Preparation and Characterization of Protein Nanofibers Containing Silver Nanoparticles

국문 초록 (Abstract)

오랜 기간 동안 사용되어 온 대표적인 기능성 금속 중 하나인 은(Ag)은 금속중에서 금(Au) 다음으로 전성과 연성이 큰 성질을 가지고 있으며, 공기나 물에 쉽게 산화되지 않고 전기 및 열적 전도도가 우수할 뿐만 아니라 유기물 및 고 분자 합성에 촉매로 사용될 정도로 촉매능력이 뛰어나다. 또한 650가지 이상의 세균을 죽일 수 있는 강력한 항균성으로도 많이 알려져 있다. 때문에 은을 포함하는 화합물들은 합금, 도금, 의약, 사진, 전기전자, 섬유, 세제, 가전 등 산업 전반에 걸쳐 두루 사용되고 있으며, 최근에는 나노기술의 발전과 함께 은 나노입자 등의 나노구조체의 형태로 그 응용범위가 점차 확대되고 있는 실정이다.
은 나노입자를 제조하는 방법에는 화학적 환원, 주형, 전기화학 및 초음파 환원, 마이크로파 환원, 생화학적 합성, 조사 환원, 빛이나 광촉매 환원 등의 다양한 방법들이 알려져 있다. 그 중, 화학적 환원은 수용액이나 유기용매 하에서 은 나노입자를 제조하는데 가장 널리 사용되는 방법으로 환원제(reducing agent)로는 sodium borohydride, citric acid, ascorbic acid, hydrazine, 수소기체 등이 주로 사용된다. 환원과정에서 은 이온(Ag+)은 은 원자(Ag0)을 형성하고 이들이 모여서 은 클러스터(cluster)를 이루고 최종적으로 은 나노입자의 형태로 성장한다. 은 나노입자는 주로 수용액에 분산되어 얻어지는데, 일반적으로 은 나노입자의 직경은 수 nm에서 100 nm의 미세한 입자크기를 가진다. 제조과정에 있어 가장 중요한 것은 수용액 중 나노입자들이 응집(aggregation)이나 침전(deposition)되지 않고 어떻게 안정화된 상태로 분산시키느냐가 핵심기술이다. 즉, 제조과정에서 형성되는 나노입자들의 응집이 일어나지 않도록 안정화시켜야 한다. 이를 위하여 일반적으로 안정제(stabilizing agent)가 환원제와 함께 사용된다.
본 연구에서는 formic acid를 물과 혼합하여 다양한 조성의 산수용액 내에서 은 전구체의 환원반응에 의한 은 나노입자의 형성거동을 관찰하고 안정제로서 젤라틴(gelatin)을 사용하여 은 나노입자의 형성에 미치는 안정제의 역할을 확 인하고자 하였다. 실험에 사용한 은 전구체는 silver acetate, silver tetrafluoroborate, silver nitrate, silver phosphate 등 4가지를 사용하였으며, 용매로는 formic acid와 물의 조성을 100:0, 70:30, 50:50, 30:70, 0:100으로 변화시켜 사용하였다. 산성 용액 내에서 은 나노입자 형성거동을 확인하기 위하여 UV-vis spectrophotometer를 이용하였으며 UV-vis 흡수 스펙트럼을 통해 은 나노입자의 형성 시간, 형성된 나노입자의 크기와 양을 비교·분석하였다. 산성 용액의 조성 중 물의 함량이 많아질수록, 흡수 스펙트럼의 폭이 넓어지고 최대 흡수 피크가 장파장 영역으로 이동하며, 또한 최대 흡광도를 나타내는 시간이 점점 빨라짐을 알 수 있었다. 이러한 UV-vis 흡수 스펙트럼 거동을 종합하여 보면, 산성 용액 내에서 물의 함량이 많아 질수록 많은 양의 은 나노입자가 다양한 크기로 빠르게 형성되고 있음을 유추해 볼 수 있다. 특히 실험에 사용된 은 전구체 중에서 silver nitrate의 경우, F100 용액에 용해됨과 동시에 많은 양의 은 나노입자가 형성 되었으나 시간이 경과함에 따라 형성된 은 나노입자가 응집·침전되고 있음을 확인할 수 있었다.
