Improvement of scallop muscles safety through the application of calcium alginate films with controlled release mechanisms for Vibrio bacteriophage = 장염비브리오 타깃 박테리오파지의 방출 속도 조절을 위한 칼슘 알지네이트 필름의 개발 및 이를 통한 가리비 관자의 안전성 향상

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The increase in the population of antibiotic-resistant bacteria has prompted the exploration of food safety alternatives, such as bacteriophages (phages). This study aimed to develop anti-Vibrio films with controlled phage release and focused on the shelf-life extension of scallop muscles. VPy01, a newly isolated lytic phage, demonstrated a rapid bactericidal effect against V. parahaemolyticus in 1 h at a multiplicity of infection of 1. It was stable in a wide range of temperature (-18°C to 60°C), pH (4 to 11), and salinity (0% to 6%) conditions. As a genetically secure agent, VPy01 was loaded into a sodium alginate (SA, 2%, w/v) film, and glycerol was used as a plasticizer. It was then cross-linked with various calcium salts (CaCl2, CaCO3, hydroxyapatite, and CaSO4). The SA film cross-linked with CaCl2 (SA- CaCl2) efficiently released VPy01, showing remarkable vibricidal effects (>2-log CFU). The SA-CaCl2 film with well-dispersed phages improved hardness, elongation at break, and oxygen barrier ability. When applied to scallop muscles, the SA-CaCl2 film preserved the hardness and weight of scallop muscles and reduced Vibrio by 1.8-log CFU/scallop muscles. Thus, their shelf life was extended. Overall, this study highlighted the potential of VPy01-loaded calcium alginate films for the extension of scallop muscles shelf life, contributing to sustainability in the seafood industry.

국문 초록 (Abstract)

최근 식품산업에서 항생제의 과도한 사용으로 인해 항생제 내성 세균이 급증하고 있으며, 이는 심각한 문제로 대두되고 있다. 이러한 문제를 해결할 수 있는 대안으로 숙주 세균만을 특이적으로 사멸하는 천연 생물소재인 박테리오파지(이하 파지)의 활용 가능성이 주목받고 있다. 그러나 파지는 단백질 외피로 이루어져 있어 온도, pH, 염도 등 다양한 환경 요인에 취약하며, 식품 보존을 위한 항균 효과를 지속적으로 유지하는 데 한계가 있다. 또한 파지의 불완전한 방출로 인해 목표 세균에 충분히 도달하지 못하거나 일정한 농도로 유지되지 않아 항균 효과가 일시적으로만 발휘될 수 있다. 이를 극복하기 위해 파지의 안정성을 확보하고, 항균 효과를 장기적으로 지속할 수 있도록 파지 방출 속도를 조절하는 제형 개발이 필수적이다. 따라서 본 학위 논문에서는 장염비브리오를 표적으로 하는 신규 파지 VPy01의 형태학적, 생물학적 및 유전학적 특성을 분석하고, 파지의 방출 속도를 조절할 수 있는 칼슘 알지네이트 필름을 개발하여, 이를 실제식품인 가리비 관자에서 활용하는 방안을 연구하였다. 투과 전자 현미경 분석 결과, VPy01은 이십면체의 머리와 유연한 꼬리를 가진 카우도비리케테스 강(綱)에 속하는 것으로 확인되었다. 또한 VPy01는 장염비브리오 균에 대해 특이적인 항균 활성을 보였고, 넓은 온도(-18–60°C), pH (4–11), 염(0–6%) 조건에서 안정성을 보였으며, 유전체 분석 결과, 독성 및 용원성 유전자가 없어 안전한 항균제로 사용될 수 있음을 입증하였다. VPy01은 항균 제제로서 2% (w/v)의 알긴산 나트륨(SA) 필름에 함입되었으며, 20% (w/w, SA 무게 대비)의 글리세롤을 가소제로 혼합한 뒤 다양한 칼슘염(염화칼슘, 탄산칼슘, 수산화인회석, 황산칼슘)과 가교결합하여 파지 방출능을 비교하였다. 특히, 염화칼슘과 가교결합된 SA 필름(SA-CaCl₂)은 1시간 이내에 VPy01을 효과적으로 방출하며, 3시간 이내에 유의적인 장염비브리오 저해능(약 2-log CFU 감소)을 보였다(p < 0.05). 게다가, 본 파지를 포함하는 SA-CaCl₂ 필름은 가교결합 네트워크를 통하여 필름의 인장강도, 파단 연신율 및 산소 차단 능력이 유의하게 증가하였다(p < 0.05). 관자 표면에 적용된 파지 함입 SA-CaCl2 필름은 관자의 경도 및 중량 유지에 도움을 주었으며, 37℃에서 24시간 이내에 유의미한 장염비브리오 저해능(약 1.8-log CFU 감소)을 보였다(p < 0.05). 종합적으로, 본 연구는 VPy01을 함입한 칼슘 알지네이트 필름이 해산물의 품질 유지 및 저장 기간 연장에 기여할 수 있음을 시사하며, 해산물 산업의 안전성 향상에 이바지할 수 있음을 시사한다.

