RNA Interference-Based Antiviral Strategies and Delivery Platforms Against White Spot Syndrome Virus in Penaeus vannamei|RISS 상세보기

국문 초록 (Abstract)

흰반점바이러스（White spot syndrome virus, WSSV）는 높은 전염성과 치사율로 인해 단기간 내 심각한 폐사를 유발하며, 전 세계 갑각류 양식 산업에 막대한 경제적 피해를 초래하는 대표적인 바이러스성 병원체이다. 그러나 현재까지 상업적으로 승인된 효과적인 예방 및 치료 수단은 부재하며, 실제 양식 현장에서는 SPF（Specific Pathogen-Free） 종묘의 사용과 사육 환경 관리 등 예방적 조치에 주로 의존하고 있다. 이러한 한계를 극복하기 위한 대안으로, 바이러스의 유전정보를 직접 인식하여 분해하는 새우 체내의 방어 기전인 RNA 간섭（RNA interference, RNAi）을 활용한 항바이러스 전략이 주목받고 있으며, 특히 바이러스 증식에 필수적인 유전자를 표적으로 하는 long double-stranded RNA（dsRNA）는 강력한 바이러스 억제 효과를 유도할 수 있다. 그러나 기존 연구는 대부분 감염 전 예방적 처리에 초점을 맞추어 왔으며, 이미 바이러스에 노출된 개체를 대상으로 한 치료적 적용 가능성은 충분히 검토되지 않았다. 또한 RNAi 반응의 지속성과 분자적 기작에 대한 이해 역시 아직 제한적이다. 나아가 RNAi 기술을 실제 대규모 양식 현장에 적용하기 위해서는 안정적이고 효율적인 dsRNA 전달 플랫폼의 구축이 필수적이지만, 이 역시 여전히 제한적인 수준에 머물러 있다.
이에 본 연구의 제1장과 제2장에서는 흰다리새우를 대상으로 WSSV 감염 후 RNAi 기반 항바이러스 전략의 치료 잠재성을 평가하고, 항바이러스 RNAi 반응의 기작적 특성을 분석하였다. 제1장에서는 WSSV의 ribonucleotide reductase 2 （rr2） 유전자를 표적으로 하는 long dsRNA를 감염 단계별로 처리하여 치료 효능을 평가하였다. 그 결과, WSSV 감염 후 48시간이 경과한 시점까지도 rr2 dsRNA 처리를 통해 유의미한 치료 효과를 얻을 수 있음을 확인하였다. 또한 dsRNA의 투여 용량과 초기 바이러스 감염 강도는 항바이러스 효과를 결정하는 요인으로 나타났다. 이러한 결과는 RNAi 기반 전략이 단순한 예방적 접근을 넘어, 감염 초기 단계에서 실질적인 치료 전략으로 활용될 수 있음을 시사한다.
제2장에서는 새우에서 long dsRNA에 의해 유도되는 항바이러스 RNAi 효과가 4주 이상 지속됨을 확인한 선행 결과를 바탕으로, 장기 지속성의 원인을 분석하고자 했다. 본 연구에서는 생체 내 secondary siRNA 생성 및 증폭이 RNAi의 장기 지속성에 기여할 가능성에 초점을 두었다. 식물과 선충류에서는 RNA-dependent RNA polymerase （RdRP）를 매개로 secondary siRNA 생성이 RNAi 신호 증폭의 핵심으로 알려져 있으나, 새우를 포함한 갑각류에서는 이 기작의 존재 여부가 밝혀지지 않았다. 따라서 rr2-eGFP chimeric RNA와 다양한 long dsRNA의 공동 주입（co-injection）, small RNA sequencing, luciferase reporter assay를 이용하여 새우에서 secondary siRNA 생성 및 증폭 현상의 존재 여부를 평가하였다.
