Synthesis and structural characterization of novel hybrid α-glucans via dual-enzyme system of amylosucrase and dextransucrase

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Hybrid and copolymers, integrating structurally distinct monomer sequences, are commercially valuable materials, as their mixed compositions give rise to physical and functional characteristics that cannot be achieved by homopolymers independently. Native polymer structures are not suitable for a wide range of desirable practical applications due to their rigid intrinsic properties. In this context, glucansucrases have been widely used for the biosynthesis of polysaccharide-based polymers. Although enzymatic modification of α-glucans has commonly focused on introducing α-（1→6） branches into α-（1→4）-rich starch or amylose backbones using branching enzymes like 4,6-α-glucanotransferases, comparatively less attention has been given to glucosyltransferase-based systems that construct α-（1→6）-dominant glucan frameworks incorporating α-（1→4）-linked units or branch-like domains. This study aimed to explore whether complementary glucansucrases transglycosylation activities can generate structurally distinct hybrid α-glucans using sucrose as the sole substrate. A one-pot dual-enzyme system composed of Neisseria polysaccharea amylosucrase （NpAS; GH13） and Streptococcus mutans dextransucrase （SmDS; GH70）, with sucrose as the donor substrate. The product structure was controlled by varying SmDS activity at three ratios （NpAS: SmDS = 1:1, 1:2, and 1:4）. Soluble glucan fractions were purified using ethanol precipitation （95% v/v） followed by dialysis membrane filtration （3.5 kDa MWCO）. Molecular weight （Mw） of purified glucans analyzed by high-performance size-exclusion chromatography with refractive index detection （HPSEC-RI） showed that the Mw of purified hybrid α-glucans was not only distinct as compared to NpAS and SmDS but also followed systematically increasing pattern with increase in SmDS activity, from 1.9 × 103 g·mol⁻¹ at 1:1 to 2.14 × 103 g·mol⁻¹ at 1:2 and 2.55 × 103 g·mol⁻¹ at 1:4, indicating that increasing the SmDS contribution promoted the formation of higher molecular weight soluble glucan populations rather than reproducing amylose- like or dextran-like product. 1H NMR spectroscopy and PMAA-GC-MS analysis confirmed the hybrid glucans contained →6）Glc, →3）Glc, →4）Glc, →3,6）Glc, and →4,6）Glc residues, providing evidence for a unique structural linkage environment of hybrid products. Enzymatic fingerprinting using dextranase and isoamylase revealed that the main chain structure of hybrid glucans was composed of an α-（1→6）-linked backbone, while other linkages were present as branches or side-chain residues. This distinction is structurally significant, as it suggests a mode of chain elongation in which SmDS extends NpAS-derived α-（1→4） maltooligosaccharide acceptors through linear α-（1→6） transglycosylation rather than forming conventional α-（1→6） branch structures. These mixed-linkage compositions distinguish the hybrid glucans from starch-type branched α-glucans bearing α-（1→6） branch points, and glycogen-like hyperbranched architectures. Furthermore, FITDOG-assisted oxidative depolymerization followed by NaBH4 reduction and LC-MS/MS analysis showed a clustered oligosaccharide （hexose） profile, which revealed that hybrid α-glucans shared a highly similar oligosaccharide fingerprint among themselves （cosine similarity ≥ 0.98）, but exhibited only partial similarity with either NpAS （0.37–0.57） and SmDS （0.73– 0.87） controls. Tandem MS （MS²） analysis of reduced hexose alditol [Hexn-ol+Na]⁺ precursor ions revealed that glycosidic and cross-ring dissociation fragments diagnostic for α-（1→6）, α-（1→4）, and α-（1→3） linkages co-existed within the same hybrid spectra. These fragmentation patterns were not consistent with a simple physical overlay of parental Hexn distributions, as hybrid-specific peaks appeared at retention times absent from both parent profiles. These observations support the formation of putative heterogeneous mixed-linkage isomers in the hybrid products. Furthermore, physical characterization of the hybrid glucans supported these structural findings. This work demonstrates that combining NpAS and SmDS with complementary linkage specificities in a single reaction system represents a feasible biocatalytic strategy for generating soluble α-glucans with expanded tunable structural diversity and provides a foundation for future studies aimed at tailoring hybrid glucan properties for food, biomedical, and material applications.

