동맥혈관 평활근세포 증식 및 혈소판 응집에 대한 오보바톨 유도체들의 억제 효과 = Inhibitory Effects of Obovatol Derivatives on Rat Aortic Smooth Muscle Cell Proliferation and Rabbit Platelet Aggregation

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Obovatol has pronounced biological activities such as muscle relaxative, anti-gastric ulcer, anti-allergic and anti-bacterial activities. The present study was undertaken to investigate the effects of JY0694 and JY0695, obovatol derivatives, on rat aortic smooth muscle cell (RASMCs) proliferation and platelet aggregation, and their possible molecular mechanisms. JY0694 and JY0695 significantly inhibited 25 ng/mL PDGF-BB-induced cell proliferation and [3H]-thymidine incorporation into DNA at concentrations of 0.5, 1 and 3 µM. In accordance with these findings, JY0694 and JY0695 revealed the blockage of the PDGF-BB-induced progression through G0/G1 to S phase of the cell cycle in synchronized cells. JY0694 inhibited cyclin-dependent kinase 2 (CDK2), cyclin E, cyclin D1, proliferating cell nuclear antigen (PCNA) expressions and retinoblastoma (Rb) protein phosphorylation. In addition, JY0694 inhibited downregulation of cyclin-dependent kinase inhibitor (CKI) p27kip1, while it did not affect CKI p21cip1. JY0695 inhibited CDK2, cyclin E, PCNA expressions and pRb phosphorylation. Moreover, JY0695 inhibited downregulation of p27kip1 expression. Pre-incubation of JY0694 inhibited PDGF-BB-stimulated phosphorylations of extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) and Akt kinase, while it had no effect on phospholipase C (PLC) γ1 phosphorylation. However, JY0695 did not show any effects on the phosphorylations of early signals such as ERK1/2, Akt and PLCγ1. In platelet, JY0694 and JY0695 concentration-dependently inhibited the washed rabbit platelet aggregation induced by collagen and arachidonic acid. In accordance with these results, JY0694 and JY0695 showed a concentration-dependent decrease in cytosolic Ca2+ mobilization and serotonin secretion, they did not inhibit arachidonic acid liberation. Furthermore, JY0694 and JY0695 inhibited arachidonic acid-mediated platelet aggregation by interfering with cyclooxygenase (COX) and lipoxygenase (LOX) activities through inhibition of arachidonic acid-mediated thromboxane A2, prostaglandin D2 and 12-HETE formations. Taken together, the present studies demonstrated that JY0694 and JY0695 have anti-platelet activities through the inhibition of COX and LOX activities. JY0694 also inhibited PDGF-BB-induced RASMCs proliferation through inhibition of ERK1/2 and Akt phosphorylations. JY0695 inhibited PDGF-BB-induced RASMCs proliferation via G0/G1 arrest in association with the upregulation of p27kip1 which resulted in the downregulation of the expression of cyclin E, CDK 2 and PCNA proteins as well as phosphorylation of Rb. JY0694 and JY0695 may be potential therapeutics for indivisuals with a high risk of thrombotic or cardiovascular diseases.

국문 초록 (Abstract)