rr2-eGFP chimeric RNA와 다양한 dsRNA를 새우에 공동 주입한 결과, 함께 처리된 dsRNA의 종류에 따라 항바이러스 RNAi 효과가 크게 달라지는 현상이 관찰되었다. 특히 eGFP dsRNA를 공동 처리한 경우에는 rr2-eGFP chimeric RNA에 의해 유도된 항바이러스 효과가 유지된 반면, 비관련 서열인 f1 dsRNA를 공동 처리한 경우에는 동일한 조건에서도 항바이러스 효과가 현저히 감소하였다. Small RNA sequencing 분석에서도 동일한 chimeric RNA를 사용하였음에도 불구하고, 공동 처리된 dsRNA의 종류에 따라 rr2 유래 siRNA의 생성 양상이 크게 달라지는 것이 확인되었다. eGFP dsRNA 처리군에서는 rr2 siRNA가 비교적 높은 수준으로 생성된 반면, f1 dsRNA 처리군에서는 rr2 siRNA 생성량이 감소하였다. 본 연구에서는 chimeric RNA와 dsRNA를 이용한 transitivity 기반 접근을 통해 secondary siRNA 증폭 현상을 평가하고자 하였으나, in vitro transcription 과정에서 발생할 수 있는 dsRNA 부산물의 영향으로 인해 secondary siRNA 생성 여부를 명확히 입증하는 데에는 한계가 있었다. 또한 transitivity 특성을 추가로 검증하기 위해 수행한 luciferase reporter assay에서도 secondary siRNA 증폭은 확인되지 않았다. 이러한 결과는 새우 체내에서 RdRP를 매개로 한 secondary siRNA 증폭 기작이 존재하지 않거나, 적어도 본 연구에서 설정한 실험 조건에서는 항바이러스 RNAi 반응에 지배적으로 기여하지 않았을 가능성을 시사한다.
반면, 함께 처리된 dsRNA의 서열적 특성은 siRNA 생성 효율과 항바이러스 RNAi 반응에 영향을 미치는 것으로 확인되었으며, 이러한 변화는 실제 in vivo 항바이러스 효과의 변화 양상과도 일치하였다. 따라서 새우에서 long dsRNA 기반 RNAi 반응은 단순히 표적 dsRNA의 존재 여부만으로 결정되는 것이 아니라, 동시에 존재하는 dsRNA의 조합과 서열적 특성에 의해 조절될 수 있음을 시사한다. 종합적으로, 본 연구는 새우에서 RdRP 매개 secondary siRNA 증폭 기작이 장기간 지속된 RNAi 반응의 주요 원인일 가능성은 낮으며, dsRNA 자체의 서열적 특성과 조합이 siRNA 생성 효율 및 항바이러스 효과를 결정하는 중요한 요인임을 보여준다. 이러한 결과는 RNAi 기반 항바이러스 전략을 실제로 적용하기 위해서는 개별 dsRNA의 효과뿐만 아니라, 여러 dsRNA를 함께 사용할 때 나타나는 상호작용과 방어 효과를 사전에 검증해야 함을 의미한다.
후속 장들에서는 실제 양식 현장 적용 가능성을 높이기 위한 다양한 RNA 전달 플랫폼을 개발하였다. 제3장에서는 재조합 Snakehead rhabdovirus （SHRV） 기반 RNA 전달 시스템을 구축하고, WSSV 유래 서열의 RNA를 발현하는 재조합 SHRV를 제작하였다. 기존에 개발된 WSSV VP28 단백질 발현 SHRV 역시 흰다리새우에서 WSSV 감염에 대한 방어 효과를 나타낸 바 있으나, 본 연구에서는 단백질 발현이 불가능한 frame-disrupted RNA만으로도 유의한 항바이러스 효과가 유도됨을 확인하였다. 이러한 결과는 SHRV 감염 과정에서 생성되는 RNA species가 RNAi 반응에 관여할 가능성을 시사하며, 재조합 SHRV가 항바이러스 기능을 갖는 RNA 전달 플랫폼으로 활용될 수 있음을 보여준다. 또한 chitosan-tripolyphosphate （CS-TPP） 나노입자를 이용한 경구 전달 실험에서도 WSSV 감염에 대해 보호 효과가 확인되어, 재조합 SHRV 기반 항바이러스 전략의 경구 적용 가능성을 제시하였다.