목차 (Table of Contents)

• I. Introduction 1
• Ⅱ. Materials and methods 4
• Ⅱ-1. Materials 4
• Ⅱ-2. Bacterial strains and growth conditions 4
• Ⅱ-3. Isolation and stock preparation of the phage 5
• Ⅱ-4. Phage characterization 6
• Ⅱ-4-1. Morphological characteristics 6
• Ⅱ-4-2. Host range and plating determination efficiency 6
• Ⅱ-4-3. Bacterial growth inhibition assay 7
• Ⅱ-4-4. Environmental stability 7
• Ⅱ-5. Phage DNA extraction 8
• Ⅱ-6. Genome sequencing and bioinformatic analysis 9
• Ⅱ-7. Preparation of phage-containing calcium alginate films 9
• Ⅱ-8. Optimal composition of calcium alginate films 10
• Ⅱ-8-1. Phage release ability of phage-loaded calcium alginate films 10
• Ⅱ-8-2. Swelling ratio 10
• Ⅱ-8-3. Water solubility 10
• Ⅱ-9. Characterization of the phage-loaded SA-CaCl2 film 11
• Ⅱ-9-1. Phage distribution within the SA-CaCl2 film 11
• Ⅱ-9-2. Mechanical properties of the phage-loaded SA-CaCl2 film 11
• Ⅱ-9-3. Oxygen barrier properties of the phage-loaded SA-CaCl2 film 12
• Ⅱ-9-4. Anti-Vibrio efficiency of the phage-loaded SA-CaCl2 film 12
• Ⅱ-10. Phage-loaded SA-CaCl2 films in the scallop muscle model 13
• Ⅱ-10-1. Anti-Vibrio efficiency of phage-loaded SA-CaCl2 film on scallop muscles 13
• Ⅱ-10-2. Weight change rates and texture properties of scallop muscles treated with various films 14
• Ⅱ-11. Statistical analysis 14
• Ⅲ. Results and discussion 15
• Ⅲ-1. Morphological analysis of VPy01 15
• Ⅲ-2. Host range determination and EOP of VPy01 17
• Ⅲ-3. Bacterial growth inhibition of VPy01 against V. parahaemolyticus 19
• Ⅲ-4. Thermal, pH, and salinity stability of the VPy01 21
• Ⅲ-5. Genome analysis of VPy01 24
• Ⅲ-6. Selection of the optimal composition of VPy01-loaded calcium alginate films 26
• Ⅲ-7. Characterization of the VPy01-loaded SA-CaCl2 film 29
• Ⅲ-8. Anti-Vibrio efficiency of VPy01-loaded SA-CaCl2 films 32
• Ⅲ-9. Efficacy of VPy01-loaded SA-CaCl2 films in enhancing the quality of scallop muscles 34
• Ⅳ. Conclusion 40
• Ⅴ. References 41
• 국문초록 51