오보바톨은 근육이완, 항위궤양, 항알러지, 항박테리아 효과가 이미 알려져있다. 본 연구에서 새로이 합성된 오보바톨 유도체 JY0694와 JY0695의 흰 쥐 동맥혈관 평활근 세포 증식과 토끼 혈소판 응집에 관련된 효과를 알아보았으며, 그 분자 수준의 작용기전을 알아보았다. JY0694와 JY0695는 25 ng/mL PDGF-BB로 유도된 혈관 평활근 세포증식과 DNA 합성을 0.5, 1, 3 ?M에서 세포독성없이 농도 의존적으로 억제하였다. 이와 일치하게 JY0694와 JY0695는 PDGF-BB로 유도된 cell cycle progression에서도 G0/G1기가 arrest되는 것을 확인할 수 있었다.
JY0694는 CDK2, cyclin E, cyclin D1과 PCNA의 발현을 억제하였으며, 또한 pRb의 인산화도 억제하였다. 그러나 CDK4의 발현을 억제하지는 못하였다. 게다가, JY0694는 cycin-dependent kinase inhibitor인 p27kip1의 downregulation을 억제하였으나, p21cip1의 downregulation은 억제하지 못하였다. 이 결과를 통하여 혈관 평활근 세포의 G0/G1기는 p27kip1의 downregulation을 억제함으로, cell cycle-related proteins의 발현을 억제하여 arrest되는 것을 알 수 있었다.
Early signal 전달체인 PDGF-R?, extracellular signal-regulated kinase (ERK) 1/2, Akt, PLC?1의 발현에 JY0694가 영향을 미치는지 알아보기 위하여 western blotting을 진행한 결과, ERK1/2, Akt 발현에 농도의존적, 시간의존적으로 억제하는 효과를 알 수 있었으며, PDGF-R?와 PLC?1의 인산화에는 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있었다. 이를 통하여, JY0694의 혈관 평활근 세포증식 억제효과는 선택적으로 ERK1/2와 Akt의 인산화를 억제함으로 나타나는 효과임을 알 수 있었다.
JY0695는 CDK2와 cyclin E의 발현을 억제하였고 또한 PCNA와 pRb의 발현을 억제하였지만, CDK4와 cyclin D1의 발현을 억제하지 못하였다. 또한 CKI인 p27kip1의 발현은 증가시켰지만, p21cip1의 발현에는 영향을 주지 않았다. JY0694가 early signal 전달체인 ERK1/2와 Akt의 발현을 억제하였던 것에 반해, JY0695는 early signal 전달체인 PDGF-R?, ERK1/2, Akt and PLC?1의 인산화에 영향을 미치지 않았다. 이 결과를 통해 JY0695는 p27kip1의 발현을 증가시켜 cell cycle-related protein의 발현을 억제하여 혈관 평활근 세포의 증식을 억제하는 것을 알 수 있었다.
다음으로 JY0694와 JY0695가 혈소판응집유도에 주는 영향에 대해서 연구하였으며, JY0694는 in vitro에서 collagen (10 ?g/mL)과 arachidonic acid (100 ?M)로 유도된 토끼 혈소판응집을 농도 의존적으로 강하게 억제하였으며, IC50 값은 13.14?0.04, 11.85?0.68 ?M이었다. U46619 (1 ?M)과 thrombin (0.05 U/mL)에서는 억제효과를 관찰할 수 없었다. JY0695도 마찬가지로, collagen (10 ?g/mL)과 arachidonic acid (100 ?M)로 유도된 토끼 혈소판응집을 농도 의존적으로 강하게 억제하였으며, IC50 값은 3.95?0.05 and 3.09?0.01 ?M이었다. 따라서 JY0694와 JY0695의 항 혈소판 작용기전을 규명하기 위하여 JY0694와 JY0695가 arachidonic acid liberation, arachidonic acid metabolites, granule secretion, calcium mobilization에 미치는 영향을 살펴보았다. JY0694와 JY0695는 arachidonic acid에 의해서 유도된 arachidonic acid metabolites (TXA2, PGD2 and 12-HETE), calcium mobilization, granule secretion에 똑같은 pattern으로 억제효과를 나타내었으며, collagen으로 유도된 arachidonic acid liberation과 DAG formation에서는 억제효과를 관찰할 수 없었다. 이로부터 JY0694와 JY0695는 cyclooxygenase와 lipoxygenase 활성을 억제하여 혈소판 응집억제에 관여하는 것으로 사료된다.
이상의 결과를 종합해보면, JY0694와 JY0695는 PDGF-BB로 유도된 흰 쥐 동맥혈관 평활근 세포의 증식을 강하게 억제하였으며, JY0694는 ERK1/2와 Akt의 인산화 억제하고, cyclin-dependent kinase inhibitor인 p27kip1의 발현을 upregulation하여, retinoblastoma protein 인산화와 CDK2, cyclin E, cycin D1 and PCNA의 발현을 억제하여 G0/G1기 arrest를 통해 이루어진 것임을 알 수 있었다. JY0695는 cyclin-dependent kinase inhibitor p27kip1의 발현을 upregulation하여, retinoblastoma protein 인산화와 CDK2, cyclin E and PCNA의 발현을 억제하여 G0/G1기 arrest를 통해 이루어진 것임을 알 수 있었다. 뿐만 아니라 JY0694와 JY0695는 우수한 항 혈소판 활성을 나타냄을 알 수 있었으며 그 작용기전은 cyclooxygenase와 lipoxygenase 활성억제를 통해 나타남을 알 수 있었다. 따라서 JY0694와 JY0695는 심혈관질환의 예방 및 치료에 크게 기여할 것으로 사료된다.

