알레르기 질환을 유발하는 주요 원인 알레르겐의 유전자 클로닝, 발현 및 면역학적 특성 연구

국문 초록 (Abstract)

알레르기 질환을 유발시키는 가장 중요한 실내 항원으로 집먼지 진드기를, 그리고 중요 실외 항원으로 점박이 응애를 선택하여 그들의 주요 알레르겐의 유전자를 클로닝하고 그들을 대량 발현시켜 순수 분리하여 얻고자 하였다.
먼저 실내 주요 알레르겐인 집먼지 진드기로부터 총 RNA를 분리하여 RT-PCR로 Der-f-2 유전자에 대한 cDNA를 만들었고, pET-15b 벡터에 클로닝 한 후 대장균에서 발현을 시켜 Der-f-2 단백을 순수하게 분리 정제하였다. 그리고 실외 주요 알레르겐인 점박이 응애로부터 mRNA를 분리하여 expression cDNA Library를 만들고 점박이 응애에 강한 양성 반응을 보이는 환자의 혈청을 이용하여 면역학적 탐색을 수행, 양성 반응을 보이는 클론을 찾아내었다. 이 클론을 TSM-nc2라 명하여 염기 서열을 분석하고 아미노산을 지정하는 부분만 PCR 방법을 통해 증폭한 다음, 발현벡터에 클로닝하여 대장균에서 TSM-nc2 유전자 재조합 단백질을 생산하였다. 이렇게 발현된 집먼지 진드기의 Der-f-2와 점박이 응애의 TSM-nc2 유전자 재조합 단백질을 가지고 면역학적 특성을 확인한 결과, 각각의 항원에 감작된 환자의 혈청에 강한 양성 반응을 보이는 항원 단백질임을 확인하였다.
본 연구를 통하여 순수 정제한 집먼지 진드기의 Der-f-2 유전자 재조합 단백질과 최초로 클로닝한 점박이 응애 TSM-nc2 알레르겐의 서열 및 특성에 대한 정보는 다른 알레르겐을 클로닝하고 발현, 정제하는 연구에 큰 도움이 될 수 있으며, 나아가 알레르기 질환의 진단과 백신 및 면역 치료 방법 개발에도 도움을 줄 것으로 생각된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The purpose of this study is to clone and express genes of Dermatophagoids farinae in indoor allergen and Tetranychus urticae in outdoor allergen causing allergic disease.
For D. farinae in indoor, the total RNA was isolated from D. farinae and converted to cDNA for Der-f-2 gene by RT-PCR, and then pET-15b vector had been constructed and transformed into E. coli for the expression of recombinant Der-f-2 protein. Fusion protein was purified by Ni colume. For T. urticae in outdoor allergen, mRNA was isolated from T. urticae, expression cDNA library was constructed. Immunoscreening was performed for finding positive clone against T. urticae, using the patients' serum who were strongly positive against T. urticae allergen. The clone found by immunoscreening was called TSM-nc2. TSM-nc2 was amplified by PCR, cloned into expression vector and transformed in E. coli for the expression of recombinant TSM-nc2 protein. It was convinced that these recombinant proteins of Der-f-2 and TSM-nc2 were positive antigen protein against the patients' serum which was sensitized with each antigen.
Based on the results, the information of sequence and characteristics about purified Der-f-2 recombinant protein of the D. farinae and the first cloned recombinant TSM-nc2 allergen of T. urticae can be useful to be cloning, expressing and purifying the other allergens. Further more, it would be helpful to diagnosis of allergic disease, vaccine development and methode development for immunotheraphy.

목차 (Table of Contents)

• 목차
• 목차 = i
• ABSTRACT = iv
• I. 서론 = 1
• II. 실험 재료 및 방법 = 6
• 1. 실험 동물 및 재료 = 6
• 2. 집먼지 진드기 Der-f-2 알레르겐 유전자의 클로닝과 발현 = 6
• (1) PCR primer 의 제조 = 6
• (2) 집먼지 진드기 Der-f-2 알레르겐 항원 유전자의 PCR 증폭 = 7
• (3) Der-f-2 알레르겐 항원 유전자의 클로닝 = 7
• (4) Der-f-2 재조합 알레르겐 항원의 대량 발현 및 순수 분리 정제 = 8
• 3. 점박이 응애 TSM-nc2 항원 유전자의 클로닝과 발현 연구 = 9
• (1) 점박이 응애 주요 알레르겐 항원의 탐색 = 9
• (2) cDNA library 의 제조 = 10
• (3) 점박이 응애 주요 알레르겐 항원의 면역학적 탐색 = 10
• (4) 점박이 응애 재조합 TSM-nc2 알레르겐의 발현 연구 = 12
• III. 결과 = 16
• 1. Der-f-2 유전자의 클로닝과 발현 = 16
• (1) Der-f-2 유전자의 클로닝 및 염기서열 = 16
• (2) Der-f-2 알레르겐 항원의 발현 = 16
• (3) 재조합 Der-f-2 알레르겐의 면역학적 특성 = 22
• 2. 점박이 응애 TSM-nc2 유전자의 클로닝과 발현 = 24
• (1) 점박이 응애 주요 알레르겐의 탐색 = 24
• (2) 점박이 응애 cDNA library 의 제조 = 24
• (3) 점박이 응애 주요 알레르겐의 클로닝을 위한 면역학적 탐색 = 24
• (4) 점박이 응애 재조합 TSM-nc2 알레르겐의 발현 = 28
• IV. 고찰 = 31
• V. 요약 = 38
• VI. 참고문헌 = 39