Derivation of Exosome-Mimetic Nanovesicles (EMNs) from human induced pluripotent stem cells and exploring protective effect of EMNs on aged dermal fibroblast = 인공적으로 생성한 인간 유도만능줄기세포 유래 엑소좀 유사 미세 소낭의 피부세포 노화 억제효과 연구

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Skin aging is caused by intrinsic and extrinsic factors. Intrinsic aging is called natural aging and occurs over time, and extrinsic aging is caused by environmental factors such as sunlight, active oxygen etc. The aging skin commonly became thinner and has less elastic and collagen fibers. Human dermal fibroblast (HDF) is a major cell type of the dermis and has been used as a model cell type to investigate skin aging in vitro study. In recent research, stem cells and their secretomes have been applied to skin regeneration. Stem cells secrete numerous growth factors and cytokines, and those are transmitted by the exosomes, a kind of secreted extracellular vesicles. In previous studies, we found that induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived exosomes increased proliferation and migration of HDFs and increased collagen type I gene expression. However, the amount of exosome isolated from the human iPSC-conditioned medium (CM) was quite small, and consequently it took a long time to obtain a large amount of medium. In this study, we prepared exosome-mimetic nanovesicles (EMNs) from human iPSCs using a method of extruding cells into nano-sized particles by passing the cells several times through filters of a smaller size than the cells. The size and concentration of EMNs were measured using nanoparticle tracking analysis (NTA), then WST-8 analysis revealed that cell proliferation was increased in a dose-dependent manner by treatment with EMNs. Scratch wound and transwell assay demonstrated that EMNs promoted migration as well as proliferation of senescent HDFs. We were able to obtain more EMNs from the cells compared to naturally secreted exosomes and EMNs functioned like exosome. These studies indicate that EMNs can ameliorate skin aging and were expected to provide a technical advance toward the clinical application of EMNs in skin aging.

국문 초록 (Abstract)

피부 노화는 내인성 요인과 외인성 요인에 의해 유발된다. 내인성 노화는 흔히 자연 노화라고 불리며 시간의 흐름에 따라 일어나고, 외인성 노화는 태양에 의한 자외선, 활성산소 등에 의해 일어난다. 노화가 일어난 피부는 공통적으로 피부가 얇아지고 탄성섬유, 콜라겐섬유가 줄어든다. 피부 섬유 아세포 (human dermal fibroblasts, HDFs)는 피부 진피를 구성하는 주요세포로 in vitro에서 노화 연구에 사용된다. 최근 피부 재생과 관련하여 줄기세포와 줄기세포의 분비물질을 적용하는 연구가 많이 진행되었다. 줄기세포는 세포 성장인자와 사이토카인 등을 분비하며 이 물질들의 전달체 역할을 하는 것을 엑소좀이라고 한다. 우리는 이전 연구에서 유도만능줄기세포 유래 엑소좀이 HDF의 증식과 이동을 증가시키는 것과 I형 콜라겐 유전자 발현을 증가시킨다는 것을 확인했다. 하지만 유도만능줄기세포 배양액에서 얻어낼 수 있는 엑소좀의 양은 매우 적고 배지를 많이 얻기 위해 소모되는 시간이 오래 걸려 실험을 진행하는데 어려움이 있었다. 따라서 우리는 세포보다 작은 크기의 필터에 세포를 여러번 통과시켜 나노 크기의 입자로 압출하는 방법을 사용하여 인공적으로 엑소좀을 얻어냈다. 엑소좀 유사 미세 소낭 (exosome-mimetic nanovesicles, EMNs)의 크기와 농도는 NTA (nanoparticle tracking analysis)를 이용하여 측정하였고 WST-8 분석결과 세포 증식 및 생존력이 농도 의존적으로 증가했다. Scratch wound assay와 transwell assay로 EMN을 처리한 노화된 HDF에서 세포의 이동성이 증가한 결과를 보였고 senescence-associated-β-galactosidase (SA-β-Gal) 실험에서도 노화를 나타내는 활성이 감소한 것을 확인하였다. 이와 같은 실험 결과를 통해 자연적으로 방출된 엑소좀보다 더 많은 양의 EMN을 얻어냈고 엑소좀과 같은 기능을 하는 것을 확인했다. 이번 연구에서는 EMN이 피부 노화를 억제할 수 있음을 입증했고 나아가 임상적 적용에 이용할 수 있을 것으로 예상된다.

목차 (Table of Contents)

•  Abstract
•  Contents
•  List of figures
• 1. Introduction 1
• 2. Materials and Methods 4
• 2.1. Cell culture
• 2.2. Preparation of exosome-mimetic nanovesicles (EMNs)
• 2.3. Characterization of EMNs
• 2.4. Proliferation and migration of HDFs
• 2.5. SA-β-Gal staining
• 2.6. Statistical analysis
• 3. Results 8
• 3.1. Preparation of exosome-mimetic nanovesicles (EMNs)
• 3.2. Characterization of EMNs derived from human iPSCs
• 3.3. Comparison of extracellular vesicles manipulated by various methods
• 3.4. EMNs promoted proliferation and migration of HDFs
• 3.5. EMNs reduced expression of β-galactosidase activity of senescent HDFs
• 4. Discussion 22
• 5. Conclusions 25
• 6. References 26
• 7. Korean abstract 30