국문 초록 (Abstract)

구조적으로 서로 다른 단량체 서열을 결합한 하이브리드 중합체와 공중합체는, 그 혼합 조성으로 인해 단일 중합체만으로는 달성할 수 없는 물리적 및 기능적 특성을 나타내기 때문에 상업적으로 가치 있는 소재입니다. 천연 고분자 구조는 그 경직된 본질적 특성 때문에 광범위한 바람직한 실용적 응용 분야를 충족시키지 못한다. 이러한 맥락에서 글루칸수크라아제는 다당류 기반 고분자의 생합성에 널리 사용되어 왔다. α-글루칸의 효소적 변형은 일반적으로 4, 6-α-글루카노트랜스퍼라제와 같은 분지화 효소를 사용하여 α-（1→4）가 풍부한 전분이나 아밀로오스 골격에 α-（1→6） 분지를 도입하는 데 주로 집중되어 왔으나, α-（1→4） 결합 단위나 분지형 도메인을 포함하는 α-（1→6） 우세 글루칸 골격을 구축하는 글루코실트랜스퍼라제 기반 시스템에는 상대적으로 적은 관심이 기울여져 왔다. 본 연구는 상호 보완적인 글루칸수크라제의 트랜스글루코실화 활성을 통해 자당을 유일한 기질로 사용하여 구조적으로 구별되는 하이브리드 α-글루칸을 생성할 수 있는지 탐구하는 것을 목표로 하였다. 자당을 기증자 기질로 사용하는 Neisseria polysaccharea 아밀로수크라제（NpAS; GH13）와 Streptococcus mutans 덱스트란수크라제（SmDS; GH70）로 구성된 원팟 이중 효소 시스템. 생성물 구조는 SmDS 활성을 세 가지 비율（NpAS: SmDS = 1:1, 1:2 및 1:4）로 변화시켜 조절하였다. 용해성 글루칸 분획은 에탄올 침전（95% v/v） 후 투석막 여과（3.5 kDa MWCO）를 통해 정제하였다. 굴절률 검출 방식의 고성능 크기 배제 크로마토그래피（HPSEC-RI）를 통해 분석한 정제 글루칸의 분자량（Mw） 결과, 정제된 하이브리드 α-글루칸의 분자량은 NpAS 및 SmDS와 비교했을 때 뚜렷한 차이를 보였을 뿐만 아니라, SmDS 활성의 증가에 따라 1:1 비율에서 1.9 × 10³ g· mol⁻¹에서 1:1 비율 시 2.14 × 10³ g·mol⁻¹（1:2 비율）, 2.55 × 10³ g·mol⁻¹（1:4 비율）로 체계적으로 증가하는 양상을 보였으며, 이는 SmDS의 기여도가 증가함에 따라 아밀로스 유사체나 덱스트란 유사체 생성보다는 고분자량 용해성 글루칸 군의 형성이 촉진되었음을 시사한다. 1H NMR 분광법 및 PMAA-GC-MS 분석을 통해 하이브리드 글루칸이 →6）Glc, →4）Glc, →3）Glc, →3,6）Glc 및 →4,6）Glc 잔기를 포함하고 있음이 확인되었으며, 이는 하이브리드 생성물의 독특한 구조적 결합 환경에 대한 증거를 제공했다. 덱스트라나아제 및 이소아밀라아제를 이용한 효소 지문 분석 결과, 하이브리드 글루칸의 주사슬 구조는 α-（1→6） 결합 백본으로 구성되어 있는 반면, 다른 결합은 분지 또는 측쇄 잔기로 존재하는 것으로 밝혀졌습니다. 이러한 차이는 구조적으로 중요한데, 이는 SmDS가 기존의 α-（1→6） 분지 구조를 형성하기보다는 선형 α-（1→6） 트랜스글리코실화를 통해 NpAS 유래 α-（1→4） 말토올리고당 수용체를 연장하는 사슬 연장 방식을 시사하기 때문이다. 이러한 혼합 결합 구성은 하이브리드 글루칸을 α-（1→6） 분지점을 가진 전분형 분지 α-글루칸 및 글리코겐과 유사한 과분지 구조와 구별합니다. 또한, FITDOG를 이용한 산화적 탈중합 후 NaBH₄ 환원 및 LC-MS/MS 분석 결과, 클러스터화된 올리고당（헥소스） 프로파일이 확인되었으며, 이를 통해 하이브리드 α-글루칸들은 서로 매우 유사한 올리고당 지문을 공유하는 것으로 나타났습니다（코사인 유사도 ≥ 0.98）. 반면 NpAS（0.37–0.57） 및 SmDS（0.73–0.87） 대조군과는 부분적인 유사성만을 나타냈다. 환원된 헥소스 알디톨 [Hexn-ol+Na]⁺ 전구체 이온에 대한 탠덤 MS（MS²） 분석 결과, α-（1→6）, α-（1→4）, 및 α-（1→3） 결합을 진단하는 글리코시드 및 크로스-링 해리 단편들이 동일한 하이브리드 스펙트럼 내에 공존하는 것으로 나타났다. 이러한 단편화 패턴은 모체 Hexn 분포의 단순한 물리적 중첩과는 일치하지 않았는데, 이는 두 모체 프로파일 모두에서 나타나지 않는 유지 시간에 하이브리드 특이적 피크가 나타났기 때문이다. 이러한 관찰 결과는 하이브리드 생성물 내에서 추정되는 이종 혼합 결합 이성질체의 형성을 뒷받침한다. 또한, 하이브리드 글루칸의 물리적 특성 분석 결과 이러한 구조적 발견을 뒷받침했다. 본 연구는 상호 보완적인 결합 특이성을 지닌 NpAS와 SmDS를 단일 반응 시스템에서 결합하는 것이, 조절 가능한 구조적 다양성이 확장된 용해성 α-글루칸을 생성하기 위한 실행 가능한 생체촉매 전략임을 입증하며, 식품, 생의학 및 소재 응용을 위해 하이브리드 글루칸의 특성을 맞춤화하는 향후 연구의 토대를 제공한다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. Introduction 12
• 1. Enzymatically synthesized polysaccharides 12
• 2. α-glucans 13
• 2.1. Structural diversity and functionality of α-glucans 13
• 3. Hybrid α-glucans 14
• 4. Industrial applications of α-glucans 15
• 5. Glucansucrases (GSs) 17
• 5.1. Transglycosylation activity of GSs 17
• 5.2. GH13 and GH70 GSs 19
• 5.3. Amylosucrase 21
• 5.4. Dextransucrase 23
