Multiplex PCR을 이용한 가공식품 내의 유전자 재조합 옥수수와 파파야의 검출 = Detection of Genetically Modified Maize and Papaya in Processed Foods using Multiplex PCR

국문 초록 (Abstract)

유전자 재조합 작물은 재조합 DNA 기술을 통하여 발전해왔다. 최근 전 세계 식품 시장에서는 유전자 재조합 기술에 의해 식품이 생산되어 왔다. 유전자 재조합 작물의 표시제를 시행하기 위해서는 도입된 유전자를 검출할 수 있는 event-specific 검출 방법의 정립은 반드시 필요하다. 본 연구에서는, 가공식품 내의 유전자 재조합 옥수수를 모니터링하기 위하여 4개 국가(한국, 미국, 일본, 중국)로 부터 옥수수 가공식품을 구입하였다. 가공식품의 genomic DNA는 silica spin column kit 를 이용하여 추출하였다. Mutliplex PCR법은 한 번의 반응으로 4개의 유전자 재조합 옥수수를 동시에 검출할 수 있도록 확립하였으며, event-specific primer는 4개의 유전자 재조합 옥수수 (MON88017, MIR162, LY038 and Event 3272)를 각각 구별할 수 있도록 제작하였다. PCR을 통해 증폭된 산물은 agarose gel로 확인하였다. 그 결과, 옥수수의 내재유전자(zSSIIb)는 모든 가공식품 시료에서 확인을 할 수 있었고 몇몇 가공식품에서는 유전자 재조합 옥수수가 혼입되어 있음을 알 수 있었다.

우리나라에 unapproved GMO인 GM papaya event 55-1 에 대한 생과일과 가공식품에서 혼입여부를 확인하기 위해 정성 PCR 분석법을 개발하였다. 우선 papaya의 endogeneous gene 인 papain 에 특이적인 primer(papain SS11F/R) 쌍을 제작하여 파파야를 포함한 13개의 작물에 대하여 PCR을 수행한 결과 파파야에 특이적으로 증폭되는 것을 확인하였다. 또한, GM event 55-1 파파야의 genome과 T-DNA flanking region 사이를 증폭시켜 다른 파파야 품종과 구별할 수 있도록 제작한 event-speicific primer(LB 55-1 SS3F/R) 쌍은 다른 GM event 13 종과 event 55-1을 함께 PCR을 수행한 결과 55-1 에만 특이적으로 증폭하는 것을 확인하였다. 이 두 primer 쌍을 이용하여 GM 파파야인 event 55-1의 duplex PCR을 확립하였고, 이를 파파야 생과일과 가공식품인 건파파야와 통조림에 적용하여 미승인 GMO 모니터링에 활용할 수 있도록 하였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Genetically modified (GM) crops have been developed through the recombinant DNA technology. In recent years, foods have been produced by genetic engineering technology on the world food market. To execute labeling and traceability requirement of GM organism for trade and regulation, it is essential to develop an event-specific detection method for monitoring the presence of transgenes. In this study, to monitor GM maize in processed foods, we purchased various samples from 4 countries (Korea, United States, Japan and China) such as snack, soup, sweet corn and bread. The genomic DNA was extracted from processed foods with a silica spin column kit. A multiplex polymerase chain reaction (PCR) method was developed to simultaneously detect 4 events of GM maize within a single reaction. The event-specific primers were used to distinguish the following 4 events of GM maize (MON88017, MIR162, LY038 and Event 3272). Amplified products could be discriminated by agarose gel based on their different lengths. The results indicate that endogenous gene (zSSIIb) was detected in all samples, and we also detected some GM maizes in several processed foods.

A qualitative PCR analysis using duplex PCR was developed to detect genetically modified (GM) papaya event 55-1, an unapproved genetically modified organism (GMO) in Korea out of fresh papaya and papaya processed foods. The PCR product, using a set of primers specific to papain, an endogenous gene in papaya was obtained only from papaya genomic DNA, indicating the gene is specifically encoded on the genomic DNA of papaya. . The primer pair (papain SS11F/R) with 108 bp amplicon was used for amplification of the papaya endogenous gene, papain and no amplified product was observed from 13 different plants as templates. Moreover, another qualitative PCR using an event-specific primer pair was capable of specifically amplifying the target region of GM event 55-1 among fourteen GM events. For the qualitative PCRs, the event-specific primer pairs(LB 55-1 SS3F/R) were constructed with 150 bp amplicon size. A Duplex PCR using the two primer pairs was developed to detect GM papaya event 55-1, elucidating that five fresh papayas from markets were GM event 55-1.
We applied this duplex PCR method for detect fresh fruit and GM papaya in processed foods. The results showed that there are no GM papaya in processed foods and the developed duplex PCR method may be applied to monitor and detect unapproved GMO in papaya and its processed foods such as dried or canned papaya.

목차 (Table of Contents)

• 제1 장 Multiplex PCR을 이용한 가공식품 내의 유전자 재조합 옥수수의 검출
• Abstract ………………………………………………………………………… 2
• Ⅰ.서론 ……………………………………………………………………………… 4
• Ⅱ.재료 및 방법 ………………………………………………………………… 6
• 1. 시료………………………………………………………………………………………… 6
• 2. Genomic DNA 추출 ………………………………………………………………… 8
• 3. Oligonucleotide Primers…………………………………………………………… 9
• 4. Polymerase Chain Reaction(PCR) ……………………………………………… 11
• Ⅲ.결과 및 고찰 ………………………………………………………………… 12
• 1. Multiplex PCR의 검출한계 ………………………………………………………… 12
• 2. 가공식품에 대한 multiplex PCR…………………………………………………… 14
• (1) 한국 가공식품 29 종에 대한 multiplex PCR…………………………… 14
• (2) 미국 가공식품 20 종에 대한 multiplex PCR…………………………… 17
• (3) 일본 가공식품 20 종에 대한 multiplex PCR…………………………… 19
• (4) 중국 가공식품 10 종에 대한 multiplex PCR…………………………… 21
• Ⅳ. 결론 ……………………………………………………………………………………… 23
• Ⅴ. 참고문헌 ………………………………………………………………………………… 25
• 제2 장 Duplex PCR을 이용한 국내 미승인 유전자 재조합 파파야 및 가공식품의 검출법
• Abstract …………………………………………………………………………29
• Ⅰ.서론 …………………………………………………………………………31
• Ⅱ.재료 및 방법 ………………………………………………………………… 33
• 1. 시료 ………………………………………………………………………………………33
• 2. Genomic DNA 추출 ………………………………………………………………… 34
• 3. Oligonucleotide Primers…………………………………………………………… 35
• 4. Polymerase Chain Reaction(PCR) ……………………………………………… 36
• 5. DNA 염기서열 분석 ………………………………………………………………… 37
• Ⅲ.결과 및 고찰 ………………………………………………………………… 38
• 1. 파파야의 내재 유전자papain에 대한 특이성 확인…………………………… 38
• 2. Event 55-1 의 event-specific primer 에 대한 특이성 확인……………… 40
• 3. 추출한 genomic DNA pattern 분석……………………………………………… 42
• 4. Duplex PCR의 검출한계…………………………………………………………… 44
• 5. 생과일 11종, 가공식품 5종에 대한 duplex PCR……………………………… 46
• Ⅳ. 결론 ……………………………………………………………………………………… 48
• Ⅴ. 참고문헌 ………………………………………………………………………………… 49