Attacin and T4 lysozyme transgenic 'Galaxy' apple : regulation of transgene expression and plant resistance to fire blight (Erwinia amylovora)

국문 초록 (Abstract)

이 연구의 주목적은 Agrobacterium-mediated transformation을 이용한 'Galaxy'품종의 화상병(Erwinia amylovora)에 대한 내병성 증진이었다. 'Galaxy' 에 저항성 형질을 증진위기 위하여 Hyalophora cecropia의 attacin E (attE) gene과 T4 bacteriophage 의 T4 lysozyme (T4L) gene을 이용하여 5binary vectors (p35SAtt, P35AMVAtt,p35SAMVSPAtt,pPin2Att35SAMVT4와 p35SAMVT4) 를 만들었다. 모든 형질 전환된 조직체에서는 attE, T4L, 또는 둘 모두의 gene 을 polymerase Chain Reaction (PCR)을 통해 확인 할 수 있었으며, 증가된 neomycin phosphotransferase Ⅱ (NPTⅡ)량을 double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assays를 이용하여 관찰할 수 있었다. 형질 전환된 'Galaxy'와 M.26를 이용하여 감자의 protein inhibitor ll (pin2) promoter,Alfalfa Mosaic Virus의 untranslated leader sequence RNA 4 (AMV), 그리고 담배에서의 pathogenesis-related protein의 signal peptide sequence (sp)의 attE gene expression 과 E. amtlovora에 대한 저항성 영향에 대한 조사를 하였다.
조직 배양 된 transgenic shoots이나 seedling 크기의 식물체에서 pin2 promoter에 의해 control 된 attE gene은 constitutive expression을 또한 상처에 의한 attE gene expression 의 증가를 각 각 관찰 할 수 있었다. AMV는 attacin량을 증가시켰으며, Northen blot을 통해 그 증가는 AMV의 translation에 의한 것으로 확인되었다. 그러나 AMV와 SP 모두에 의해 control된 attE transgenic line은 SP에 의해 control되지 않은 attE transgenic line에 의해 control 된 attE transgenic line은 SP에 의해 control되지 않은 attE transgenic line에 비해 attacin량이 현저히 낮았다. H. cecropia hemolymph의 attacin을 이용한 In vitro degradation assay를 한 결과, 'Galaxy' Intercellular fluid에 의한 attacin degradation 을 확인할 수 있었다. 하지만 SP에 의해 control된 attE transgenic lines 이 SP에 control되지 않은 attE transgenic lines 보다 오히려 E.amylovora 에 대o해 더 높은 저항성을 보였다.이결과로 볼 때 사과에서 intercellularly secreted attacin이 intracellularly localized attacin 보다 효율적으로 E. amylovora infection을 감소시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
Transgenic 'Galaxy'에서는 Wsetern blot 과 Northern blot을 이용하였으나 T4L protein과 T4L mRNA를 각각 확인할 수 없었으나 reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR)을 이용하여 T4L mRNA의 존재를 확인 할 수 있었다. 이 결과로 볼 때 T4L gene transcription level이 사과에서 현저히 낮다고 추측된다. attE와 T4L gene을 모두 가지 있는 transgenic lines에서 attacin과 T4L의 symergistic effect을 확인할 수 없었다. 하지만 attacin level과 병저항성 정도사이에서 높은 negative correlation을 보였으며 몇몇 T4L transgenic lines의 현저한 병저항성 확인은 화상병control에 대한 사과내병성품종개발을 위한 attacin과 T4L의 이용 가능성을 보여주었다.