그러나 산성 용액 내에 안정제인 젤라틴이 존재할 경우, UV-vis 흡수 스펙트럼은 존재하지 않을 때에 비해 폭이 좁고, 비교적 단파장 영역에서 최대 흡수피크가 관찰되었다. 또한 시간이 경과함에 따라 최대 흡광도가 점차적으로 증가 하였으며, 최대 흡수 피크의 위치도 장파장 영역대로 서서히 이동하였다. 이러한 경향은 산성 용액 중 물의 조성이 많을수록 두드러지게 발생하였다. 따라서 젤라틴이 용해된 산성 용액에서 형성된 은 나노입자는 젤라틴이 존재하지 않은 산성 용액에서 형성된 은 나노입자보다 작고 균일한 크기로 형성되었을 것이라 생각할 수 있다. 이러한 젤라틴의 안정화 효과는 나노입도분석 결과와 TEM image 상에서도 확인할 수 있었다.
최근 수많은 종류의 세균이나 바이러스에 의한 피해가 생활환경에서 빈번하게 발생하고 있어 인체에 무해하고 안정성이 뛰어난 무기계 항균물질이 각광을 받고 있으며, 그 중 특히 은에 대한 관심과 연구가 급증하고 있다. 나노기술의 급속한 발전으로 은 나노입자를 제조할 수 있는 다양한 방법이 알려지면서 은나노입자는 항균 기능을 필요로 하는 다양한 제품에 응용되고 있다. 본 연구에서 이용한 화학적 환원법을 이용하면 은 전구체가 수용액 상태에서 고분자와 결합되어 있다가 환원과정을 통해 나노입자를 형성하므로, 은 이온 및 나노입자를 균일하게 함유한 은 나노입자-나노섬유 복합 구조체를 제조하는 것이 가능하다.
실크 피브로인 (Silk fibroin)은 대표적인 섬유상 단백질의 하나로 생체적합성, 생분해성, 수분 및 산소투과성 등의 우수한 특성을 가지고 있어 생체재료로서 많은 관심과 연구의 대상이 되어왔다. 젤라틴 또한 자연계에 풍부하게 존재하는 천연 고분자로서 식품, 화장품, 의약품, 의료용구 등 다양한 분야에서 광범위하게 사용되고 있다. 오래전부터 항균작용이 우수한 것으로 알려진 은을 생체친화성이 뛰어난 천연고분자와 복합화하면 창상피복재, 인공피부, 치과용 레진, 항균 필터 등에의 적용이 가능하다. 따라서 본 연구에서는 실크 피브로인과 젤라틴에 앞서 언급한 은 화합물을 첨가하여 은을 함유한 실크 피브로인과 젤라틴 나노섬유를 제조하고, TEM, EDS, XPS를 통하여 나노섬유에 존재하는 은 나노입자의 존재를 확인하고 그 특성을 분석하였다. 또한 은 나노입자를 함유하는 실크 피브로인과 젤라틴 나노섬유의 창상피복재로서의 응용가능성을 검토하기 위하여 normal human epidermal keratinocytes (NHEK)와 normal human epidermal fibroblasts (NHEF) 세포를 배양하여 각 시료들에 부착된 세포의 수를 비교하였다. 은을 함유하지 않은 실크 피브로인 나노섬유의 경우 은이 함유된 나노섬유에 비해 월등히 많은 양의 세포가 부착되었으며, 첨가된 은 화합물의 종류에 따라 상이한 결과를 나타냄을 알 수 있었다.