제4장에서는 dsRNA를 안정적으로 보호하고 효율적으로 전달하기 위한 Penaeus vannamei nodavirus （PvNV） 기반 virus-like particle （VLP） 전달 시스템을 구축하였다. dsRNA 적재 효율을 향상시키기 위해 dsRNA-binding domain （dsRBD）을 PvNV capsid protein에 융합하였으며, 이를 통해 dsRNA 결합 능력이 강화된 VLP를 제작하였다. dsRBD가 융합된 PvNV VLP는 wild-type PvNV VLP보다 향상된 dsRNA 결합 능력을 나타냈으며, rr2 dsRNA를 포함한 VLP는 주사 투여 시 WSSV 감염에 대해 유의한 항바이러스 효과를 유도하였다. 그러나 경구 투여 시에는 뚜렷한 보호 효과가 관찰되지 않아, 실질적인 활용을 위해서는 장관 내 흡수율 향상 및 경구 전달 효율 최적화를 위한 보완 연구가 필요하다.
제5장에서는 cell-penetrating peptide（CPP）와 BoxB-λN system을 결합하여 dsRNA의 세포 내 흡수를 촉진하기 위한 경구용 RNA 전달 플랫폼을 구축하였다. 본 연구에서는 WSSV rr2 유전자를 표적으로 하는 dsRNA에 BoxB 서열을 도입하고, CPP가 융합된 λN 단백질과 결합시켜 RNA-protein 복합체를 형성하였다. 이 복합체는 λN-BoxB 결합을 통해 rr2 dsRNA와 안정적으로 결합하고, CPP의 세포막 투과 능력을 이용하여 dsRNA의 세포 내 전달을 촉진하도록 설계되었다. 이후 해당 복합체를 CS-TPP 나노입자에 캡슐화하여 새우에 경구 투여한 결과, WSSV 감염에 대한 유의한 항바이러스 효과가 확인되었다. 따라서 본 연구는 CPP와 BoxB-λN system을 기반으로 dsRNA의 세포 내 전달 가능성을 높인 경구용 RNAi 항바이러스 플랫폼의 활용 가능성을 제시하였다.
종합적으로, 본 연구는 새우에서 RNAi 기반 항바이러스 전략의 치료 잠재성과 RNAi 효율을 조절하는 요인들을 분석하였으며, 실제 양식 현장 적용을 위한 다양한 RNA 전달 플랫폼의 가능성을 평가하였다. 특히 dsRNA의 서열적 특성이 siRNA 생성 효율과 항바이러스 RNAi 효과에 중요한 영향을 미친다는 점을 확인하였고, 재조합 바이러스, VLP, BoxB-λN 기반 전달 시스템을 통해 RNA 전달 전략의 적용 조건과 활용 가능성을 다각도로 검토하였다. 나아가 경구 투여에 적합한 RNA 전달 시스템 구축 기반을 마련함으로써, RNAi 기반 항바이러스 기술의 실용화 가능성을 확장하였다. 이러한 결과는 향후 새우 바이러스성 질병 제어를 위한 현장 적용형 RNAi 항바이러스 전략 개발에 활용될 수 있다.

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흰반점바이러스（White spot syndrome virus, WSSV）는 높은 전염성과 치사율로 인해 단기간 내 심각한 폐사를 유발하며, 전 세계 갑각류 양식 산업에 막대한 경제적 피해를 초래하는 대표적인 바이...

