In vivo programming of CAR T cells via T cell-targeted lipid nanoparticles

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The emergence of CAR T cell therapy has redefined therapeutic strategies for hematologic malignancies. However, the clinical application of ex vivo–engineered CAR T cells remain limited due to manufacturing complexity, cost, and treatment delays. To address these limitations, I established a modular, non-viral platform for in vivo CAR T cell engineering based on mRNA lipid nanoparticles (mRNA-LNPs) decorated with antibody–apolipoprotein fusion proteins. These antibody constructs were engineered by fusing apolipoprotein A1 (ApoA1) to T cell-specific monoclonal antibodies, a configuration that enables each fusion protein to stably associate with LNP surfaces through spontaneous adsorption. Antibody-conjugated LNPs (Ab-LNP) encapsulating mRNA encoding enhanced green fluorescent protein (EGFP) or CD19-targeted CAR were evaluated for size, stability, and transfection efficiency. This platform achieved selective engagement of CD3⁺, CD5⁺ T cell lines. In human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), Ab-LNPs mediated efficient and specific transfections of endogenous CD4⁺ and CD8⁺ T cells, while minimizing off-target expression. Importantly, anti-CD3 LNPs maintained robust delivery capacity following freeze–thaw handling and performed consistently across multiple donors despite biological variability. Co-culture assay with NALM-6 leukemia cells demonstrated that transiently reprogrammed CAR T cells exerted potent tumor cytotoxicity after a single Ab-LNP administration. Furthermore, in vivo delivery of EGFP mRNA using anti-mouse CD3 LNPs induced strong EGFP expression in CD4⁺ and CD8⁺ T cells within lymphoid tissues, confirming effective T cell targeting under physiological conditions. Collectively, these findings position the T cell-targeted LNP platform as a scalable and clinically compatible approach for direct in vivo programming of CAR T cells. This strategy can offer a next-generation alternative to conventional ex vivo CAR T manufacturing, enabling rapid, personalized immunotherapy.

국문 초록 (Abstract)

키메릭 항원 수용체 (CAR) T 세포 치료제는 혈액암 치료의 패러다임을 변화시켰다. 하지만 환자 유래 T 세포를 체외에서 조작해야 하는 기존 ex vivo 기반 CAR T 제조 방식은 제조 복잡성, 고비용, 장기간의 제작 기간 등으로 인해 폭넓은 적용에 한계가 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 본 연구에서는 항체-아포지단백 융합 단백질을 이용해 기능화한 mRNA 지질나노입자 (mRNA LNP)를 기반으로 하는 in vivo CAR T 세포 플랫폼을 개발하였다. 이를 위해 T 세포 특이적 단클론 항체인 Foralumab (항-human CD3), 5D7 (항-human CD5), 2C11 (항-mouse CD3)에 apolipoprotein A1 (ApoA1)을 융합하여 항체-아포지단백을 제작하였다. 이 항체는 별도의 화학적 결합이나 정제 과정 없이 LNP 표면에 자발적으로 결합할 수 있다. EGFP 또는 코돈 최적화된 CD19 표적 CAR mRNA를 탑재한 Ab-LNP (antibody-conjugated LNP)는 크기, 안정성, 전사 효율 측면에서 특성화되었다. T 세포주에서 Ab-LNP는 선택적으로 결합하였고, 사람 유래 PBMC에서도 Ab-LNP를 통해 T 세포를 선택적으로 형질 도입할 수 있었다. 특히 비표적 세포군에서는 결합능 및 발현이 제한적이었다. 특히 항-CD3 LNP는 동결, 해동 과정을 거친 후에도 여러 기증자에서 안정적으로 T 세포 전사를 유지하여, 기증자 간 변이를 넘는 일관된 전달 성능을 보였다. 또한 NALM-6 백혈병 세포와 T 세포의 공동배양 실험에서, 단회 Ab-LNP 처리만으로 생성된 CAR T 세포는 강력한 항종양 세포독성을 나타냈다. 더 나아가, 항-mouse CD3 LNP를 이용한 in vivo EGFP mRNA 전달 실험에서는 림프조직 내 T 세포에서 EGFP 발현이 확인되어 생리적 환경에서의 효과적인 T 세포 표적화를 입증하였다. 종합하면, 본 연구에서 제시한 T 세포 표적 LNP 플랫폼은 직접적인 in vivo T 세포 프로그래밍을 가능하게 하는 확장성과 임상적 호환성을 갖춘 기술로, 기존 ex vivo CAR T 세포 제조를 대체할 수 있는 차세대 면역치료 전략으로서의 잠재력을 제시한다.

목차 (Table of Contents)

• 1. Introduction 1
• 2. Materials and Methods 9
• 2.1. Cells 9
• 2.2. Construction and preparation of Navigating antibody 11
• 2.3. mRNA synthesis 12
• 2.4. LNP preparation and NvAb-LNP conjugation 13
• 2.5. Flow cytometry 14
• 2.6. Cellular uptake assay 16
• 2.7. In vitro transfection of human and mouse lymphocytes 16
• 2.8. Tumor co-culture cytotoxicity assay 17
• 2.9. In vivo EGFP mRNA delivery 18
• 3. Results 20
• 3.1. Design and Construction of T CellTargeted NvAb-LNP Platform 20
• 3.2. Target-Dependent Uptake and mRNA Expression Mediated by NvAb-LNPs 23
• 3.3. NvAb-LNPs Mediate Selective Uptake and Functional mRNA Delivery to Human T Cells Within Heterogeneous PBMC Populations 27
• 3.4. Effect of Helper Lipid Composition and Fc-Receptor Blocking on Selective mRNA Delivery 31
• 3.5. CD3-targeted NvAb-LNPs retain structural integrity and functional activity after freezethaw cycling 35
• 3.6. Efficient CAR expression and functional killing capacity of T cells programmed by NvAb-LNPdelivered mRNA 37
• 3.7. Anti-mouse CD3 NvAb-LNPs enable efficient CAR expression in primary murine lymphocytes 42
• 3.8. In vivo T celltargeted delivery of EGFP mRNA using mouse CD3-NvAb LNPs 46
• 4. Discussion 50
• References 53
• 논문요약 (국문) 61