MITF- and SFRP5-derived Peptides Inhibit Melanogenesis via Suppression of MITF and Wnt activity

국문 초록 (Abstract)

피부에 자외선이 노출되면 표피의 멜라닌세포에서 멜라닌이 생성되어 피부를 보호하게 된다. 그러나 과도한 멜라닌 생성은 Melanoma, Nevus, Freckles와 같은 질환을 유발할 수 있다. 멜라닌은 멜라닌세포에서 합성되며 다양한 분자적 신호가 관여하게 된다. cAMP/PKA과 WNT/β-catenin 신호전달경로는 멜라닌 합성에 관여하는 대표적인 경로이다. cAMP/PKA 경로는 cAMP Response Element Binding Protein (CREB) 전사인자 발현을 유도하고, 그 결과 멜라닌세포의 증식과 멜라닌색소의 합성을 조절하는 Master Regulator인 Microphthalmia-associated Trascription Factor (MITF)를 활성화 시킨다. 반면, 분비된 WNT protein이 멜라닌세포 표면에 분포되어 있는 Frizzled Receptor와 LRP5/6에 결합하게 되면 WNT/β-catenin 신호전달경로가 활성화된다. 그 결과 GSK-3β가 감소되고, β-catenin는 안정화되어 세포질 내에 β-catenin이 증가하게 된다. 활성화된 MITF와 안정화된 β-catenin은 핵 안으로 이동하여 멜라닌 합성과 세포 생존에 관여하는 Tyrosinase나 BCL-2와 같은 유전자들의 프로모터부위에 결합하여 이 유전자들의 전사를 유도한다. 이러한 멜라닌 합성에 관여하는 신호전달경로를 억제하는 미백소재들이 많이 개발되고 있지만, MITF나 WNT 경로를 직접적인 표적으로 하는 멜라닌 합성저해연구는 보고된 바가 적다.
본 연구의 목적은 MITF와 SFRP5로부터 유래한 펩타이드들의 멜라닌합성 억제 기전을 규명하는 것이다. B16F1 melanoma cell에 처리하였을 경우, MITFpepC는 MITF의 Tyrosinase Promoter Region 결합을 농도의존적으로 감소시켰으며, SFRP5pepD는 MITF와 β-catenin의 핵으로의 이동 및 MITF와 β-catenin의 결합을 농도 의존적으로 감소시킴을 확인할 수 있었다. 다음으로 다양한 농도의 MITFpepC와 SFRP5pepD를 B16F10 세포와 사람 멜라닌세포에 처리할 경우, 멜라닌세포의 성장, 타이로시네이즈 활성 및 멜라닌 생성이 펩타이드 처리농도에 비례하여 감소함을 확인하였다. 또한 Tyrosinase, Tyrosinase-Relative Protein1, 2와 같은 멜라닌합성 관련효소들의 발현이 감소함을 확인하였다. Skin hairless mouse 이용한 in vivo 실험에서는 펩타이드들이 처리된 표피에서 멜라닌 생성이 억제됨을 조직화학염색법을 통해 확인하였다.
이러한 결과들은 MITF와 SFRP5로부터 유래된 펩타이드들이 Melanoma의 예방 또는 치료용 약제 개발과 피부 미백용 및/또는 피부 색소 침착 억제용 화장료 소재 개발에 널리 이용될 수 있음을 보여 준다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Melanin is synthesized by melanocytes in skin epidermis and provides a vital protection against the ultraviolet radiation of the solar light. UV-exposed keratinocytes secrete α-MSH, which then activates cyclic adenosine monophosphate/protein kinase A (cAMP/PKA) signaling and subsequently upregulates the expression of microphthalmia-associated transcription factor (MITF), the master regulator of melanogenesis, through the phosphorylation and activation of the cAMP response element binding protein (CREB) transcription factor. On the other hand, canonical Wnt/β-catenin is activated by Wnt family of secreted glycolipoproteins and stabilizes β-catenin by inhibiting GSK-3β through the Wnt signalosome. Upregulated MITF and stabilized β-catenin are translocated into nucleus and bind the target genes for melanogenic enzymes including tyrosinase, tyrosinase related protein-1 (TYRP1), and tyrosinase related protein-2 (TYRP2).
In this study, we investigated the effects of MITF and Sfrp5 antagonist peptides on melanogenesis and molecular mechanisms underlying their anti-melanogenic activity both in vitro and in vivo. Our findings showed that the treatment of melanocytes with the MITF and Sfrp5 antagonist peptides inhibited α-MSH-induced melanin production and TYR activity. Furthermore, MITF and Sfrp5 antagonist peptides reduced the expression of the melanogenic enzyme genes at both mRNA and protein levels in a dose-dependent manner. We have also found that MITF and Sfrp5 antagonist peptides inhibited the formation of MITF/β-catenin complexes, leading to an overall decrease in melanin synthesis.
These results collectively suggest that MITF and Sfrp5 antagonist peptides could be promising candidates for the treatment of melanogenesis-associated disorders.

목차 (Table of Contents)

• I. Introduction １
• 1. Melanogenesis １
• 2. PKA signaling ３
• 3. Wnt/β-catenin signaling ６
• 4. Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) ８
• 5. Secreted frizzled-related protein 5 (Sfrp5) １０
• 6. Goal of study １２
• II. Materials and Methods １３
• 1. Materials １３
• 2. Cell culture １３
• 3. Proliferation assay １４
• 4. UVB irradiation and treatment １５
• 5. FACS analysis １５
• 6. In situ L-dopa staining １５
• 7. Melanin content １６
• 8. Tyrosinase activity １６
• 9. RNA extraction and real-time PCR １７
• 10. Western-blot １８
• 11. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) assay １９
• 12. In situ Proximity ligation assay (PLA) ２０
• 13. In-vivo test ２１
• 14. Immunohistochemistry staining ２１
• 15. Statistical analysis ２２
• III. Results ２４
• 1. MITF antagonist peptide ２４
• 1.1 MITF antagonist peptide inhibits melanin synthesis and the expression of melanogenic enzymes in B16F1 ２４
• 1.2 MITFpepC inhibits the proliferation of B16 melanoma cells ３０
• 1.3 MITFpepC decreases melanin synthesis and expression of melanogenic enzymes in NHMs ３４
• 1.4 Expression of MITF is not inhibited by MITFpepC ３７
• 1.5 MITFpepC directly decrease the physical interaction and binding to the tyrosinase promoter ４０
• 1.6. MITFpepC inhibits melanin synthesis in mouse skin ４３
• 2. Wnt antagonist peptide ４６
• 2.1. The identification of Wnt antagonist peptides ４６
• 2.2 Sfrp5pepD suppressed not only the interaction of MITF/β-catenin but nuclear translocation of MITF and β-catenin ４９
• 2.3. Sfrp5pepD inhibits melanin synthesis and the expression of melanogenic enzymes in B16F1 ５２
• 2.4. Sfrp5pepD decreases melanin synthesis and the expression of melanogenic enzymes in NHMs ５５
• 2.5 Sfrp5pepD inhibits melanin synthesis in mouse skin ５８
• IV. Discussion ６１
• 1. MITF antagonist peptide ６１
• 2. Sfrp5 antagonist peptide ６５
• VI. Reference ６９