목차 (Table of Contents)

General introduction 1
References 8
Chapter I. Stage-dependent efficacy of long double-stranded RNA administered after white spot syndrome virus infection in shrimp 17
1. Introduction 18
2. Materials and Methods 20

General introduction 1
References 8
Chapter I. Stage-dependent efficacy of long double-stranded RNA administered after white spot syndrome virus infection in shrimp 17
1. Introduction 18
2. Materials and Methods 20
2.1. Shrimp and WSSV 20
2.2. Quantification of WSSV by qPCR 21
2.3. In vitro synthesis of dsRNA 23
2.4. Experimental design and stage-based categorization of dsRNA administration 23
2.4.1. Experiment I: Peri-infection and early post-infection intervention (0–48 hpi) 24
2.4.2. Experiment II: Early versus late post-infection treatment (24–72 hpi) 24
2.4.3. Experiment III: Dose-dependent effects during post-infection treatment 25
2.4.4. Experiment IV: Effect of viral challenge dose on post-infection dsRNA efficacy 25
2.5. Quantification of rr2 transcript levels by RT-qPCR 26
2.6. Statistical analysis 26
3. Results 27
3.1. Peri-infection intervention and early post-infection effects (0–48 hpi) 27
3.2. Early versus late post-infection therapy (24–72 hpi) 29
3.3. Dose-dependent effects of dsRNA during post-infection treatment 31
3.4. Influence of viral challenge dose on post-infection dsRNA efficacy 33
4. Discussion 35
5. References 38
Chapter II. Sequence-dependent interference among long dsRNA determines antiviral RNAi efficacy 41
1. Introduction 42
2. Materials and Methods 45
2.1. Shrimp and WSSV 45
2.2. Quantification of WSSV by qPCR 45
2.3. Construction of plasmid templates for in vitro RNA synthesis 45
2.4. Preparation of single-stranded RNA and double-stranded RNA 46
2.5. Effects of co-administration of dsRNA on antiviral responses induced by chimeric RNA 49
2.6. Evaluation of sequence-dependent effects by additional co-administered dsRNAs 50
2.7. Small RNA sequencing and siRNA profiling 51
2.8. Evaluation of antiviral efficacy of IVT-derived ssRNAs 52
2.9. Evaluation of antiviral efficacy of dsRNA, IVT-derived ssRNA, and HPLC-purified ssRNA 52
2.10. Firefly luciferase reporter assay 53
2.11. Statistical analysis 54
3. Results 55
3.1. Effects of co-injected dsRNA sequences on the antiviral efficacy of chimeric RNA 55
3.2. Sequence-dependent modulation of RNAi efficacy by additional long dsRNAs 57
3.3. Differential production of small RNAs depending on co-injected dsRNA 60
3.3.1. Length distribution and reference-specific mapping of small RNAs 60
3.3.2. Sequence-dependent variation in rr2-derived siRNA abundance 62
3.3.3. Distinct siRNA coverage patterns between ssRNA- and dsRNA-derived templates 64
3.4. Antiviral activity of IVT-derived ssRNA against WSSV 71
3.5. Differential antiviral efficacy of dsRNA, IVT-derived ssRNA, and HPLC-purified ssRNA 74
3.6. Luciferase reporter assay shows no evidence of secondary siRNA amplification 76
4. Discussion 78
5. References 84
Chapter III. Recombinant snakehead rhabdovirus-mediated RNA delivery for antiviral protection against white spot syndrome virus 87
1. Introduction 88
2. Materials and Methods 90
2.1. Shrimp and WSSV 90
2.2. Quantification of WSSV by qPCR 90
2.3. Cells 90
2.4. Generation of recombinant SHRV 91
2.4.1. Construction of frame-disrupted SHRV plasmids 91
2.4.2. Rescue and propagation of recombinant SHRVs 93
2.4.3. Concentration by ultracentrifugation and Plaque assay 95
2.5. Preparation of rSHRV formulations for oral delivery 96
2.5.1. Encapsulation of rSHRVs with chitosan nanoparticles 96
2.5.2. Characterization of CS-TPP nanoparticles 96
2.5.3. Evaluation of viral recovery and infectivity after CS-TPP encapsulation 97
2.5.4. Preparation of feed containing chitosan-encapsulated rSHRVs 97
2.6. In vivo antiviral effects of rSHRV against WSSV infection 98
2.6.1. Intramuscular injection 98
2.6.2. Oral administration of rSHRV via feed 98
2.7. In vivo Bioluminescence imaging (BLI) 100
2.8. Statistical analysis 100
3. Results 101
3.1. Generation of recombinant SHRVs 101