실험에 사용된 은 화합물 중, silver sulfadiazine은 화상환자의 세균감염 및 창상 폐혈증 예방과 치료에 국소 항감염제로 사용되는 은 유도체이다. 따라서 본 연구에서는 slver sulfadiazine을 함유하는 실크 피브로인 나노섬유의 창상치유 효과를 동물 모델에서 평가하였다. 모델 동물로서 7주령 수컷 Sprague-Dawley (SD) rat을 사용하였으며, Biopsy punch를 이용하여 rat의 등에 지름 6mm 크기의 상처를 근막 위 부분까지 만들고, 상처 부위를 Silver sulfadiazine을 함유한 실크 피브로인 나노섬유와 시판 중인 창상피복재 Acticoat™로 처치하였다. 처치 후 14일까지 치유된 상처의 크기를 측정하고, 조직 표본을 통하여 회복된 상처의 재상피화 과정을 관찰한 결과, silver sulfadiazine 1.0 wt%를 함유한 실크 피브로인 나노섬유로 처치된 군에서 빠른 상처 치유를 보였다. 따라서 본 연구를 통하여, 항균 특성을 가지는 은 나노입자를 함유한 실크 피브로인 나노섬유가 창상피복재로서 응용가능성이 있음을 확인하였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Ag metal has considerable interest because of their good conductivity, chemical stability, and catalytic and antibacterial activities. According to the development of nanotechnology, Ag compounds have been fabricated into a range of nanostructures (for example, nanoparticles) to maximize their chemical and biological activities. Ag nanoparticles have been prepared by various methods, such as chemical reduction, electrochemical reduction, template, γ-ray or light irradiation reduction, biological synthesis, microwave reduction, etc.
In this study, Ag nanoparticles were synthesized in formic acidic solution through chemical reduction method. And the role of formic acid as reducing agent and gelatin as stabilizer in synthesis of Ag nanoparticles were investigated. Various silver compounds as Ag precursor were used, such as silver acetate, silver tetrafluoroborate, silver nitrate and silver phosphate. The formation of Ag nanoparticles was characterized by UV-vis spectrophotometer. The size distribution and dispersion of Ag nanoparticles were characterized by nanoparticle analyzer and transmission electron microscopy (TEM).
The Ag+ ions were reduced into the Ag nanoparticles by formic acid. Specially, in the silver nitrate/F100 solution, the Ag nanoparticles were immediately generated within a few minutes. UV-vis spectra analysis was confirmed the role of formic acid. As the water content increased, Ag nanoparticles were generated more, faster, and bigger. If there are no materials to prevent aggregation, Ag nanoparticles grow and further aggregates. Therefore, the syntheses of nanoparticles by chemical reduction methods are performed in the presence of stabilizers in order to prevent unwanted deposition and agglomeration of the nanoparticles.
When gelatin was added to the AgNO3/formic acid solution, the Ag nanoparticles were stabilized by gelatin, which resulted in smaller particles. Moreover, gelatin limits further aggregation of Ag nanoparticles and was effectively dispersed in solution.
Many studies have examined silver salts or silver compounds as promising materials for wound management. With respect to the antimicrobial activity, Ag salts or Ag compounds have been used for wound treatments in a variety of physical forms, such as beads, gels, films and fibers. Recently, there has been a rapid increase in the number of commercial Ag dressings on the market, such as silver nitrate, silver sulphadiazine, and nanocrystalline silver. A combination of Ag nanoparticles and polymer nanofibers can be accomplished by electrospinning polymer solutions containing Ag nanoparticles or Ag salts, which are then reduced into particles in electrospun nanofibers.
Ag+ ions, known for their broad-spectrum antimicrobial activity, were reduced into Ag nanoparticles in gelatin solution. The amount of formed Ag nanoparticles increased with increasing concentration of AgNO3 and aging time. The gelatin nanofibers containing Ag nanoparticles were prepared by elelctrospinning method. The average diameters of gelatin nanofibers were 166.52±32.72 nm, but these are decreased with containing AgNO3. The average diameters of the Ag nanoparticles in gelatin nanofibers were ranged between 13 and 25 nm, it was confirmed by TEM. In EDS analysis, the Ag element was detected in the gelatin nanofibers containing Ag nanoparticles, too.
The SF nanofibers containing various silver compounds, such as silver tetrafluoroborate, silver phosphate, silver sulfadiazine and silver acetate, were prepared by electrospinning method. The average diameters of SF nanofibers were 267nm, but these are varied depending on the type of the added silver compounds. The Ag nanoparticles in SF nanofibers were observed by TEM images, and the diameter of Ag nanoparticles was - 30nm. In EDS analysis, the Ag element was detected in all of the SF nanofibers containing 4-types silver compounds, too. Ag element in the SF nanofibers were confirmed mainly Ag nanoparticles by XPS results.
The in vitro cytotoxicity of silver compounds in SF and gelatin nanofibers on normal human keratinocytes and fibroblasts was examined. Overall, the silver compounds in SF and gelatin nanofibers were cytotoxic to both NHEK and NHEF cells. Therefore, an antimicrobial Ag-containing matrix should be designed to minimize the damage to epidermal cells.
