Integration of Computational Approaches, Machine Learning, Synthesis, and In Vitro Evaluation for Designing Carbonic Anhydrase, DHODH, and EGFR Inhibitors = 메커니즘 규명을 위한 가상 스크리닝: 약물 디자인, 합성, 발굴 및 분석에 대한 계산적 통합

국문 초록 (Abstract)

1990년대 초만 해도 의약화학은 경험주의와 합성에 기반을 두고 있었기 때문에 계산화학의 중요성이 크지 않았다. 그럼에도 불구하고 다양한 연구와 투자로 점진적인 발전이 이루어져 현재는 의약화학분야내에서 계산화학의 역할이 커졌다. 이는 단백질 데이터베이스나 화합물 라이브러리 같은 구조적으로 사용가능한 표적 데이터의 급격한 증가, 지속적인 무어 법칙의 영향, 구조기반 약물개발에 집중하는 회사 설립으로 뒷받침되었다. 현재 신약개발 과정에서 계산을 통한 예측과 실제 실험적 테스트의 조합은 주목받고 있으며, 세계 유수의 신약개발 회사 일부에서도 다양한 계산 기법을 사용하고 있다. 이처럼 계산 기술에 대한 의존도가 높아진 것은 신약개발 과정에서 전임상 시험과 임상 시험 등 시간이 많이 소모되는 과정이라는 것에서 기인되었다. 신약개발에는 약 12억 달러의 비용이 사용되며, 신약개발 단계에서 실패율이 높기 때문에 계산 기법을 사용한 개발과정에서 비용을 줄일 필요성이 있다.
컴퓨터 보조 약물 디자인(Computer-aided drug design, CADD)은 유사한 생화학적 특성을 가진 약물 및 활성물질 발굴, 개발 및 분석을 가능하게 하는 일련의 계산 기법이다. 이런 기법에는 초고속 가상 스크리닝(virtual high-throughput screening, vHTS), 분자 도킹, 정량적 구조-활성 상관관계(quantitative structure-activity relationship, QSAR), 삼차원 약리활성단 맵핑(3D pharmacophore mapping), 분자동역학 시뮬레이션(molecular dynamics simulation), 자유에너지 계산 그리고 ADME 예측이 있다. 이런 기법은 신약개발의 첫번째 단계인 선도 화합물의 발견과 개선을 빠르게 하기 위해 사용된다.
CADD에 사용되는 다양한 기법 중 가상 스크리닝은 가장 널리 활용되는 방법이다. 가상 스크리닝은 컴퓨터 알고리즘을 사용하여 특정 단백질 표적에 화합물을 가상으로 스크리닝하여 활성물질을 식별하고 최적화하는데 사용하는 계산기법이다. 스크리닝을 통해 화합물이 단백질 표적과의 상호작용하는 정도를 계산하고, 그 순위를 매겨 연구자가 비용을 절감하며 빠르게 선도화합물을 선정할 수 있도록 도움을 준다. 가상 스크리닝은 크게 구조 기반 가상 스크리닝과 리간드 기반 가상 스크리닝으로 나뉜다. 구조 기반 가상 스크리닝에서는 수용체나 단백질과 같은 생물학적 표적의 3D 데이터와 리간드/약물 후보물질을 도킹하고 결합 친화도에 따라 점수를 매겨 후보물질의 순위를 결정한다. 생물학적 표적의 3D 구조를 활용할 수 없는 경우 리간드 기반 가상 스크리닝을 사용한다. 리간드 기반 가상 스크리닝은 기존에 활성이 확인된 물질의 구조-활성 상관관계 정보를 활용한다. 이 가상 스크리닝 기법은 3D 형상 매칭, 약리활성단 기반 검색, QSAR, 유사성 검색, 하위구조 검색과 같은 다양한 기술을 포함한다.
가상 스크리닝은 많은 양의 화합물 라이브러리를 빠르게 스크리닝할 수 있지만, 기본적으로 표적단백질 분자의 유동성은 분자 도킹을 기반으로 하고 있다. 실제 단백질은 고정 되어있지 않고 여러 자극에 의하여 다양한 모양과 형태로 변할 수 있는 동적인 상태로 존재하며, 이러한 단백질 구조의 변형은 리간드의 결합형태와 신약 후보물질의 효능을 변화시킬 수 있다. 따라서 고정된 단백질을 가상 스크리닝에 사용하는 방법은 주요 결합부위를 간과하여 위음성을 나타내거나 부정확한 예측을 초래할 수 있다. 일반적으로 이런 한계점을 피하기 위해 분자동역학 시뮬레이션을 통한 가상 스크리닝 결과와 통합하여 정확성을 향상시킨다.
계산 기법의 예측가능성을 향상시키기 위해 자유 에너지 섭동(free energy perturbation, FEP)이라고도 알려진 자유 에너지 계산방법을 분자 동역학 시뮬레이션과 통합시킨다. FEP 계산은 두 리간드의 결합 친화도와 자유에너지를 비교하는 정밀한 방법을 제공한다. FEP 계산방법의 정확성과 신뢰성은 컴퓨터 기술의 발전으로 인해 전향적, 후향적 연구 모두에서 광범위하게 테스트되었다. 수많은 화합물 라이브러리에서 소수의 물질만이 연구 및 개발되기 때문에 FEP 계산 값은 신약 개발 과정에서 가장 큰 영향을 미친다. 기존의 약물후보물질 발굴 과정에서는 합성과정에서 많은 비용을 들이지 않고는 최적의 물질을 찾기 어렵다. 이런 상황은 표적 단백질과 다른 단백질의 구조가 서로 유사하여 높은 수준의 약물 선택성이 필요한 경우 부각된다. 약물의 선택성 뿐만 아니라 효능, 용해도, 대사 안정성, 막 투과도 등 약물로서 필요한 주요 특성 또한 성공적으로 고려하기 위해서는 더욱 많은 비용이 들어간다. 표적 단백질의 유형도 약물 개발 난이도에 상당한 영향을 미치며, 일부 표적 단백질은 리간드 결합부위가 굉장히 까다로워 효과적인 약물 후보물질을 개발하는데 어려움이 있다.
이 연구에서는 약물 개발과정을 향상시키기 위해 합리적인 약물 디자인과 합성, 몇몇 계산기법을 결합하였다. 앞서 언급한 다양한 계산기법은 신규 억제제의 결합 메커니즘을 설명하고, 새로운 약물 후보물질을 식별하며, 이전에 알려지지 않은 단백질-단백질 및 리간드-단백질 상호작용 메커니즘을 설명하는데 사용된다. 이러한 계산기법을 활용하여 약물 상호작용의 분자적 메커니즘을 밝히고 신규 약물 후보물질 디자인에 대한 통찰을 제공하고자 한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