3.2. CS-TPP nanoparticle characterization 103
3.3. Infectivity of CS-TPP-encapsulated rSHRV-ALuc2 and quantification of unencapsulated virus 106
3.4. In vivo antiviral effects of rSHRV against WSSV infection 108
3.4.1. Intramuscular injection 108
3.4.2. Oral administration 110
3.5. in vivo BLI of rSHRV-ALuc2 oral delivery 114
4. Discussion 116
5. References 122
Chapter IV. Penaeus vannamei nodavirus-like particle (PvNV VLP)-mediated dsRNA delivery for control of white spot syndrome virus 126
1. Introduction 127
2. Materials and Methods 130
2.1. Shrimp and WSSV 130
2.2. Quantification of WSSV by qPCR 130
2.3. Confirmation of dsRNA-binding activity of dsRNA-binding domains 131
2.3.1. Construction of dsRNA-binding domain expression plasmids 131
2.3.2. Expression of dsRBD-GFP fusion proteins in E. coli 133
2.3.3. Purification of dsRBD-GFP fusion proteins and confirmation of expression 133
2.3.4. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) 134
2.4. Production of PvNV VLPs 135
2.4.1. Construction of PvNV capsid protein expression plasmids 135
2.4.2. Expression and purification of PvNV capsid proteins 136
2.4.3. Confirmation of PvNV capsid protein expression by Western blot analysis 136
2.5. rr2-targeting double-stranded RNA synthesis 137
2.6. VLP disassembly/reassembly and dsRNA encapsulation 137
2.7. Quantification and integrity analysis of dsRNA encapsulated in PvNV VLPs 138
2.8. Transmission electron microscopy (TEM) analysis 141
2.9. In vivo experiments 142
2.9.1. Intramuscular injection of dsRNA-loaded PvNV VLPs 142
2.9.2. Oral administration of dsRNA-loaded PvNV VLPs without CS-TPP encapsulation 143
2.9.3. Oral administration of PvNV VLPs with CS-TPP encapsulation 144
2.10. Statistical analysis 144
3. Results 145
3.1. Confirmation of dsRNA-binding activity of dsRNA-binding domains 145
3.2. Confirmation of PvNV capsid protein production 149
3.3. Quantification and integrity analysis of dsRNA encapsulated in PvNV VLPs 150
3.4. TEM analysis of PvNV VLPs 152
3.5. in vivo experiments 154
3.5.1. Intramuscular injection of dsRNA-loaded PvNV VLPs 154
3.5.2. Oral administration of dsRNA-loaded PvNV VLPs 158
4. Discussion 162
5. References 165
Chapter V. Development of oral dsRNA delivery systems for antiviral control of white spot syndrome virus 168
1. Introduction 169
2. Materials and Methods 172
2.1. Shrimp and virus 172
2.2. Quantification of WSSV by qPCR 172
2.3. HT115-mediated dsRNA delivery 173
2.3.1. Construction of dsRNA expression vectors 173
2.3.2. Expression of rr2 dsRNA and co-expression with PvNV CP in E. coli HT115 (DE3) 176
2.4. BoxB-λN-based RNA delivery system 177
2.4.1. Construction of BoxB-tagged rr2 dsRNA and recombinant protein expression vectors 177
2.4.2. Synthesis of BoxB-tagged rr2 dsRNA 181
2.4.3. Synthesis of rr2 dsRNA 181
2.4.4. Expression and confirmation of recombinant eGFP-fused proteins 183
2.4.5. Purification of recombinant TAT-λN-eGFP protein 183
2.4.6. Evaluation of CPP-mediated cellular uptake in Sf9 cells 184
2.4.7. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) 184
2.4.8. Preparation and characterization of RNA-protein CS-TPP nanoparticles 185
2.5. Oral administration of HT115-derived dsRNA 186
2.6. Oral administration of dsRNA using the BoxB-λN system 188
2.7. Statistical analysis 189
3. Results 190
3.1. Production and validation of rr2 dsRNA in E. coli HT115 (DE3) 190
3.2. Simultaneous production of rr2 dsRNA and PvNV capsid protein in E. coli HT115 (DE3) 192
3.3. Expression and purification of cell-penetrating peptide fused eGFP 194
3.4. Cell-penetrating peptide-mediated cellular uptake in Sf9 cells 196
3.5. Preparation of BoxB-tagged rr2 dsRNA and TAT-λN-eGFP protein 198
3.6. BoxB-dependent binding of TAT-λN-eGFP to RNA 200
3.7. Physicochemical characterization of CS-TPP nanoparticles 202
3.8. Antiviral efficacy of orally administered HT115-derived dsRNA 204
3.9. Antiviral efficacy of the BoxB-λN dsRNA delivery system 207
4. Discussion 209
5. References 213
General Conclusions 216