아기장대풀의 GTP: Phosphocholine Cytidylyltransferase cDNA의 Cloning = Cloning of CTP:Phosphocholine Cytidylyltransferase cDNA from Arabidopsis thaliana

국문 초록 (Abstract)

식물에서 CTP:phosphocholine cytidylyltransferase (EC 2.7.7.15)의 구조와 기능과의 관계를 규명하기 위한 첫 단계로서, 아기장대풀(이하 애기장대) (Arabidopsis thaliana)의 cytidylyltransferase cDNA는 전체 길이가 1447 bp이고 331 개의 아미노산을 암호화할 수 있는 993 bp의 open reading frame을 포함하였다. 아미노산 서열로부터 예상된 효소의 구조는 세 개의 주요 부분으로 구성되어 있는데, N-말단 부분의 촉매 domain, 강한 친수성을 나타내는 C-말단 부분, 그리고 중간 부분의 양매성 domain 등이다. 촉매 domain은 쥐의 아미노산 서열과는 76%, 그리고 효모와는 72%의 homology를 나타내어 매우 보존성이 높은 것으로 관찰되었다. Hydropathy profile의 분석 결과, C-말단의 비촉매 부분은 친수성이 매우 강한 특징을 보이는데 이는 음전하를 가진 aspartic acid와 glutamic acid 잔기가 풍부하게 존재하는 것에 기인하는 것으로 나타났다. 촉매 domain과 C-말단 부분과의 사이에는 α-helix로 구성된 domain이 있는데, 이 부분이 활성이 있는 효소의 형태에서 막의 표면과 결합하는 것으로 믿어지고 있다. 그러나 C-말단 부위에 다수의 인산화반응 site가 존재하는 동물의 효소와는 달리 애기장대의 경우, protein kinase C에 의한 인산화반응의 site는 단 한 곳만, 그리고 Ca^2+/calmodulin protein kinase Ⅱ에 의한 인산화반응의 site는 한 곳도 발견되지 않았다. Cytidylyltransferase cDNA의 identity를 입증하기 위하여, 애기장대 cytidylyltransferase cDNA를 포함하는 발현 vector를 사용하여 효소의 활성이 결핍된 효모의 mutant를 성공적으로 형질 전환시켰다. 또한 방사능으로 표시된 phosphocholine을 효모 transformant의 효소 기질로 공급한 in vivo 실험의 분석결과, 반응 산물의 검출이 확인되어 이 cDNA가 cytidylyltransferase 임이 증명되었다. Southern 분석의 결과 애기장대에는 cytidylyltransferase 유전자가 하나의 copy 만이 관찰되었다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

As one of the first steps to elucidate the relationship between the structure and function of CTP:phosphocholine cytidylyltransferase (EC 2.7.7.15) in plants, the cytidylyltransferase cDNA of Arabidopsis thaliana was cloned and characterized. The A. thaliana cytidylyltransferase cDNA is 1447 bp long and contains an open reading frame of 993 bp coding for a protein of 331 amino acids. The deduced structure of the enzyme was composed of three main regions, the catalytic domain in the N-terminal half, the hydrophilic C-terminal region, and the amphipathic domain in the middle. The catalytic domain region was highly conserved among different organisms, showing 76 and 72% homology with the rat and yeast protein sequences, respectively. The hydropathy profile revealed that the C-terminal non-catalytic portion of the protein was very hydrophilic, highly enriched in negatively charged aspartic acid and glutamic acid residues. In the region between the catalytic domain and the C-terminal region, there was an amphipathic α-helical domain, which was believed to bind the membrane surface in the active formation. Unlike animal counterparts, there was only one potential site of phosphorylation by protein kinase C and none by Ca^2+/calmodulin protein kinase Ⅱ in the C-terminal region. The identity of cytidylyltransferase cDNA was verified by successful transformation of an yeast mutant defective in the enzyme activity, using an expression vector inserted with the A. thaliana cytidylyltransferase cDNA. This was further confirmed by in vivo analysis of the enzyme reaction product after labeling the yeast transformants with radioactive phosphocholine. Southern analysis indicated the presence of a single copy of cytidylyltransferase gene in A. thaliana.

목차 (Table of Contents)

• 1. 요약문
• 2. Summary
• 3. 서론
• 4. 실험재료 및 방법
• 5. 결과
• 6. 논의
• 7. 결론
• 8. 참고문헌
• 9. 발표논문 및 초록 첨부