The SF nanofibers containing silver sulfadiazine were prepared by electrospinning method, and cellular responses and wound healing were examined. The number of attached NHEK and NHEF on the SF nanofibers containing silver sulfadiazine decreased with increasing concentration of silver sulfadiazine contained, and the number of attached NHEF was lower than that of the NHEK. In animal study, the rate of wound closing was faster at the higher concentration of silver, in contrast to in vitro results. The wound healing behavior of the SF nanofibers containing 1.0 wt% silver sulfadiazine was faster than Acticoat™, commercially available wound dressing.

목차 (Table of Contents)

• Part 1. Preparation and characterization of gelatin nanofibers containing silver nanoparticles 1
• 1.1. Introduction 2
• 1.2. Materials and methods 14
• 1.2.1. Materials 14
• 1.2.2. Synthesis of Ag nanoparticles in acidic solution 14
• 1.2.3. Preparation of gelatin solution containing Ag nanoparticles 15
• 1.2.4. Preparation of gelatin nanofibers containing Ag nanoparticles 16
• 1.2.5. Cross-linking of gelatin nanofibers containing Ag nanoparticles 17
• 1.2.6. Characterization of Ag nanoparticles in acidic solutions 17
• 1.2.7. Characterization of gelatin nanofibers containing Ag nanoparticles 18
• 1.3. Results and discussion 19
• 1.3.1 The formation of Ag nanoparticles in formic acidic solution 19
• 1.3.2. Role of formic acid in the formation of Ag nanoparticles 28
• 1.3.3. UV-vis analysis of gelatin solution containing silver nitrate 30
• 1.3.4. Particles size analysis of silver nanoparticles in gelatin solution 32
• 1.3.5. Viscosity of gelatin/formic solution 44
• 1.3.6. Formation of Ag nanoparticles in gelatin solution 46
• 1.3.7. Electrospining of gelatin solution containing Ag nanoparticles 50
• 1.3.8. Cross-linking of gelatin nanofibers containing Ag nanoparticles 58
• 1.3.9. Characterization of Ag nanoparticles in gelatin nanofibers 62
• 1.4. Conclusions 65
• 1.5. References 68
• Part 2. Cellular response of silk fibroin nanofibers containing silver nanoparticles in vitro 76
• 2.1. Introduction 77
• 2.2. Materials and methods 83
• 2.2.1. Materials 83
• 2.2.2. Preparation of SF nanofibers containing Ag nanoparticles 83
• 2.2.3. Characterization of SF nanofibers containing Ag nanoparticles 84
• 2.2.4 Release characteristic of Ag compounds 85
• 2.2.5. Cells and cell culture 86
• 2.2.6. Cell attachment and spreading assays 87
• 2.2.7. Statistics and data analysis 89
• 2.3. Results and discussion 90
• 2.3.1. Characterization of SF nanofibers containing Ag nanoparticles 90
• 2.3.2. Characterization of Ag nanoparticles in SF nanofibers 94
• 2.3.3. Release characteristic of silver 100
• 2.3.4. Cytotoxic effect of Ag nanoparticles in SF nanofibers on cell adhesion and spreading 103
• 2.4. Conclusions 109
• 2.5. References 111
• Part 3. Silk fibroin nanofibers containing silver sulfadiazine for wound healing 114
• 3.1. Introduction 115
• 3.2. Materials and methods 119
• 3.2.1. Materials 119
• 3.2.2. Preparation of silk fibroin nanofibers containing silver sulfadiazine 119
• 3.2.3. Cells and cell culture 120
• 5.2.4. Cell attachment and spreading assays 121
• 3.2.5. Animals 123
• 3.2.6. Surgical procedures for wound healing test 124
• 3.2.7. Assessment of wound closure 125
• 3.2.8. Histologic and histomorphometric procedures 125
• 3.3. Results and discussion 128
• 3.3.1 Cytotoxic effect of SF nanofibers containing silver sulfadiazine on cell adhesion and spreading 128
• 3.3.2. Skin wound healing effect SF nanofibers containing silver sulfadiazine 132
• 3.3.3. Histological examination 140
• 3.4. Conclusions 145
• 3.5. References 146