ARE-binding protein에 의한 NF-kB 활성 및 암세포 성장 억제 = Suppression of tumor growth by ARE-binding protein through inhibition of NF-kB activity

국문 초록 (Abstract)

I 연구개발의 목적 및 필요성
○ NF-kB는 전사조절인자로서, cell proliferation, angiogenesis, metastasis, tumor promotion, inflammation, 그리고 anti-apoptosis 등 cancer marker 관련 gene들의 발현 조절을 통하여 암세포의 성장에 큰 영향을 준다
○ 지금까지 개발된 NF-kB inhibitor의 경우 target molecule과의 결합을 통하여 억제효과를 나타내는데, target molecule들의 돌연변이 결과 결합 부위에 변이가 발생하여 이들 물질에 내성이 발생하는 암들이 발견되고 있다. 따라서 새로운 개념의 NF-kB 조절물질의 개발이 필요한 상황이다.
○ 본 연구는 ARE-binding protein (AUBP)이 cIAP 발현 조절을 통하여 RIP1의 K63-linked polyubiquitination 및 NF-kB 활성을 조절할 수 있는지, 그리고 이를 통하여 암세포의 성장을 억제할수 있는지 확인함을 최종 목표로 함
II. 연구개발의 내용 및 범위
cIAP 발현 조절을 통한 AUBP의 NF-kB 활성 조절 기작 분석
○ TTP 및 BRF1에 의한 cIAP 발현 조절 확인
○ TTP 및 BRF1에 의한 NF-kB signal pathway 조절 확인
○ TTP 및 BRF1에 의한 NF-kB target gene들의 발현 변화 분석
NF-kB 활성 조절을 통한 AUBP의 암세포 성장 조절 분석
○ TTP 및 BRF1 과발현에 의한 NF-kB 활성 및 암세포의 성장 억제 효과 분석
○ TTP 및 BRF1 발현 유도물질에 의한 NF-kB 활성 및 암세포의 성장 억제 효과 분석
III. 연구개발결과
○ TTP 및 BRF1에 의한 cIAP 발현 억제 확인
- TTP 및 BRF1의 과발현이 cIAP2 발현 억제함을 확인
- TTP 및 BRF1이 cIAP2의 mRNA 3'UTR에 존재하는 4개의 ARE들 중 2번째 ARE에 결합하여 mRNA stability를 감소시킴을 확인
- TTP가 cIAP2 mRNA 3'UTR에 결합만으로는 mRNA stabilty를 감소시키지 못하고 Xrn1 및 Dcp2 등의 결합이 필요함을 확인
○ TTP 및 BRF1에 의한 IkB 신호 억제 확인: - TNF-α 처리 후 초기에는 TTP가 NF-kB 활성에 영향을 주지 않다가 처리 후 6시간 이후부터 NF-kB 활성을 억제함을 확인
- TTP 혹은 BRF1 과발현이 IkB 분해를 막음을 확인
○ TTP 및 BRF1에 의한 NF-kB target gene들의 발현 억제확인
- TTP 혹은 BRF1 과발현이 MCP1, VEGF 등의 NF-kB target gene 발현을 억제함을 확인
○ TTP 과발현에 의한 암세포의 성장 억제 확인
- TTP 과발현이 사람의 전립선 암세포 성장을 억제함을 확인
○ p53 및 doxorubicin이 TTP 발현 유도함을 확인
- 암세포에서 p53이 TTP 발현을 유도함을 확인
- EMSA 및 ChIP assay를 통하여 p53이 TTP promoter에 결합함을 확인
- p53 inducer인 doxorubicin이 TTP 발현을 유도함을 확인
○ Doxorubicin이 TTP 유도를 통하여 암세포의 성장 억제함을 확인
- Doxorubicin이 암세포의 성장을 억제함을 확인
- siRNA를 사용하여 TTP 발현을 억제시키면, doxorubicin에 의한 암세포 성장 저해 효과가 억제됨을 확인
IV. 연구개발결과의 활용계획
○ TTP 및 BRF1 발현 및 활성 증가 물질을 대상으로 새로운 암 치료제 및 항암제 내성억제제 개발에활용
○ TTP 및 BRF1 발현 및 활성 변화 분석을 바탕으로 암 발생 및 항암제 내성 발생 예측에 활용

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

I Objectives and Significance
○ Transcription factor NF-kB can enhance the growth of cancer cells through induction of the expression of various kinds of genes involved in cell proliferation, angiogenesis, metastasis, tumor promotion, inflammation, and anti-apoptosis.
○ Until now, many NF-kB inhibitors have been developed and their inhibitor effects was found to be mediated by interaction with molecules involved in the NF-kB pathway. However, mutation in the molecules of the NF-kB pathway has been found to block the binding and the effect of the inhibitors. Thus, new inhibitors based on the novel control mechanism of NF-kB pathway are required for the control of cancer growth.
○ The purpose of this study is to determine whether ARE-binding protein (AUBP) can control the NF-kB activity and cancer cell growth through down-regulation of cIAP2.
II. Content and Scope of the Study
Inhibition of NF-kB activity by AUBP through down-regulation of cIAP2
○ Confirmation of down-regulation of cIAP2 expression by TTP and BRF1
○ Confirmation of inhibition of NF-kB activity by TTP and BRF1
○ Determination of the effect of TTP and BRF1 on the expression of NF-kB target genes
Inhibition of cancer cell growth by AUBP and AUBP inducer
○ Determination of the effect of AUBP overexpression on the growth of cancer cells
○ Confirmation of TTP inducers in cancer cells: p53 and doxorubicin
○ Confirmation of the inhibitory effect of doxorubicin on the cancer cell growth through TTP induction
III. Results
○ Confirmation of down-regulation of cIAP2 expression by TTP and BRF1 :
- Overexpression of TTP or BRF1 was found to suppress cIAP2 expression in cancer cells.
- TTP or BRF1 was found to destabilize cIAP2 mRNA through binding to the second ARE within the cIAP2 mRNA 3'UTR.
- We found that binding of TTP to cIAP2 mRNA 3'UTR is not enough to destabilize the cIAP2 mRNA but that recruitment of Xrn1 and Dcp2 is required for their inhibitory activities.
○ Confirmation of inhibition of NF-kB activity by TTP and BRF1 :
- We found that TTP did not affect the NF-kB activity until 4 h after TNF-α treatment but inhibited it at 6 h after TNF-α treatment.
- The overexpression of TTP or BRF1 inhibited the NF-kB pathway upstream of IkB.
○ Determination of the effect of TTP and BRF1 on the expression of NF-kB target genes
- The overexpression of TTP or BRF1 inhibited the expression of NF-kB target genes such as
MCP1 and VEGF.
○ Overexpression of TTP suppressed the growth of human cancer cells
○ Confirmation of TTP inducers in cancer cells: p53 and doxorubicin
- We found that p53 induced the TTP expression in cancer cells
- We confirmed the binding of p53 to the TTP promoter by EMSA and ChIP assay
- Doxorubicin, the p53 inducer, was found to induce TTP expression.
○ Confirmation of the inhibitory effect of doxorubicin on the cancer cell growth through TTP induction
- Doxorubicin was found to inhibit cancer cell growth.
- We found that down-regulation of TTP by siRNA blocked the inhibitory effect of doxorubicin on the growth of cancer cells.
IV. Suggestions for Application
○ Screening for the inducers for TTP or BRF1 and applying them to develop new drugs against chemo-resistant cancer cells.
○ Application of expression level of TTP or BRF1 as a marker for prediction of tumorigenesis and chemo-sensitivity.