At the start of the 1990s, the significance of computational chemistry in the field was debatable, with the majority of medicinal chemistry based on empiricism and synthesis. Nonetheless, a combination of discoveries, investments, and incremental advances has resulted in an increase in the role of computation in the field. This has been supported by a surge of structurally enabled targets, the continued impact of Moore's Law, and the establishment of companies completely dedicated to structure-based medication creation. The combination of computer prediction and experimental testing has given the area its present traction in the drug discovery process with some of the Worlds’ leading pharmaceutical companies relying heavily on the various computational tools for their day-to-day operations. This increased reliance on computational techniques stems from the fact that the Drug development is a difficult, time-consuming process that includes preclinical testing followed by clinical trials in human subjects. Drug development costs around $ 1.2 billion and has a high failure rate at any stage of drug development which has necessitated the use of computational techniques to decrease the cost of this process.
Computer-aided drug design (CADD) refers to a set of computational techniques that enable the discovery, development, and analysis of drugs and active molecules with similar biochemical properties. These techniques include virtual high-throughput screening (vHTS), molecular docking, quantitative structure-activity relationship (QSAR), three-dimensional (3D) pharmacophore mapping, molecular dynamic simulations, free energy calculations and ADME prediction. These techniques are used in the first stages of drug development to quicken the discovery and improvement of lead compounds.
Among the various strategies used in CADD, virtual screening is the most widely utilized one. Virtual screening has been established as a reliable and widely accepted computational technique for hit identification and optimization that supports experimental high-throughput screening. It involves the use of computer algorithms to screen a large variety of chemicals against a specific protein target. The program ranks the compounds based on their ability to attach to the target, allowing researchers to discover viable leads for future refining in a fast and cost-effective manner. Virtual screening can be divided into two main categories: ligand-based virtual screening and structure-based virtual screening (sometimes referred to as receptor-based or target-based virtual screening). A docking strategy is employed in structure-based virtual screening, which depends on the availability of 3D data on the biological target, to dock the ligand/drug candidate molecules to the receptor or protein target. The molecules are then ranked according to their docking score, which is determined by their expected binding affinity. When the 3D structure of the protein target is unavailable, ligand-based virtual screening is used. It makes use of structure-activity information gathered from a set of known active compounds. This virtual screening technique encompasses a variety of techniques such as 3D shape matching, pharmacophore-based search, QSAR, similarity search, and substructure search.
Although virtual screening allows for the rapid screening of a large library, it is fundamentally based on molecular docking, which disregard the protein target's flexibility. Proteins, in reality, are not static, but rather exist in a dynamic state in which their shape and conformation can vary in response to various stimuli. These changes in protein shape can affect ligand binding and alter the potency and efficacy of the drug candidate. As a result, the rigid docking method utilized in virtual screening may overlook key binding sites, resulting in false negatives or inaccurate predictions. To circumvent this limitation, molecular dynamics simulations are typically incorporated into virtual screening to improve the accuracy of the screening results.
In order to improve the predictability of the calculations, free energy calculations, also known as free energy perturbation (FEP), are one of the technologies that have been integrated with molecular dynamics. FEP calculations provide a precise method to compare the free energy of the binding affinities of two ligands. The accuracy and dependability of FEP methods have been extensively tested in both retrospective and prospective research thanks to advancements in computer technology as well as FEP methodology. Since only a small number of compounds from a large library of candidates can best develop the research, FEP estimates have the biggest impact on drug discovery projects. The best compounds could be difficult to find using conventional methods without spending a lot of money on synthetic chemistry. Such circumstances are frequently encountered in drug development efforts, especially when a high level of selectivity is required against numerous members of a family who are closely related to one another. It is quite difficult to achieve this selectivity, as well as other crucial qualities including potency, solubility, metabolic stability, and membrane permeability. The type of the target also substantially affects the degree of difficulty; some targets have extremely difficult binding sites, which makes the development of a drug-like yet effective molecule a big challenge.
This study combines several computational techniques, as well as rational drug design and synthesis, to enhance the process of drug discovery. The various computational techniques mentioned earlier are used to elucidate the binding mechanism of novel inhibitors, identify new drug candidates, and explain the mechanism of previously unknown protein-protein and ligand-protein interactions. By utilizing these techniques, the study successfully sheds light on the molecular mechanisms behind drug interactions and provides valuable insights into the design of new drug candidates.

