyruvate mainly to D-(-)-lactic acid by D-(-)-lactate dehydrogenase (ldhD). This study aims to determine the gene responsible for D-lactic acid formation, as well as to provide information of enzymes for the optically pure D-lactic acid production. A genomic analysis of L. mesenteroides ATCC 8293 revealed that 7 genes encode lactate-related dehydrogenases. According to the transcriptomic, proteomic, phylogenetic analysis, LEUM_1756 is a major gene responsible for the production of D-lactic acid. The LEUM_1756 gene, which has 996 bp encoding 332 amino acids (36.5 kDa), was cloned and over-expressed in E. coli BL21(DE3) star with an inducible expression vector pET-21a(+). The purified enzymes via Ni-NTA column chromatography showed specific activity of 4448.20 U/mg, which is sighificantly high compare to previously reported ldhs. The optimum pH and temperature for the enzyme were 8.0 and 30°C, respectively, in the pyruvate reduction reaction, and 11.0 and 20°C, respectively, in the lactate oxidation reaction. The kinetic parameters, Km and Vmax for pyruvate were 0.58 mM and 476.19 µM/min, respectively, and for lactate were 259.96 mM and 375.14 µM/min, respectively. In addition, the Kcat values of pyruvate and lactate were 2896.85 s-1 and 2282.12 s-1, respectively. The enzyme was not inhibited by Ca2+, Co2+, Cu2+, Mg2+, Mn2+, Na+, urea, while it was inhibited by 1 mM of Zn2+ and SDS.

국문 초록 (Abstract)

환경오염을 일으키는 석유화학제품으로 만든 플라스틱을 대체할 수 있는 바이오폴리머인PLA(폴리락트산)에 대한 관심이 높아짐에 따라서 PLA에 생산에 단량체로 사용되는 젖산에 대한 수요도 증가하고 있다. 젖산은 D형젖산과 L형젖산을 갖고 있고 그 비율은 PLA 내열성에 영향을 준다. 따라서 순수한 D형젖산 혹은 L형젖산 생산이 필요하게 되며 화학적합성기술과 미생물발효에 의한 생산기술을 이용하여 젖산을 생산하고 있다. 한편 근래에는 바이오 기술의 발전과 함께 미생물발효를 통한 합성기술이 빠르게 부상하고 있다.
Leuconostoc 속은 김치와 사우어크라우트 같은 야채발효식품에서 스타터로 이용되는 이형젖산균으로서 발효과정에 젖산, 알코올, 이산화탄소를 생성하고 있다. Leuconostoc 속 균주는 D-(-)-lactate dehydrogenase (ldhD) 효소에 의하여 pyruvate 로부터 주로 D형젖산을 생성한다. 지금까지Lactobacillus 속 균주에서의 ldhD 효소에 대한 연구가 진행되었고 Leuconostoc속 균주에서의 ldhD 효소에 대한 연구가 아직까지 미흡하다.
본 연구에서는Leuconostoc 속 균주에서 D형젖산 생성에 관여하는 유전자를 찾고 순수한 D형젖산을 생성하는데 유전적 정보를 제공해줌으로써 산업적으로 PLA생산에 starter로 이용되고자 한다. 전사체와 프로테옴 분석으로부터 LEUM_1756 유전자가 주요 D형젖산 생성에 관여하는 유전자임을 추정할 수 있다. LEUM_1756 유전자는 996 bp이고 332개 아미노산을 번역하며 유도성 플라스미드pET-21a(+)에 클론 하여 E. coli BL21(DE3) star 균주에서 발현시켰고 니켈 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 이 효소의 최적 pH와 온도는 pyruvate 환원반응과 lactate 산화반응에서 각각 8.0과 30°C, 11.0과 20°C 였다. Pyruvate의 속도 변수 Km과 Vmax의 값은 각각0.58 mM과476.19 µM/min이고 lactate의 속도 변수 Km과 Vmax의 값은 각각 259.96 mM과 375.14 µM/min 로 측정되였다. 그리고 이 효소는 Ca2+, Co2+, Cu2+, Mg2+, Mn2+, Na+, urea 등과 같은 금속이온의 저해를 받지 않고 다만 1 mM 의Zn2+ 과 SDS에 대해 제해 효과를 갖고 있다.

목차 (Table of Contents)

• I. Introduction 1
• 1.1. The genus Leuconostoc 1
• 1.1.1 Morphology and growth characteristics 1
• 1.1.2 Metabolism 3
• 1.1.3 Leuconostoc in food 5
• 1.2. Lactic acid 7
• 1.2.1 Lactic acid 7
• 1.2.2 Lactic acid contents in LAB 8
• 1.2.3 Production of lactic acid 10
• 1.2.4 Applications of lactic acid 14
• 1.3. Lactate dehydrogenase 15
• 1.4. Poly lactic acid 18
• 1.5. Research objectives 19
• II. Materials and Methods 21
• 2.1 Materials 21
• 2.1.1 Bacterial strains, plasmids, and selection media 21
• 2.1.2 Enzymes and reagents 23
• 2.1.3 Oligonucleotides 24
• 2.2 Methods 25
• 2.2.1 Preparation of genomic DNA 25
• 2.2.2 Amplification of ldhD gene 26
• 2.2.3 Isolation and purification of DNA fragments 27
• 2.2.4 Construction of recombinant plasmid 28
• 2.2.5 Transformation of E. coli 30
• 2.2.6 Preparation of plasmid DNA 31
• 2.2.7 DNA sequencing 32
• 2.2.8 Expression of the ldhD gene 32
• 2.2.9 Purification of the recombinant enzymes using a Ni-NTA column 33
• 2.2.10 SDS-PAGE analysis 34
• 2.2.11 Determination of protein concentration 35
• 2.2.12 Gel permeation chromatography 36
• 2.2.13 Assay of enzyme activity 36
• 2.2.14 Analysis of the reaction product 37
• 2.2.15 Transcriptomic and proteomic analysis 37
• 2.2.16 Effects pH and temperature on ldhD enzyme activity 38
• 2.2.17 Substrate specificity 39
• 2.2.18 Enzyme inhibiting chemicals 39
• 2.2.19 Kinetic parameters 39
• 2.2.20 Comparision of the amino acid sequences of ldhD gene in Leuconostoc with other strains 40
• III. Results 41
• 3.1 Transcriptomic and proteomic analysis of lactate dehydrogenase genes 41
• 3.2 Comparative amino acid sequence analysis of LEUM_1756 with other ldhs 43
• 3.3 Amplification of LEUM_1756 gene using the PCR 48
• 3.4 Construction of recombinant plasmid pETldhD 50
• 3.5 Expression of the ldhD enzyme in E. coli 53
• 3.6 Purification and structural analysis of ldhD enzyme 55
• 3.7 Analysis of the reaction product 57
• 3.8 Effects of pH and temperature on ldhD enzyme activity 60
• 3.9 Substrate specificity 63
• 3.10 Inhibitor studies on ldhD 65
• 3.11 Kinetic properties of ldhD 67
• DISCUSSION 71
• REFERENCES 75
• SUMMARY IN KOREAN 82