Identification of Novel Genes Regulating the Capsaicinoid Biosynthesis Pathway in Pepper Using Transcriptome Analysis = 전사체 분석을 활용한 고추의 캡사이시노이드 생합성 경로 조절 유전자 발견

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Capsaicinoid is a unique secondary metabolite that is synthesized only in Capsicum spp. It provides a pungent taste that made pepper commercially popular as spice. Genes encoding acyltransferase (Pun1), putative aminotransferase (pAMT), CaMYB31 (Pun3), and putative ketoacyl-ACP reductase (KR) were functionally validated to be involved in the capsaicinoid biosynthesis. However, the whole biosynthetic pathway and its regulatory network has not been fully understood. In addition, the mechanism controlling capsaicinoid biosynthesis in pericarp tissues of certain Capsicum spp. remains to be revealed. In this study, transcription data of pepper placenta tissues and pericarp tissues from the previous studies were used to find candidate genes involved in capsaicinoid biosynthesis. Differentially expressed genes (DEG) analysis and Weighted correlation network analysis (WGCNA) discovered candidate genes that might be involved in capsaicinoid biosynthesis. By aligning these genes to QTL positions reported in the previous studies, three genes (Pun1, pAMT, G3PAT) in placenta transcriptome data and two genes (KR, HDG11L) in pericarp transcriptome data were identified. G3PAT and HDG11L encoding acyltransferase and transcription factor, respectively, were newly identified in this study. To validate the function of the genes, two genes were silenced by the virus induced gene silencing (VIGS) method. VIGS of G3PAT resulted in reduction of capsaicinoid content in placenta of pepper fruit, and expression changes in phenylpropanoid pathway and branched fatty acid pathway genes were observed. The results in this study will be useful for further understanding the capsaicinoid biosynthesis.

국문 초록 (Abstract)

캡사이시노이드 (capsaicinoid)는 고추속에서만 만들어지는 특이한 2차 대사산물이다. 이는 고추가 신미를 내게 해주는 물질이며, 조미료로써 상업적인 중요도를 갖게 해 주었다. 캡사이시노이드 생합성에는 Pun1, pAMT, Pun3, CaKR1가 관여한다고 기능적으로 검증되었다. 하지만 전체적인 생합성 경로와 이를 조절하는 네트워크는 명확하게 규명되지 않았다. 이에 더해, 과피 조직에서 캡사이시노이드를 합성하는 기작에 대해서 역시 밝혀진 바가 없다. 본 연구에서는 기존에 공개된 고추의 태좌와 과피의 전사체 자료를 사용하여 캡사이시노이드 생합성에 관여하는 후보 유전자를 찾고자 하였다. 차등발현유전자 분석과 WGCNA 방법을 사용하여 캡사이시노이드 생합성에 관여하는 후보유전자를 발견할 수 있었다. 후보유전자들을 기존에 보고된 QTL 지역과 비교하여 태좌 전사체 자료에서 세 개 유전자(Pun1, pAMT, G3PAT)를, 과피 전사체 자료에서 두 개 유전자(KR, HDG11L)를 얻을 수 있었다. G3PAT와 HDG11L은 각각 아실기전이효소와 전사인자를 코딩하는 유전자로, 기존에 신미에 관여한다고 밝혀진 바 없는 유전자이다. 기능 검정을 위해 두 유전자는 VIGS 방식으로 silencing되었다. G3PAT의 VIGS를 통해 고추 태좌의 캡사이시노이드 함량이 줄어들었으며, 페닐프로파노이드와 분지지방산 합성 경로에 관여하는 유전자 발현에도 변화가 일어난 것을 확인하였다. 이러한 결과는 추후 캡사이신 생합성 과정을 이해하는데 도움이 될 것이다.

목차 (Table of Contents)

• INTRODUCTION 1
• MATERIALS AND METHODS 5
• Plant materials 5
• Trimming and Mapping RNA-seq reads 9
• Differentially expressed gene (DEG) analysis 10
• Weighted correlation network analysis (WGCNA) 11
• Virus induced gene silencing (VIGS) of target genes 12
• Capsicinoids and RNA extraction from pepper fruits 15
• Quantitative reverse transcription PCR of VIGS target genes 16
• RESULTS 18
• Expression profiles of capsaicinoid biosynthetic pathway related genes 18
• DEG analysis of pepper transcriptome data 21
• Correlation network analysis of pepper transcriptome data 26
• Comprehensive analysis of co-expressed DEGs in placenta and pericarp 30
• Selection of candidate genes using reported QTL&GWAS position 37
• Expression analysis of VIGS pepper plants 42
• DISCUSSION 48
• REFERENCES 52
• ABSTRACT IN KOREAN 59
• APPENDIX 61