Lactobacillus casei YIT 9018로 부터 정제한 Cell Wall Skeleton과 Whole Peptidoglycan의 In Vitro 항종양활성 = In Vitro Antitumor Activity of Cell Skeleton and Whole Peptidoglycan Purified from Lactobacillus casei YIT 9018

국문 초록 (Abstract)

본연구는 clonogenic assay에 의해 그람양성이며 비병원성 미생물인 Lactobacillus, casei YIT 9018(LC 9018)의 인체유래 종양세포 15주와 mouse 유래 종양세포 3주에 대한 항종양활성의 연구를 위해 수행하였다. in vitro 모델을 통하여 LC 9018의 배양여액과 균체, 유기 용매 추출물질과 추출후 잔사 및 균체로 부터 분리·정제한 cell wall skeleton(CWS)와 whole peptidoglycan(WPG)의 항종양활성을 측정하였으며 그 결과는 다음과 같다.
1. LC 9018을 37℃에서 Rogosa SL 배지에 배양하였을때 배양 3일째 pH가 4.2, 균의 탁도는 1.532를 나타냈다.
2. LC 9018의 배양여 액은 항종양활성이 나타나지 않았으나 가열 살균한 균체는 농도가 100 ㎍/㎖ 일때 CALU-3, SKMES-1, RAJI, FARROW, A-427, 3LL 및 S-180에 항종양활성를 나타내었다.
3. LC 9018 균체의 유기 용매 추출물은 항종양활성을 나타나지 않았으나 추출후 잔사는 그 활성이 계속 나타냈다.
4. 균체 5 g에 계면활성제와 초음파 처리를 한후 단백질 분해효소와 핵산 분해효소의 작용으로 CWS 1.07 g을 얻었고, 균체 10 g에 계면활성제를 처리후 초음파처리 없이 단백질 분해효소와 핵산 분해효소를 작용시켜 WPG 0.35 g를 얻었다.
5. CWS의 항종양활성은 인체유래 종양세포 6주와 mouse 유래 종양세포 3주에서 항종양활성이 나타난 반면, WPG는 인체유래 종양세포 5주와 mouse 유래 종양세포 3주에서만 항종양활성이 나타났다.
6. CWS의 함종양활성 최소 농도는 인체유래 종양세포(SF-188, SKMES-1, A-427, FARROW, RAJI 및 HEP-2)에서 각각 400, 800, 300, 700, 900 및 1,000 ㎍/㎖로 나타났으며, mouse 유래 종양세포(P388, S-180 및 3LL)에서는 900, 1,000 및 50 ㎍/㎖로 각각 나타났다.
7. WPG의 항종양활성 최소 농도는 인체유래 종양세포(SF-188, SKMES-1, A-427, FARROW 및 RAJI)에서 400, 1,000, 300, 800 및 900 ㎍/㎖로 나타났으며, mouse 유래 종양세포(P388, S-180 및 3LL)에서는 1,000, 500 및 200 ㎍/㎖로 각각 나타났다.
8. 균체, CWS 및 WPG를 투과전자 현미경으로 관찰한 결과 whole cells에 비교해 CWS의 외부형태는 세포가 팽창되고 파손되었으며 내부형태는 세포 내용물이 대부분 제거는 된 반면에 세포벽이 파손되었다. 그러나 WPG의 외부형태는 세포는 팽창되었으나 파손은 일어나지 않았으며 세포 내용물은 조금 제거되었으나 세포벽은 원래의 형태를 유지하였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

This study was carried out to investigate the antitumor activity of Lactobacillus caesi YIT 9018(LC 9018) which is gram positive and nonpathogenic organism, against fifteen human tumor cell lines and three mouse tumor cell lines by clonogenic assay. The antitumor activity of LC 9018 by using in vitro tumor model was examined from cultured broth and mycelium, supernatant and precipitate being extracted from mycelium, and cell wall skeleton(CWS) and whole peptidoglycan(WPG) which are isolated and purified from mycelium. The results are as follows ;
1. When the LC 9018 was cultured in Rogosa SL medium at 37℃, showed pH and mycelium turbidity increased up to 3 days.
2. The cultured broth of LC 9018 didn't showed the antitumor activity. But the mycelium of heat-killed LC 9018(100 ㎍/㎖) was showed strong antitumor acticity against CALU-3, SKMES-1, RAJI, FARROW, A-427, 3LL and S-180.
3. The extracted precipitate showed antitumor activity but the extracted supernatant did not.
4. CWS was obtained as 1.07 g by reacting the washed mycelium 5 g with DNase, RNase and Pronase P following the treatment of detergent and ultrasonic oscillation. And WPG was obtained 0.35 as g from washed mycelium 10 g at the same method except for the treatment of ultrasonic oscillation.
5. The antitumor activity of CWS was showed against six human tumor cell lines and three mouse tumor cell lines. WPG had antitumor activity against five human tumor cell lines and three mouse tumor cell lines.
6. Minimum concentration of CWS for antitumor activity was observed as concentration of 400, 800, 300, 700, 900, 1,000 ㎍/㎖ in human tumor cell lines such as SF-188, SKMES-1, A-427, HEP-2, FARROW and RAJI, concentration of 900, 500, 50 ㎍/㎖ in mouse tumor cell lines such as P338, S-180, 3LL, respectively.
7. Minimum concentration of WPG for antitumor activity was observed as concentration of 400, 1,000, 300, 800, 900 ㎍/㎖ in human tumor cell lines such as SF-188, SKMES-1, A-427, FARROW and RAJI, concentration of 1,000, 500, 200 ㎍/㎖ in mouse tumor cell lines such as P338, S-180, 3LL, respectively.
8. According to observation with transmission electro microphotoscopy, when compared with whole cells the cell wall of CWS was broken and cell components of it were mostly removed, but the cell wall of WPG had the normal form of whole cells and cell components of it were a little removed.

목차 (Table of Contents)

• 목차 = ⅰ
• ABSTRACT = ⅲ
• Ⅰ. 서론 = 1
• Ⅱ. 재료 및 방법 = 5
• 1. 공시균 = 5
• 2. LC 9018 생육곡선 = 5
• 3. 균의 배양 = 5
• 4. 공시 종양세포 = 5
• 5. 종양세포의 배양 = 7
• 6. 항종양활성 측정 = 9
• 7. LC 9018 균체의 유기용매 추출 = 9
• 8. LC 9018균체로 부터 cell wall skeleton(CWS)의 분리ㆍ정제 = 11
• 9. LC 9018 균체로 부터 whole peptidoglycan(WPG)의 분리ㆍ정제 = 12
• 10. CWS 및 WPG의 항종양활성 측정 = 14
• 11. 균체, CWS 및 WPG의 전자현미경 관찰 = 16
• Ⅲ. 결과 및 고찰 = 17
• 1. LC 9018의 생육곡선 = 17
• 2. LC 9018의 배양여액과 균체의 항종양효과 = 17
• 3. LC 9018 균체의 유기용매 추출물의 항종양효과 = 20
• 4. CWS 및 WPG의 항종양활성 = 23
• 1) CWS의 항종양활성 = 23
• 2) WPG의 항종양활성 = 25
• 5. CWS와 WPG의 항종양활성 최소 농도 = 25
• 1) CWS의 항종양활성 최소 농도 = 27
• 2) WPG의 항종양활성 최소 농도 = 27
• 6. 균제, CWS 및 WPG의 전자현미경 관찰 = 30
• Ⅳ. 적요 = 34
• 참고문헌 = 36