리포폴리사카라이드에 의해 유도되는 연골세포의 톨라이크 수용체-4 활성화에 의한 라민 A/C 발현 변화 = Lipopolysaccharide induced activation of toll-like receptor-4 in human chondrocytes modulates lamin A/C

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

ABSTRACT

Lipopolysaccharide induced activation of Toll-like receptor-4 in human chondrocytes modulates Lamin A/C.

Seung hee Ha
(Director：Prof, Jin Han)
Department of Medicine, Graduate School
Inje University

Activation of toll-like receptor-4 (TLR-4) in articular chondrocytes has been reported to increase the catabolic compartment which leads to matrix degradation. In this study, to elucidate the underlying mechanism and consequence of activation of TLR-4 in human chondrocytes, we investigated the proteomic and genomic alterations, which occurred to response of lipopolysaccharides (LPS), induced inflammation process, time-dependently.
Human chondrocytes were cultured with lipopolysaccharide during 12, 24 and 36 hour to induce activation of TLR-4. Activation of TLR-4 induced inflammatory response was confirmed with increased interleukin-1 beta (IL-1β), interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor alpha (TNF-α) by Real-time PCR. Changed expression level of proteins was identified and analyzed by using 2-DE and CAF (Chemical Association Fragment) -MALDI sequencing. Parallel, DNA microarray analysis was applied to assess genomic alteration of chondrocytes in TLR-4 activation. As a result, we identified significantly altered 26 proteins. The majority of significantly modified proteins were involved in structural constituent of cytoskeleton and oxidative stress response process. Of these proteins, expression level of Lamin A/C which is the main components of the nuclear lamina was increased after 24hr and was confirmed the remarkable increase of Lamin A/C at 36hr by Western blot analysis. DNA chip microarray analysis revealed that LPS-induced TLR-4 activation in chondrocytes significantly up-regulated 5,001 genes and down-regulated 5,216 genes, respectively. Function of ‘cell death (apoptosis)’ was prevalent in the increased genes and ‘regulation of nucleobase, nucleoside, nucleotide and nucleic acid’, ‘metabolic process’ was most prevalent in the decreased genes.
In our study, increased Lamin A/C may be considered a novel potential target protein for therapeutic intervention. We also expect that changes of apoptosis and transcription related genes might contribute to better understanding of mechanism of damage to chondrocytes by TLR-4 activation in arthritis process.

Key Words：Chondrocyte, lipopolysaccaride, toll-like receptor-4, lamin A/C

국문 초록 (Abstract)

국 문 초 록

리포폴리사카라이드에 의해 유도되는 연골세포의 톨라이크 수용체-4 활성화에 의한 라민 A/C 발현 변화
하 승 희
(지도교수：한 진)
인제대학교 일반대학원 의학과


연골세포에서 톨라이크 수용체의 활성은 기질 분해를 유발하는 이화작용의 컴파트먼트를 증가시킨다고 알려져 있다. 본 연구는 리포폴리사카라이드에 의해 유도되는 연골세포의 톨라이크 수용체-4 활성화에 의해 발현이 변화되는 단백질과 유전자의 자료 수집을 통해서 톨라이크 수용체-4의 활성과 관련있는 질병의 기전을 이해하고자 한다.
사람의 연골세포를 배양하여 리포폴리사카라이드로 12시간, 24시간, 36시간 동안 TLR-4의 활성을 유도한 후, 실시간(Real-time) PCR 방법을 이용해서 증가된 인터루킨-1베타(IL-1beta), 인터루킨-6(IL-6), 종양괴사인자-알파(TNF-alpha)로 TLR-4가 활성화되어 나타나는 염증반응을 확인하였다. 그리고 이차원 전기영동, MALDI-TOF를 이용한 단백질 팹티드 질량 지문(Peptide Mass Fingerprinting, PMF) 동정, 웨스턴 블롯 방법을 이용하여 단백질의 발현 변화를 확인하였다. 같은 실험조건으로 리포폴리사카라이드를 처리한 연골세포로 microarray 방법을 이용하여 유전자 분석으로 변화된 유전자를 확인하였다.
이차원 전기영동 분석결과 12, 24, 36 시간 동안 26개의 변화된 단백질이 동정되었다. 유의하게 변화된 단백질들의 대부분은 세포 골격의 구조적 구성 성분과 산화적 스트레스 반응에 포함되어 있었다. 이 중 핵 라미나(lamina)의 주요 구성 성분인 라민 A/C는 24시간 이후에 발현이 증가되어 있었고, 웨스턴 블롯으로 확인한 결과 36시간에서 현저하게 증가되어 있었다. 또한 microarray 결과로 5,001개 유전자가 증가되었고, 5,216개 유전자가 감소되었음을 확인하였다. 증가된 유전자들은 ‘세포사(apoptosis)’의 기능을 담당하는 유전자가 많았고, 감소된 유전자들은 ‘regulation of nucleobase, nucleoside, nucleotide and nucleic acid’의 기능을 담당하는 유전자가 많았다.
본 연구에서 증가된 라민 A/C는 치료적 중재를 위한 새로운 잠재적 표적 물질의 가능성을 가진 단백질로 고려된다. 그리고 세포사멸 및 전사에 관련된 유전자군의 변화는 골관절염 진행시 TLR-4 활성에 의한 연골세포의 손상기전 이해를 도울 것으로 기대된다.

Key Words：연골세포, 리포폴리사카라이드, 톨라이크 수용체-4, 라민 A/C

목차 (Table of Contents)

• 목 차
• 국 문 초 록
• 영 문 초 록
• Ⅰ. 서 론 1
• Ⅱ. 연구목적 3
• Ⅲ. 재료 및 방법 4
• Ⅳ. 연구결과 14
• Ⅴ. 고 찰 46
• Ⅵ. 결 론 49
• 참고문헌 50
• 감사의 글 56