신경세포에서 PACAP 에 의한 RCAN1 의 발현과 분화 조절 기전 = Pituitary adenylate cyclase-activating peptide (PACAP) targets RCAN1 to modulate neuronal differentiation

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) 는 38개의 아미노산으로 이루어진 neuropepetide 로써 사람의 경우 ADCYAP1 유전자 염기서열로부터 전사된다. PACAP 는 뇌하수체 전엽에서 adenylate cyclase (AC) 를 자극하여 세포 내 cyclic AMP (cAMP) 양을 증가시키며 증가된 cAMP 에 의존적인 신호 전달 기전을 활성화 시키고, calcium 의 influx 를 유도함으로써 calcium 에 의존적인 신호 전달 기전을 활성화시켜 신경계의 발달과 성숙에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한, 쥐의 부신 수질의 갈색세포 종에서부터 유래된 PC12 세포주의 증식이나 생존, 분화 등 다양한 biological process 를 조절하는 것으로 알려져 있다.
Regulator of calcineurin 1 (RCAN1, DSCR1, Adapt78, MCIP1) 유전자는 calcineurin 에 의한 신호 전달 기전을 조절하는 것으로 알려져 있으며 사람의 21번 염색체에 위치하고 있어 다운증후군 환자의 뇌에서 과발현 되어 있고 정상인의 뇌와 척추, 신경 그리고 심장 등 다양한 기관에 중요하게 작용하는 것으로 알려져 있다.
본 연구에서는 RCAN1 이 PACAP 의 타겟 유전자가 될 수 있는 지와 그것의 발현을 조절하는 신호 전달 기전을 확인하고 PACAP 에 의해 변화하는 RCAN1의 발현이 어떤 기능을 나타내는지 밝히기 위해 실험을 수행하였다. PACAP 를 처리하였을 때, RCAN1.4 의 발현량이 증가하는 것을 관찰함으로써 RCAN1.4 가 PACAP 의 타켓 유전자가 될 수 있음을 확인하였고 이러한 발현 유도는 RCAN1.4 의 전사 수준의 조절을 통해 일어나는 과정임을 확인하였다. PACAP 를 처리하여 증가된 AC활성에 의한 cAMP-PKA 신호전달 기전을 통하여 전사 조절 인자로 알려진 cyclic adenosine monophosphate response element-binding protein (CREB) 의 인산화가 증가되고, 이것이 RCAN1.4 promoter 내에 존재하는 cAMP-response element (CRE) 에 결합함으로써 RCAN1.4 의 발현량이 증가되는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라, protein kinase C (PKC) 의 활성과 calcium/calmodulin-dependent protein phosphatase 로 알려진 calcineurin 의 활성을 통해서도 RCAN1.4 가 증가하는 것을 확인하였다. 또한 RCAN1.4 를 과발현시킨 세포주와 shRNA 를 이용해 RCAN1.4 의 발현을 knockdown 시킨 PC12세포주를 이용하여 실험을 수행한 결과 두 세포주 모두에서 PACAP 에 의한 신경세포 분화가 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 RCAN1.4 가 PACAP 에 의해 매개되는 신경세포 분화에 새로운 조절자로써 역할 할 수 있음을 밝혀내었다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) is a 38 amino acid neuropeptide that has been shown to stimulate cAMP formation in rat anterior pituitary cells. PACAP is an evolutionarily well conserved neuropeptide with multiple functions in nervous system. The PACAP is a trophic factor that promotes neuronal development, survival and neurite outgrowth. However, PACAP-mediated intracellular signaling pathways and transcriptional target genes are not completely elucidated.
In this study, we found that PACAP induces an increase in the expression of Regulator of calcineurin 1 (RCAN1), which is overexpressed in the brain of patients with Down syndrome (DS). The increased expression of RCAN1 in response to PACAP was mediated by cAMP-dependent PKA/CREB and calcium-dependent calcineurin signaling pathways. Moreover, we showed that altered RCAN1 expression in PC12 cells prevented PACAP-dependent neuronal differentiation. As a result, our data provide the first evidence of RCAN1 as a new regulator to control the neuritogenesis.

목차 (Table of Contents)

• 목 차
• Ⅰ. 서 론 1
• Ⅱ. 재료 및 방법 4
• 1. 재료 및 발현 벡터 4
• 2. 세포 배양 4
• 3. Plasmid 제작 5
• 1) 실험방법 5
• 2) Primer 준비 5
• 4. Western blot 6
• 5. Reporter gene assay 6
• 6. RNA 분리 및 Real-time PCR 6
• 1) RNA 분리 6
• 2) Reverse transcription 7
• 3) Primer 준비 7
• 4) Polymerase Chain Reaction 7
• 7. Electorophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) 8
• 8. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) assay 8
• 9. PC12 cell differentiation 9
• Ⅲ. 결 과 10
• 1. PACAP 는 RCAN1.4 isoform 의 발현을 증가시킨다 10
• 2. PACAP 에 의한 RCAN1.4 의 발현증가는 promoter 활성 증가를 통해 나타난다 14
• 3. PACAP 에 의한 RCAN1.4 의 발현 증가는 PKA 에 의존적으로 나타난다 17
• 4. PACAP 에 의한 RCAN1.4 의 발현 증가는 CREB 활성에 의존적으로 나타난다 20
• 5. PACAP 에 의한 RCAN1.4 의 발현증가는 calcium (Ca2+)/calcineuirn 에 의존적인 신호전달 기전을 통해 나타난다 23
• 6. PACAP 에 의한 RCAN1.4 의 발현 증가는 PKC 에 의존적으로 나타난다 29
• 7. PACAP 에 의한 RCAN1.4 의 발현 증가는 MEK/ERK 에 비의존적으로 나타난다 32
• 8. PACAP 에 의한 RCAN1.4 의 발현 증가는 RCAN1.4 promoter 내 CRE 부위에 의존적으로 나타난다 34
• 9. PACAP 에 의해 활성화된 CREB 이 in vivo, in vitro 에서 RCAN1.4 promoter 에 결합한다 40
• 10. Calcineurin 은 PACAP 에 의해 유도되는 RCAN1.4 promoter 활성을 CRE 에 의존적인 전사 수준을 조절하여 증가시킨다 43
• 11. RCAN1.4 는 PACAP 에 의한 PC12 세포 분화를 조절한다 46
• 12. RCAN1.4 의 비정상적인 발현은 ERK 활성과 synapsin-1 의 발현을 억제한다 51
• Ⅳ. 논 의 53