목차 (Table of Contents)

• I. INTRODUCTION 1
• 1. Role of vascular smooth muscle cell proliferation in vascular diseases 1
• 2. Role of platelet activation in thrombus formation 9
• 3. Biological activities of obovatol and its derivatives 15
• 4. Purpose of this study 19
• II. EFFECTS OF JY0694 AND JY0695 ON RAT AORTIC SMOOTH MUSCLE CELL PROLIFERATION 20
• 1. Introduction 20
• 2. Materials and methods 22
• 2-1. Materials and reagents 22
• 2-2. Synthesis of JY0694 and JY0695 22
• 2-3. Cell culture 23
• 2-4. Cell proliferation assay 24
• 2-5. DNA synthesis assay 24
• 2-6. Cell cycle progression analysis 25
• 2-7. Immunoblotting assay 26
• 2-8. Statistical analysis 27
• 3. Results 28
• 3-1. Effects of JY0694 and JY0695 on RASMCs proliferation 28
• 3-2. Effects of JY0694 and JY0695 on DNA synthesis in RASMCs 32
• 3-3. Effect of JY0694 on cell cycle progression 35
• 3-4. Effect of JY0694 on cyclin D1, cyclin E, CDK2 and CDK4 expression 37
• 3-5. Effect of JY0694 on pRb phosphorylation and PCNA expression 37
• 3-6. Effect of JY0694 on PDGF-Rβ, ERK1/2, Akt and PLCγ1 phosphorylationγ1 44
• 3-7. Effect of JY0694 on p21cip1 and p27kip1 expression 51
• 3-8. Effect of JY0695 on cell cycle progression 54
• 3-9. Effect of JY0695 on cyclin D1, cyclin E, CDK2 and CDK4 expression 56
• 3-10. Effect of JY0695 on pRb phosphorylation and PCNA expression 56
• 3-11. Effect of JY0695 on PDGF-Rβ, ERK1/2, Akt and PLCγ1 phosphorylation 62
• 3-12. Effect of JY0695 on p21cip1 and p27kip1 expression 65
• 4. Discussion 68
• III. ANTIPLATELET ACTIVITIES OF JY0694 AND JY0695 74
• 1. Introduction 74
• 2. Materials and methods 76
• 2-1. Materials and reagents 76
• 2-2. Aniamls 76
• 2-3. Washed rabbit platelet preparation and platelet aggregation assay 77
• 2-4. Serotonin secretion assay 77
• 2-5. Cytosolic calcium mobilization assay 78
• 2-6. Arachidonic acid liberation assay 79
• 2-7. Arachidonic acid metabolites assay 80
• 2-8. Statistical analysis 80
• 3. Results 81
• 3-1. Effect of JY0694 on washed platelet aggregation in vitro 81
• 3-2. Effect of JY0694 on serotonin secretion 81
• 3-3. Effect of JY0694 on cytosolic calcium mobilization 84
• 3-4. Effect of JY0694 on arachidonic acid liberation 84
• 3-5. Effect of JY0694 on conversion of arachidonic acid into TXB2, PGD2 and 12-HETE 87
• 3-6. Effect of JY0695 on washed platelet aggregation in vitro 89
• 3-7. Effect of JY0695 on serotonin secretion 89
• 3-8. Effect of JY0695 on cytosolic calcium mobilization 92
• 3-9. Effect of JY0695 on arachidonic acid liberation 92
• 3-10. Effect of JY0695 on conversion of arachidonic acid into TXB2, PGD2 and 12-HETE 95
• 4. Discussion 97
• IV. REFERENCES 101
• SUMMARY IN KOREAN 115