원추각막 상피세포-간질세포 IL1 system 연관 apoptosis 기전 규명을 통한 원추각막 biomarker 발굴 = Diagnostic marker discovery by identification of keraotoconic corneal epithelial-stroma IL1 system related apoptosis pathway

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

To increase our understanding of the pathogenesis of keratoconus, we invetstigate these studies
1. Data profiling of expression genes by RNA using H2O2 induced oxidative stress in vitro model
2. cornea tissue based protein expression differences between keratoconus and normal subjects using two dimensional electrophoresis (2DE) and MALDI-TOF analysis.
3. Expression Data profiling by Proteome and RNA analysis
In cell viability and apoptosis assay in H2O2 induced Cornea Epithelial and Keratocyte cell lines, we suggested that cornea epithelial are more sensitivity than the keratocyte using CCK, FACS and TUNEL assay. And we also were detected secretion of cytokines, particularly IL1 beta, in H2O2 induced Cornea Epithelial Cell line. In the cell transition and migration in cytokine treated HK cells, we detected that it was induced more cell migration and phenotypic transition effects in IL1 beta treated keratocyte cell line. And to construct expression profiling of keratoconus patients, we analyzed RNA and protein expression differences between keratoconus and normal subject using microarray and 2D-MALDI TOF. In microarray Data Profiling of Human HT-12 v3.0 Expression Beadchip, we detected 1170 signal transduction genes, 301 cell proliferation and differentiation genes and 176 apoptotic genes. And in 2D-MALDI TOF analysis, we identified 100 spots that demonstrated a significant differences between keratoconus and normal cornea with a ProtScore (>or=2). The intensity of 37 spots were markedly higher in keratoconus than normal cornea (>2 folds), and 14 spots were detected only in keratoconic cornea. Key proteins we recognized included type VI collagen alpha 2 chain, Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3, nebulin, spectrin, alpha-enolase, keratin, annexin, peroxiredoxin-6, type VI collagen alpha 2 chain precursor, carbonic anhydrase 1, keratin 3, 5, 14, 79, type I cytoskeletal 12, decorin, aldehyde dehydrogenase, dystonin, transformation/transcription domain-associated protein variant. From our study, the identified proteins corresponded to molecules belonging to Cell junction, ECM related cytoskeleton, antioxidant protein and transcription/transformation. Our findings could contribute to the knowledge for the further understanding of pathogenesis of keratoconus.

국문 초록 (Abstract)

I. 연구개발의 목적 및 필요성 : 원추각막은 청소년기 호발 안과 질환으로 각막 중심부가 점차 얇아지며 원추체 모양으로 돌출되는 비 염증성 퇴성성 질환으로 자외선, 아토피, 스트레스, 지나친 눈비빔 등으로 인한 상피세포의 장기적인 손상, 유전자 등 다양한 원인에 의한 발생이 알려져 있으나 아직 명확하게 규명되지 않고 다양한 가설만 제시되고 있어, 원추각막으로 인한 반복적인 시력 교정, 특히 심하게 진행되는 경우 각막 이식의 필요성이 있어 막대한 보건 의료 비용의 지출이 동반되고 있다. 이에 본 연구는 원추각막 환자 각막과 건강인 각막의 발현차이를 조사하여 expression database를 구축하고, 특히 chronic epithelial cell damage유도에 관여하는 인자를 발굴하여 원추각막의 병인을 명확히 함으로써 질환의 예후 예측이나 조기 진단을 위한 Biomarker 발굴을 위한 기저데이터를 구축함을 목적으로 한다.
Ⅱ. 연구개발의 내용 및 범위 : H2O2 및 cytokine 처치한 각막 상피세포주와 keratocyte 세포주로부터 세포사를 조사하고, Human 12 v3.0 expression beadchip을 이용하여 RNA expression database를 구축하고, 원추각막과 건강인 각막 조직으로부터 단백질을 분리하여 2D와 MALDI-TOF로 단백질 발현량을 조사하고 western blotting으로 확인하였다.
Ⅲ. 연구개발결과 : 각막 상피세포와 keratocyte에 H2O2 처치한 in vitro 분석 결과 각막 상피세포가 더 cell death에 민감 하였으나, cytokine을 처치한 경우 세포사는 유도되지 않았다. keratocyte 세포주에 여러 cytokine을 처치한 결과 TGF-beta2보다 IL1 beta에서 phenotypic transition과 migration이 유도되었고, Affymetrix HG-U133A array를 통한 oligonucleotide microarray profiling결과, 1170개의 signal transduction genes, 301개의 cell proliferation과 differentiation genes, 그리고 176개의 apoptotic genes가 관찰되었다. 각막 조직을 이용한 2D MALDI-TOF 분석 결과 2배이상 차이를 보인 spots가 100 spots가 관찰되었는데 Cell junction, ECM related cytoskeleton, antioxidant protein, transcription/transformation에 관여하는 type VI collagen alpha 2 chain, Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3, nebulin, spectrin, alpha-enolase, keratin, annexin, peroxiredoxin-6, type VI collagen alpha 2 chain precursor, carbonic anhydrase 1, keratin 3, 5, 14, 79, type I cytoskeletal 12, decorin, aldehyde dehydrogenase, dystonin, transformation/transcription domain-associated protein variant 등의 단백질이 관찰되었고 western blotting으로 확인하였다.
Ⅳ. 연구개발결과의 활용계획 : 이들 결과를 토대로 축적된 expression data는 원추각막 병인 네트워크 구축에 활용함으로써 원추각막의 조기 진단 및 예후 예측 등 맞춤의학을 위한 기저데이터로 적극 활용 될것이다.