• 6. Challenges and strategies for the synthesis of glucan polymers 27
• 6.1. Structural modification and its impact on polymer properties 28
• 7. Structural characterization of glucans 29
• 8. Objective of study 31
• Ⅱ. Materials and methods 33
• 1. Materials 33
• 2. Methods 34
• 2.1. Expression and purification of NpAS and SmDS 34
• 2.2. Enzymatic activity and characteristics 35
• 2.2.1. Amylosucrase activity assay 35
• 2.2.2. Dextransucrase activity assay 36
• 2.3. Synthesis of hybrid α-glucans 36
• 2.4. Purification and analysis of hybrid soluble α-glucans 37
• 2.4.1. Ethanol precipitation and dialysis membrane filtration 37
• 2.4.2. Molecular weight analysis by HPSEC-RI 38
• 2.5. Enzymatic fingerprinting for structural characterization of soluble α-glucans 39
• 2.5.1. Dextranase hydrolysis 39
• 2.5.2. Isoamylase hydrolysis 39
• 2.5.3. Analysis of hydrolyzed products by HPAEC-PAD 40
• 2.5.4. Analysis of hydrolyzed products by HPSEC-RI 40
• 2.6. Analytical characterization of the structure of soluble α-glucans 41
• 2.6.1. Linkage composition determination by 1H NMR 41
• 2.6.2. Glycosidic linkage analysis by GC-MS 42
• 2.6.3. FITDOG reaction for oligosaccharide fingerprinting 43
• 2.6.4. LC-MS/MS analysis for structural characterization 44
• 2.7. Statistical analysis 45
• Ⅲ. Results and discussion 46
• 1. Synthesis of hybrid α-glucans 46
• 1.1. Optimization of NpAS/SmDS dual-enzyme system 46
• 2. Purification and analysis of hybrid soluble α-glucans 51
• 2.1. Ethanol precipitation of crude soluble glucans 51
• 2.2. Dialysis membrane filtration for glucan purification 53
• 2.3. HPSEC-RI analysis of purified soluble fractions 53
• 3. Structural characterization of hybrid α-glucans 56
• 3.1. Molecular weight analysis of purified glucans by HPSEC-RI 56
• 3.2. Enzymatic fingerprinting using dextranase and isoamylase 58
• 3.2.1. Dextranase hydrolysis and HPAEC-PAD analysis 58
• 3.2.2. HPSEC-RI analysis of dextranase hydrolysis products 64
• 3.2.3. Isoamylase hydrolysis and HPAEC-PAD analysis 68
• 3.2.4. HPSEC-RI analysis of isoamylase hydrolysis products 72
• 3.3. Linkage composition of hybrid α-glucans by 1H NMR spectroscopy 76
• 3.4. Glycosidic linkage analysis by GC-MS 80
• 3.5. FITDOG analysis for oligosaccharide fingerprinting 84
• 3.5.1. LC-MS profile diagnostic oligosaccharide isomers 87
• 3.5.2. LC-MS profile interpretation for structural similarities and differences 88
• 3.5.3. LC-MS2 spectral ion fragmentation comparisons for structure prediction 91
• 3.5.4. Fragmentation pattern interpretation for identification of branched residues 99
• 3.5.5. Ionic fragmentation-based structural assignments for NpAS and SmDS 111
• 3.5.6. Ionic fragmentation-based structural assignments for hybrid α-glucans 113
• Ⅳ. Conclusions 123
• References 127