목차 (Table of Contents)

• Part 1. 4-Anilinoquinazoline-based Benzenesulfonamides as Nanomolar Inhibitors of Carbonic Anhydrase Isoforms I, II, IX, and XII: Design, Synthesis, In-vitro, and In-silico Biological Studies
• 1. Introduction 2
• 2. Materials and methods 9
• 2.1. Chemistry 9
• 2.1.1. General 9
• 2.2. Carbonic anhydrase inhibition study 13
• 2.3. Molecular docking study 14
• 3. Results and discussion 15
• 3.1. Chemical synthesis 15
• 3.2. Carbonic anhydrase inhibition study 17
• 3.3. Molecular docking study 20
• 4. Conclusion 24
• 5. References 25
• Part 2. Identification of potent hDHODH Inhibitors for Lung Cancer via Virtual Screening of a Rationally Designed Small Combinatorial
• 1. Introduction 34
• 2. Results and discussion 37
• 2.1. Design of the small virtual combinatorial library 37
• 2.2. Screening of the virtual library 39
• 2.3. Chemistry 40
• 2.4. Biological Evaluation 42
• 2.4.1. WST-1 cell viability assay 42
• 2.4.2. hDHODH evaluation 44
• 2.5. DFT calculations 45
• 2.6. Molecular docking 47
• 2.7. MD simulations 49
• 2.8. MM-GBSA calculations 53
• 3. Conclusion 54
• 4. Methodology 55
• 4.1. Chemistry 55
• 4.2. Biological evaluation 59
• 4.2.1. WST-1 cell viability assay 59
• 4.2.2. hDHODH evaluation 60
• 4.3. DFT calculations 60
• 4.4. Molecular docking 61
• 4.5. MD calculations 61
• 4.6. MM-GBSA Calculations 62
• 5. References 63
• Part 3. Machine Learning-Based Approach to Developing Potent EGFR Inhibitors for Breast Cancer; Design, Synthesis, and In vitro Evaluation
• 1. Introduction 72
• 2. Results and discussion 76
• 2.1. Machine Learning Models of EGFR and bioactivity prediction application 76
• 2.1.1. EGFR inhibitors dataset construction and organization 76
• 2.1.2. Machine learning models development, evaluation, and application generation 77
• 2.2. Rational design and activity prediction of novel EGFR inhibitors 81
• 2.3. Chemistry 82
• 2.4. Biological evaluation 85
• 2.4.1. MTT assay 85
• 2.4.2. EGFR assay 87
• 2.4.3. Analysis of the cell cycle distribution 88
• 2.4.4. Apoptosis study 90
• 2.5. Molecular Docking 93
• 3. Methodology 96
• 3.1. Machine Learning Models of EGFR and bioactivity prediction application 96
• 3.1.1. Data set preparation and descriptors generation 96
• 3.1.2. QSAR Model generation 97
• 3.1.3. Web Application development 98
• 3.2. chemistry 98
• 3.2.1. General procedure for synthesis of compounds 2 99
• 3.2.2. General procedure for synthesis of compound 3 99
• 3.2.3. General procedure for synthesis of compound 4 99
• 3.2.4. General procedure for synthesis of compounds 5 100
• 3.2.5. General procedure for synthesis of compounds 7a–b 100
• 3.2.6. General procedure for synthesis of compounds 8a–b 100
• 3.2.7. General procedure for synthesis of compounds 9, 10a–e 100
• 3.2.8. General procedure for synthesis of compounds 11a-j 101
• 3.2.9. General procedure for synthesis of compounds 12 101
• 3.3. Biological evaluation 109
• 3.3.1. Cell culture 109
• 3.3.2. MTT assay 109
• 3.3.3. EGFR assay 110
• 3.3.4. Analysis of the cell cycle distribution 110
• 3.3.5. Apoptosis analysis 111
• 3.3.6. Statistical analysis 112
• 3.4. Molecular docking 112
• 4. Conclusion 113
• 5. References 114