Crosstalk between glutathione peroxidase-1 gene and protein kinase Cδ gene in the methamphetamine-induced dopaminergic neurotoxicity = 메탐페타민에 의한 도파민성 신경독성에서 glutathione peroxidase-1 유전자와 protein kinase Cδ 유전자의 상호작용

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Escalating evidences suggest that oxidative stress is involved in methamphetamine (MA)-induced neurotoxicity, and that peroxides including H2O2 play a crucial role in this toxicity. Enzymatic antioxidants, such as catalase, and glutathione peroxidase (GPx), provide a first line of defense against H2O2. A selenium-dependent GPx (GPx-1) out of GPx isozymes is considered as a major H2O2 scavenger in the brain.
In the present study, it was asked whether GPx-1 gene affects MA-induced dopaminergic neurotoxicity, and whether protein kinase C (PKC) affects this toxicity, since it was suggested that PKC might contribute to dopaminergic toxicity. Treatment with MA (8.0 mg/kg, i.p. x 4) resulted in the decrease in striatal GPx-1-like immunoreactivity in the GPx-1 (+/+) mice. MA treatment produced hyperthermia, dopaminergic toxicity [as measured by dopamine turnover rate, tyrosine hydroxylase (TH) activity, TH-like immunoreactivity and TH phosphorylation at serine residue 31, 40], oxidative stress [as measured by protein carbonyl and lipid peroxidation], neuroinflammation [as measured by cyclooxygenase-2 (COX-2)-, interleukin-6 (IL-6)-, tumor necrosis factor-α (TNF-α)-, and interferon-γ (IFN-γ)-like immunoreactivity], microgliosis [as labeled by F4/80- or ionized calcium-binding adaptor molecule-1 (Iba-1)-like immunoreactivity], and reduction of neurotrophic factors [as measured by brain-derived neurotrophic factor (BDNF)- and glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF)-like immunoreactivity]. Intrastriatal microinjection with chelerythrine (a pan-inhibitor of PKC) or rottlerin (an inhibitor of PKCδ), but not with Go6976 (a co-inhibitor of PKCα and PKCβ), hispidine (an inhibitor of PKCβ) or PKCζ pseudosubstrate (an inhibitor of PKCζ), attenuated MA-induced hyperthermia and behavioral impairments (as measured by locomotor activity and rota-rod performance). Consistently, treatment with MA significantly increased striatal expressions of PKCδ and cleaved PKCδ, whereas there was no significant change in the expressions of other PKC isozymes. These findings were more pronounced in GPx1 (-/-) mice than GPx1 (+/+) mice. Intrastriatal microinjection with chelerythrine or rottlerin significantly attenuated MA-induced increases in the PKCδ and cleaved PKCδ.
As shown in case of chelerythrine or rottlerin, GPx-mimics, such as ebselen and acetylsalicylic acid maltol ester (AME), significantly attenuated MA-induced hyperthermia, behavioural impairments, dopaminergic toxicity, oxidative stress, neuroinflammation, microgliosis, increased striatal expressions of PKCδ and cleaved PKCδ, and decreased expressions of neurotrophic factors. In addition, treatment with ebselen, AME or rottlerin significantly prevented MA-induced decreases in mouse double minute (MDM)-2 phosphorylation as well as increases in p53 expression in the striatum of the mice. The protective effects of ebselen, AME or rottlerin were less pronounced in GPx-1 (-/-) mice than GPx-1 (+/+) mice. GPx-1-like immunoreactivity was restored by intrastriatal GPx-1 gene transfection with GPx1 gene-encoded adenovirus vector in GPx1 (-/-) mice. Intrastriatal GPx-1-transfected GPx1 (-/-) mice were less susceptible to MA-induced hyperthermia, behavioural impairment, decrease in TH-like immunoreactivity, and increase in PKCδ expression as compared with those of control vector-transfected GPx1 (-/-) mice.
In addition, MA-induced hyperthermia, behavioural impairment, increase in dopamine turnover rate, decrease in GPx-1 expression were less pronounced in PKCδ (-/-) mice than PKCδ (+/+) mice.
The results suggest that GPx1 gene is an essential factor for blocking MA-induced dopaminergic toxicity, and that PKCδ gene is involved in this pathogenesis. GPx-mimic compounds attenuate MA neurotoxicity via inhibiting PKCδ expression, oxidative stress, and neuroinflammation.

