짝짓기 인자를 이용한 골다공증의 새로운 바이오마커와 치료 표적 발굴 = Discovery of a novel bio-marker and therapeutic targets for osteoporosis, using a coupling factor

국문 초록 (Abstract)

I. 연구개발 목적 : 새로운 짝짓기 인자로 발굴한 Slit3의 작용을 생체 수준에서 확인하고, 대규모 골다공증 환자-대조군 연구로 바이오마커로써 가능성을 증명하며, Slit3 작용 기전을 조절할 수 있는 새로운 개념의 골다공증 치료 표적을 발굴함.
II. 주요 연구개발 내용 및 결과 요약
1. 선행연구에서 coupling factor를 발굴하기 위한 in vitro model을 확립하여, 파골세포에서 분비된 coupling factor가 조골계열세포 이동능을 촉진하는 것이 coupling phenomenon의 주기전임을 규명하였고, 추가적인 fractionated secretomics를 수행하여 Slit3를 확보함.
2. 세포 실험, 동물 모델 실험, 유전자 변형 마우스 실험을 통해서, 파골세포에서 분비 및 생산되는 Slit3가 조골세포에 의한 골형성을 유도할 뿐만 아니라 (paracrine action), 파골세포의 골흡수를 종결시키는 (autocrine action) 완벽한 coupling factor이며, 이상적인 골다공증 치료표적으로써의 역할을 검증함.
3. Slit3 내의 두 번째 leucine rich repeat domain (LRRD2)이 주로 수용체와 결합하여 활성을 유도하는 것을 규명하였음. 15kDa의 LRRD2 (132개 아미노산)가 Slit3 단백과 분자량 대비 동일한 세포학적 효과가 있음을 관찰하였고, 폐경 골다공증 동물모델에 tail vein injection을 4주 동안 시행하였을 때, 골량이 약 10% 정도 증가하였음. Slit3 단백이 167 kDa, 1523개의 아미노산으로 구성된 큰 물질이여서 약제 개발의 효율성이 떨어질 수 있으나, 작은 크기의 Slit3 LRRD2가 whole Slit3 단백과 동일한 효과를 가진다는 결과로 신약 개발의 관점에서 중요한 의미를 가짐.
4. 본 과제를 수행하면서 다양한 병태 생리를 반영하는 약 1,600여명의 임상 정보와 혈액 시료를 포함하는 골다공증 코호트를 구축하였고, 이를 바탕으로 Slit3 혈중 농도를 측정한 임상 연구와 next generation sequencing을 이용한 유전체 연구를 수행하여, Slit3의 골다공증 및 골절 예측 바이오마커 및 유전자마커로써의 유용성을 확인.
III. 연구개발결과 활용계획
1. 새로운 개념의 골다공증 치료 표적인 Slit3 추가 연구
1) 본 연구 과제를 통해 Slit3 단백의 활성 부위인 Slit3 LRRD2가 골흡수 억제 및 골형성 촉진의 이중효과가 있음을 검증하였음.
2) Slit3 LRRD2를 신약으로 개발하기 위하여 효능 및 안정성을 검증하고, 기존 약제와 차별되면 우수성을 증명하는 연구를 수행예정임.
3) 이를 바탕으로 전임상 단계로 진입하여 차세대 신약 개발의 기반을 마련하고자 함.
2. 골다공증 및 골절의 예측력을 향상 시키기 위한 바이오마커 추가 연구
1) 본 연구 과제를 통해서 짝짓기 인자를 포함한 Slit3 와 S1P, PAF 등이 골다공증 및 골절 예측을 위한 유용한 바이오마커임을 증명하였음.
2) 하지만, 골다공증 및 골다공증성 골절은 다양한 병인이 종합적으로 작용하여 발생되는 질환이므로 각각의 바이오마커의 예측력은 한계를 가질 수 밖에 없음.
3) 따라서, 각각의 바이오마커 뿐만이 아니라 이를 통합 하여 laboratory risk score를 산출하여 개개인의 개별화된 위험 평가하는 시스템을 구축하고자 함.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

We previously noted that the conditioned media (CM) from mature osteoclasts stimulated the directional migration of pre-osteoblasts. Therefore, we sought osteoclast-derived chemokines for pre-osteoblasts. By performing fractional analyses of the CM with liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry (LC-MS/MS), we identified Slit3 as a novel coupling factor that stimulates the recruitment and proliferation of osteoblasts into bone remodeling sites via activation of beta-catenin. Interestingly, Slit3 also inhibited bone resoprtion by suppressing the fusion of pre-osteoclasts in an autocrine manner. When static and dynamic histomorphometric and microcomputed tomography analyses were conducted, mice deficient in Slit3 or its receptor Robo1 showed marked osteopenic phenotypes with lower bone formation rates and higher bone resoprtion parameters. Consistently, the plasma level of bone-specific alkaline phosphatase (ALP), a bone formation marker, was decreased in Slit3-/- mice, whereas the plasma level of the C-terminal telopeptide of type I collagen (C-telopepetide), a bone resoprtion marker, was increased in these knockout mice. To investigate the possible role of Slit3 in human, targeted resequencing of SLIT1, SLIT2, SLIT3, ROBO1, ROBO2, ROBO3 and ROBO4 genes was performed in 982 individuals with extreme phenotypes and 3,895 participants in replication cohort, and plasma Slit3 concentration was measured in 346 postmenopausal women. One variant (rs10036727) in the exon of SLIT3 gene significantly associated with lumbar BMD. Higher circulating Slit3 levels were associated with a higher bone mass at all skeletal sites and higher bone formation indices, Finally, treatment of an osteopenic mouse model with a truncated recombinant Slit3 protein efficiently increased bone mass. In conclusion, the results of in vitro, animal, and human studies showed the osteoprotective role of Slit3, a clastokine, by synchronously stimulating bone formation and inhibiting bone resoprtion, implying that Slit3 is a novel therapeutic target for metabolic bone diseases.