Construction and molecular characterization of infectious clones of pepper yellow leaf curl Indonesia virus from Indonesia and Thailand

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Pepper yellow leaf curl Indonesia virus (PepYLCIV) is a bipartite begomovirus that causes significant yield reductions in chili pepper and tomato in Southeast Asia; nevertheless, experimentally confirmed assessments of biological variation among regional isolates are limited. This study involved the collection of PepYLCIV isolates from symptomatic chili pepper plants in Indonesia and Thailand, followed by the cloning and sequencing of their full-length DNA-A and DNA-B genomes. Pairwise nucleotide identity and phylogenetic analysis established that both isolates belong to PepYLCIV, however they constitute genetically different clades, signifying evident intra-species divergence. To functionally identify these variations, infectious clones of both isolates were constructed and inoculated into Nicotiana benthamiana and tomato plants using agroinoculation. In both hosts, inoculation with DNA-A alone produced no symptoms or simply minor symptoms, whereas co-inoculation with homologous DNA-B caused significant leaf curling, yellowing, and growth retardation, indicating the important role of DNA-B in systemic disease and its progression. Mixed combinations of the two PepYLCIV isolates induced severe symptoms, but pseudorecombinant combinations with heterologous begomovirus DNA-B components generated only moderate infection. Quantitative real-time PCR analysis demonstrated markedly more viral DNA accumulation for the Indonesian isolate compared to the Thai isolate in both hosts. Comparative sequence analysis indicated a distinctive 32-nucleotide insertion in the DNA-B common region of the Indonesian isolate, which was not present in the Thai isolate and had many predicted plant promoter-like cis-acting regulatory motifs. Conversely, conserved nonanucleotide sequences and similar iteron motifs were preserved between the two isolates, suggesting that variations in viral accumulation were not due to modifications in the core replication origin architecture. Pseudorecombination analysis indicated that Rep-iteron interactions were functionally permissive while quantitatively restricted. These results taken together suggested that non-coding variation within the DNA-B common region contributes to isolate-specific differences in viral accumulation and pathogenicity, offering new insights into functional diversity and pseudorecombination constraints in begomoviruses that infect pepper.

국문 초록 (Abstract)

고추잎말림황화인도네시아바이러스 (Pepper yellow leaf curl Indonesia virus; PepYLCIV) 는 동남아시아 지역의 고추와 토마토 재배에서 심각한 수량 감소를 유발하는 이분절형 베고모바이러스이다. 그러나 지역 분리주 간 생물학적 변이에 대한 실험적 비교 연구는 아직 제한적이다. 본 연구에서는 인도네시아와 태국에서 황화 및 잎말림 증상을 보이는 고추 식물로부터 PepYLCIV 분리주를 수집하고, 이들의 DNA-A 및 DNA-B 전장 유전체를 클로닝하여 염기서열을 분석하였다. 염기서열 상동성 비교와 계통분석 결과, 두 분리주는 모두 PepYLCIV로 분류되었으나, 서로 다른 유전적 클레이드를 형성하여 종 내 유의미한 유전적 분화를 보였다. 이러한 유전적 차이가 생물학적 특성에 미치는 영향을 규명하기 위해 두 분리주의 감염성 클론을 제작하여 담배 식물 및 토마토 식물에 아그로접종하였다. 두 기주 모두에서 DNA-A 단독 접종 시에는 병징이 나타나지 않거나 경미한 수준에 그친 반면, 상동 DNA-B와의 동시 접종에서는 심한 잎 말림, 황화 및 생육 저해가 유도되어, DNA-B가 전신 감염 및 병징 발현에 핵심적인 역할을 함을 확인하였다. 두 PepYLCIV 분리주 간 혼합 조합 역시 심각한 병징이 유도된 반면, 이종 베고모바이러스의 DNA-B와 조합한 이종유전자재조합(pseudorecombinant) 접종에서는 제한적인 감염만이 관찰되었다. 정량적 실시간 PCR 분석 결과, 인도네시아 분리주는 태국 분리주에 비해 두 기주 모두에서 유의하게 높은 바이러스 DNA 축적량을 보였다. 서열 비교 분석을 통해 인도네시아 분리주의 DNA-B 공통 영역 내에서 태국 분리주에는 존재하지 않는 32염기 삽입 서열이 확인되었으며, 해당 영역에는 다수의 식물 프로모터 유사 cis-조절 모티프가 예측되었다. 반면, 보존된 nonanucleotide 서열과 동일한 iteron 모티프는 두 분리주 간에 유사하게 보존되어 있어, 바이러스 축적량 차이가 복제 기점의 핵심 구조 변화에 기인한 것은 아님을 시사하였다. 이종유전자재조합 분석 결과, Rep–iteron 상호작용은 기능적으로 허용되었으나 복제 효율 측면에서는 제한적인 특성을 보였다. 종합적으로, 본 연구는 DNA-B 공통 영역 내 비암호화 서열 변이가 분리주 특이적인 바이러스 축적 및 병원성 차이에 기여함을 입증하였으며, 고추 감염 베고모바이러스에서의 기능적 다양성과 이종유전자재조합의 제약 조건에 대한 새로운 통찰을 제공한다.

목차 (Table of Contents)

• 1. INTRODUCTION 1
• 1.1. Begomovirus: a major genus in the family Geminiviridae 1
• 1.2. Pepper yellow leaf curl Indonesia virus (PepYLCIV) 4
• 1.3. Replication-associated cis-acting motifs in begomoviruses 5
• 1.4. Pseudorecombination in bipartite begomoviruses 6
• 1.5. Begomoviruses used in this study 7
• 2. MATERIALS AND METHODS 9
• 2.1. Sample collection and DNA extraction 9
• 2.2. Detection of PepYLCIV 9
• 2.3. Cloning of full-length PepYLCIV genomes 10
• 2.4. SDT analysis 12
• 2.5. Phylogenetic tree analysis 12
• 2.6. Construction of PepYLCIV infectious clones 13
• 2.7. Agroinoculation 14
• 2.8. Symptoms observation and PCR analysis 15
• 2.9. Quantification of viral accumulation 16
• 2.10. Comparative sequences analysis 17
• 3. RESULTS 26
• 3.1. Identification of PepYLCIV isolates 26
• 3.2. SDT and phylogenetic based characterization 27
• 3.3. Assessment of infectivity of PepYLCIV infectious clones 28
• 3.4. Quantification of viral DNA accumulation by qPCR 29
• 3.5. Comparative sequence analysis of PepYLCIV and other begomoviruses 31
• 4. DISCUSSION 46
• References 49
• 논문요약 55