Lysophosphatidic Acid 및 다양한 내인성 인자들에 의한 적혈구의 혈전 생성능에 관한 연구

국문 초록 (Abstract)

？과정에 기여할 수 있다. 한편 혈소판에서 주로 생성 및 유리되어 광범위한 생리 활성을 나타내는 것으로 알려진 lysophosphatidic acid (LPA)는 최근 적혈구에서 칼슘 증가를 유발하는 것으로 보고되었다. 세포내 칼슘 증가는 적혈구에서 PS 발현을 유도할 수 있는 원인 중 하나이므로 flow cytometry를 이용하여 LPA에 의한 적혈구의 PS 발현 정도를 측정하였다. LPA는 농도 의존적으로 PS 발현을 증가시켰으며 이 효과는 EGTA 처리로 세포내 칼슘 증가를 억제하였을 때에도 유지되었다. 이는 LPA에 의한 PS 발현은 칼슘 증가와는 무관한 현상임을 제시한다. 적혈구에서 PKC의 활성화는 칼슘 비의존적인 PS 노출을 유발할 수 있다는 보고에 근거하여 PKC 억제제들이 LPA에 의한 PS 노출에 미치는 영향을 측정하였다. LPA에 의해 유도되는 PS 노출은 PKC 억제제인 chelerythrine 및 H-7에 의해 유의적으로 억제되었다. 또한 LPA는 세포막의 비대칭성 유지에 있어서 중요한 효소인 flippase의 활성 역시 농도 의존적으로 억제하였다. Flippase에 의한 PS transport시 필수적인 ATP 양도 LPA에 의해 감소하였는데 이는 flippase 활성 억제 결과와 경향성이 잘 일치하였다. 적혈구에 PS가 노출되는 현상과 병행하여 microvesicle의 생성도 유발될 수 있는데, 이렇게 적혈구의 세포막으로부터 vesicle이 떨어져 나오는 과정은 적혈구의 모양 변화를 수반한다. 이에 LPA에 의해 적혈구에서 PS가 노출된 microvesicle도 유리되는지 측정하기에 앞서 scanning electron microscopy (SEM)로 적혈구의 모양 변화를 관찰하였다. 대조군 적혈구는 discocytic shape를 보이는 반면 LPA를 처리한 군은 농도 의존적으로 echinocytic shape 및 spherocytic shape을 보였다. 이는 LPA 처리에 의해 microvesicle이 생성되었을 가능성을 제시한다. 이에 LPA가 실제로 적막館？확인하였다. LPA를 처리한 적혈구 현탁액으로부터 분리해낸 세포 분획과 microvesicle 분획은 모두 prothrombinase 활성을 증가시켰으며, 혈장에서 thrombin 생성도 증폭시킴을 확인할 수 있었다. 적혈구의 혈관내피세포에 대한 부착 정도 역시 LPA를 처리한 적혈구 군에서 유의적으로 증가함을 관찰하였다. 다른 활성 인지질들 및 shear stress 역시 LPA와 유사한 효과를 나타내는지 확인하였다. Phosphatidic acid (PA)는 PS 노출만을 강하게 유발하였으며 lysophosphatidylcholin (LPC)는 procoagulant microvesicle 생성만을 유도하였다. 반면 platelet activating factor (PAF)와 sphingosine 1-phosphate (S1P)는 사용한 농도 범위에서는 큰 효과를 나타내지 못했다. Cone-plate viscometer system을 이용하여 분리된 적혈구 현탁액 및 전혈액에 일정한 shear stress를 가하였을 때에는 procoagulant microvesicle의 유리가 shear rate 의존적으로 유발된 반면 적혈구 자체에서의 PS 노출은 관찰되지 않았다. PS 노출과 microvesicle 생성의 상관관계를 알아보기 위해 얻어진 결과들을 plotting하였다. LPA에 의한 PS 노출과 vesicle의 생성은 유사한 경향성을 보였으나 LPA를 제외한 지질들은 두 현상 사이에 뚜렷한 상관성을 보이지 않았다. 이는 PS 노출과 microvesicle의 생성은 서로 독립적인 경로를 경유한 현상임을 시사한다. 이상의 모든 결과들은 적혈구가 생체내에서 LPA를 포함한 다양한 화학적, 물리적 자극들에 의해 procoagulant 활성을 발현함으로써 정상적인 지혈 과정이나 혈전 생성 과정에 적극적으로 관여할 수 있음을 제시한다.