소뇌 Purkinje 세포에서 Na+-Ca2+ 교환 이동의 활성도

국문 초록 (Abstract)

소뇌 Purkinje 세포에서 Ca2+은 신호전달과정에 중요한 역할을 수행하며, 이러한 기전은 세포체 (soma)와 수상돌기 (dendrite)내 Ca2+ 농도 ([Ca2+]i)의 증가를 통하여 이루어진다. 증가된 세포내 Ca2+ 농도는 Na+-Ca2+ 교환이동체 (NCX) 및 Ca2+ pump (PMCA)등을 통하여 감소된다. NCX의 활성도를 조절하는 인자로는 Ca2+, Na+, PIP2, 그리고 PKC등이 알려져 있으며, caveolae라는 세포내 신호전달에 관련된 세포막 구조 속에 존재하여 caveolin 단백질과 복합체를 이루고 있다고 밝혀졌다. 비록 구조적으로 caveolin 단백질과 NCX가 복합체를 형성하지만, caveolin-1단백질이 NCX의 활성도를 조절하는 조절 인자로써의 역할은 아직 밝혀져 있지 않다. 이에 본 연구에서는 소뇌 Purkinje 세포의 세포체에서 NCX 및 caveolin-1단백질의 분자면역학적 증거를 관찰 하여 caveolin-1단백질이 NCX의 활성도에 미치는 영향을 조사하고자 하였다.
본 연구에서는 소뇌 Purkinje 세포의 세포체에서 분자면역학적 방법을 이용하여 NCX가 발현됨을 관찰하였다. NCX의 생리적 활성도는 fura-2를 이용하여 측정하였으며, bepridil (forward mode 억제제)및 KB-R7943 (reverse mode 억제제)과 같은 NCX 억제제를 처리하여 NCX를 통한 Ca2+ 이동이 억제됨을 관찰하였다. 안정 상태에서 bepridil은 농도 의존적으로 세포내 Ca2+ 농도를 증가시켰으며, KB-R7943은 세포밖 Na+을 제거 하여 형성되는 세포내 Ca2+ 농도 증가를 억제시켜 소뇌 Purkinje 세포의 세포체에서 NCX 활성도를 확인할 수 있었다.
또한 Purkinje 세포의 세포체에서 NCX의 역할을 알아보고자 nitric oxide (NO) 생성 및 neuronal nitric oxide synthase (nNOS)의 발현을 관찰한 결과 bepridil이 nNOS 단백질을 활성화시켜 NO를 유리 시켰으며 nNOS 억제제인 7-nitroindazole에 의해 NO 생성이 저하됨을 관찰하였다. 이러한 결과는 Purkinje 세포에서 NCX 기전이 Ca2+ 의존성 세포내 신호전달과정에 중요한 역할을 수행함을 의미한다.
Caveolin-1단백질이 NCX의 활성도에 미치는 영향을 알아보기 위하여 caveolin-1단백질의 antisense oligoneucleotides을 세포내로 주입하여 caveolin-1 단백질의 발현을 저하시킨 후 NCX의 활성도를 측정하였다. Caveolin-1 antisense oligoneucleotides로 처리된 세포에서는 안정 시 세포내 Ca2+ 농도 ([R340/380]basal)가 의미 있게 높았으며, 세포 밖의 Na+을 제거하여 NCX를 통한 Ca2+ 유입을 [R340/380]peak로 측정하여 [R340/380]basal에서 증가된 양을 [R340/380]peak - [R340/380]basal 로 비교한 결과, 대조군들에 비해 의미 있게 감소됨이 관찰되었다. 또한 Na+을 제거하여 세포내 Ca2+ 농도를 증가시킨 후 NCX를 통한 Ca2+ 제거률 (R340/380/min)을 측정한 결과 caveolin-1 antisense oligoneucleotides 처리군에서 Ca2+ 제거률이 대조군에 비해 의미 있게 저하됨이 관찰되었다. 이러한 결과는 caveolin-1단백질이 Purkinje 세포의 세포체에서 NCX의 활성도를 조절하는 조절인자의 역할을 수행함을 제시한다.
본 연구의 결과로, 소뇌 Purkinje 세포에서 caveolin-1단백질에 의해 조절 되는 NCX 기전이 Purkinje 세포의 long-term depression등 Ca2+ 의존성 세포내 신호전달체계에 중요한 역할을 할 것으로 사료된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Intracellular Ca2+ is an important messenger for processing information in many cells including cerebellar Purkinje neurons, since several forms of synaptic plasticity at the excitatory and inhibitory inputs are triggered by transient rises of intracellular Ca2+concentration ([Ca2+]i) in dendrites and soma. The mechanism controlling the recovery of [Ca2+]i to resting levels following depolarization-induced [Ca2+]i rises is crucial for preparing the next processes.
One of the Ca2+ extrusion pathways is Na+-Ca2+ exchanger (NCX) that transports Ca2+ in inward or outward directions across the plasma membrane in exchange for Na+, depending upon the electrochemical gradients of Na+ and Ca2+ and plasma membrane potential. The physiological activity of NCX is modulated by Ca2+, Na+, phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) and protein kinase C (PKC), and NCX is also known to be localized within caveolae which is known to concentrate a wide variety of signaling factors. Although caveolin, a principal structural protein of caveolae, associates with NCX, not much information is available on the role of caveolin in modulating of the NCX physiological activity.
Thus, in this study, to evaluate the possible role of caveolin on NCX activity, immunohistochemical and physiological evidences for the existence of NCX and caveolin in the soma of Purkinje neurons were investigated. The monoclonal anti-NCX antibody (R3F1) was strongly cross-reacted with the NCX in the plasma membrane of rat cerebellar Purkinje neuron. The expression of NCX subtypes in Purkinje neuron was analyzed with RT-PCR technique, and three NCX subtypes were observed in Purkinje neurons. The physiological activity of NCX was examined by inducing Ca2+ influx (a rise in [Ca2+]i) due to the reverse mode of NCX and Ca2+ efflux (a decrease in [Ca2+]i via the forward mode). The physiological role of NCX was also studied by measuring nitric oxide (NO) generated under the condition of NCX inhibition. Bepridil, a specific inhibitor of NCX forward mode, induced the activation of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) but 7 nitroindazole (nNOS inhibitor) depressed the effect of bepridil.
Upon these experimental observations on NCX activity, it was further tested whether caveolin modulates the functional activity of NCX in the soma of Purkinje neuron. It was found that caveolin-1 is expressed throughout the soma of Purkinje neurons. Treatments of antisense oligoneucleotides against caveolin-1 for 24 hours significantly elevated the resting level of [Ca2+]i in Purkinje neurons. In caveolin-1 antisense oligoneucleotides treated neurons, Ca2+ influx by Na+ removal was suppressed, and Ca2+ clearance via the forward mode of NCX was delayed and also slowed down in comparison with the control and lipofectamine treated neurons, showing caveolin-1 dependence of NCX activity. In conclusion, the results of this study provide experimental evidences that caveolin-1 may play a physiological role of modulating NCX activity in Purkinje neurons. This study also suggests that the modulation of NCX activity by caveolin-1 makes a significant contribution to physiological activity such as long-term depression induction in Purkinje neurons.