국문 초록 (Abstract)

지금까지의 많은 연구결과들이 oxidative stress가 메탐페타민 (MA)에 의한 신경독성에 관여함을 제시하고 있으며, 특히 H2O2를 비롯한 과산화물이 결정적인 작용을 수행함. Catalase 혹은 glutathione peroxidase (GPx)와 같은 항산화 효소들이 H2O2를 일차적으로 소거하는데, 그 중에서도 셀레늄 의존형 GPx (GPx-1)가 중추신경계의 가장 주요한 H2O2 소거 효소 중 하나임.
이번 연구에서는 GPx-1 유전자가 MA에 의한 도파민성 신경독성에 어떠한 역할을 수행하는지 규명하였으며, protein kinase C (PKC)가 도파민성 신경독성 과정에 관여한다는 보고가 있었기 때문에, MA에 의한 독성에서 PKC 유전자의 역할에 대한 연구도 이루어졌음. MA (8.0 mg/kg, i.p. x 4)를 투여한 GPx-1 (+/+) 생쥐의 선조체에서 GPx-1 면역활성의 감소가 관찰되었음. MA 투여는 고체온증, 도파민성 독성 [도파민 회전율의 증가, tyrosine hydroxylase (TH)의 활성 및 발현, TH serine 31번 및 40번 잔기의 인산화의 감소], oxidative stress (단백질 산화와 지질과산화의 증가), 신경염증성 반응 (cyclooxygenase-2, interleukin-6, interferon-γ, tumor necrosis factor-α의 변화), 소교세포 활성화 (F4/80- 혹은 ionized calcium-binding adaptor molecule-1-면역활성의 증가) 및 신경성장 인자의 감소 (brain-derived neurotrophic factor- 및 glial cell line-derived neurotrophic factor-면역활성의 감소)를 유도하였음. Chelerythrine (PKC 억제제) 혹은 rottlerin (PKCδ 억제제)의 선조체 내 투여는 MA에 의한 고체온증과 행동이상 (자발운동량의 감소 및 rota-rod test에서의 수행능력 저하)을 유의하게 감소시킨 반면, Go6976 (PKCα와 PKCβ의 동시 억제제), hispidine (PKCβ 억제제), 혹은 PKCζ pseudosubstrate (PKCζ 억제제)의 투여는 유의한 효과를 나타내지 않았음. 이와 마찬가지로, MA 투여 후에 선조체에서 PKCδ 및 cleaved PKCδ의 발현은 유의하게 증가하였으나, 다른 PKC isozyme들의 발현은 유의하게 변화하지 않았음. 그런데, 이러한 경향이 GPx-1 (+/+) 생쥐에 비하여 GPx-1 (-/-) 생쥐에서 더욱 현저하였음. 또한, Chelerythrine 혹은 rottlerin의 투여는 MA에 의해서 증가된 PKCδ 및 cleaved PKCδ의 발현을 유의하게 억제하였음.
본 연구에서 ebselen 혹은 acetylcalicylic acid maltol ester (AME)와 같은 GPx 유사 작용제의 투여가 MA로 인해 유도된 고체온증, 행동이상, 도파민성 독성, oxidative stress, 신경염증, 소교세포 활성화, PKCδ 및 cleaved PKCδ의 발현 증가 및 신경성장인자의 발현 감소를 유의하게 억제하였음. 더불어 ebselen, AME 혹은 rottlerin의 투여는 MA에 의해서 선조체에서 나타나는 mouse double minute (MDM)-2 인산화의 감소와 p53 발현의 증가를 유의하게 억제하였음. 이러한 ebselen, AME 혹은 rottlerin의 보호효과는 GPx-1 (+/+) 생쥐에서 GPx-1 (-/-) 생쥐에 비하여 더욱 현저하였음. GPx-1 (-/-) 생쥐에 GPx-1 gene-encoded adenovirus vector를 이용하여 GPx-1 유전자를 선조체 내에 주입한 결과, GPx-1 유전자의 발현이 유의하게 증가하였는데, control vector가 주입된 GPx-1 (-/-) 생쥐에 비하여 GPx-1 유전자가 주입된 GPx-1 (-/-) 생쥐에서 MA에 의한 고체온증, 행동이상, 도파민성 신경독성 및 PKCδ의 발현 증가가 유의하게 억제되었음.
또한, MA에 의한 고체온증, 행동이상, 도파민 회전율의 증가와 선조체에서의 GPx-1 발현의 감소가 PKCδ (-/-) 생쥐에서 PKCδ (+/+) 생쥐에 비하여 유의하게 억제되었음.
이상의 결과는 GPx-1 유전자가 MA에 의한 도파민성 신경독성을 억제하는 중요한 인자임과 동시에 PKCδ 유전자가 MA에 의한 신경독성의 발현과정에 관여함을 제시함. GPx-1 유사 작용제는 PKCδ 발현, oxidative stress 및 신경염증을 억제함으로써 MA에 의한 신경독성을 억제하였음

목차 (Table of Contents)

• I. Introduction = 1
• II. Materials and methods = 6
• III. Results = 20
• IV. Discussion = 59
• V. References = 67