재조합 균주 Escherichia coli가 생산하는 Bacillus stearothermophilus α-L-Arabinofuranosidase의 정제 및 특성 = Purification and Characterization of the α-L-Arabinofuranosidase from Escherichia coli Cells Harboring the Recombinant Plasmid pKMG11

국문 초록 (Abstract)

Bacillus stearothermophilus의 α-arabinofuranosidase 생산 유전자 (arfI)가 클로닝된 재조합 플라스미드(pKMG11)를 가지고 있는 E. coli HB101/pKMG11 균주에 의한 α-arabinofuranosidase 생산 최적 배양 조건을 조사해 본 결과, 탄소원으로 0.5% arabinose를 첨가한 LB 배지에서 약 20시간 배양했을 때 가장 높은 생산량을 보였다. 또한 상기 배양 조건에서 다량의 효소를 생산하고 생산 α-arabinofuranosidase를 ammonium sulfate 분획, DEAE-Sepharose CL-6B ion exchange column chromatography 및 Sepharose 6B-100 gel 여과 등의 과정을 거쳐 단일 단백질로 정제하였다. 정제 효소는 pH 6.5와 55℃에서 가장 높은 효소 활성을 보였고, 자연기질로는 arabinoxylan, 합성기질은 pNPAf에만 작용하는 매우 높은 기질특이성을 보이면서 pNPAf에 대한 K_m 값은 2.99 mM, V_max 값은 0.43 μ㏖e/min(319.74 μ㏖e/min/㎎)로 측정되었다. 또한 본 효소의 pI 값은 4.5 정도였으며 분자량은 SDS-polyacrylamide gel 영동법으로는 약 108 kDa, gel 여과법에 의해서는 약 289 kDa 정도로 측정됨으로써, arfI 생산 α-arabinofuranosidase는 trimer 인 것으로 확인되었으며 N-말단 아미노산 서열은 X-Ser-Thr-Ala-Pro-Arg(?)-Ala-Thr-Met-Val-Ile-Asp-X-Ala-Phe으로 결정되었다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

α-Arabinofuranosidase was produced by E. coli HB101 haboring the recombinant plasmid pKMG11 which contained the arfI gene of Bacillus stearothermophilus. The maximum production of the enzyme was observe when E. coli HB101 cells were grown at 37℃ for 20 hours in the medium containing 0.5% arabinose, 1.0% tryptone, 0.5% yeast extract, and 1% NaCl. The α-arabinofuranosidase produced was purified to homogeneity using a combination of 20∼50% ammonium sulfate precipitation, DEAE-Sepharose CL-6B ion exchange column chromatography and Sepharose 61B-100 gel filtration. The purified enzyme was most active at 55℃ and pH 6.5. The K_m and V_max values of the enzyme on ρ-nitrophenyl-α-arabinofuranoside was determined to be 2.99 mM and 0.43 μ㏖e/min (319.74 μ㏖e/min/㎎), respectively. The pI value was 4.5. The molecular weight of the native protein was estimated to be 289 kDa. The SDS-polyacrylamide gel electrophoresis analysis suggested that the functional protein was a trimer of the 108 kDa identical subunits. The N-terminal amino acid sequence of the α-arabinofuranosidase was identified as X-Ser-Thr-Ala-Pro-Arg(?)-Ala-Thr-Met-Val-Ile-Asp-X-Ala-Phe.