Expression of antioxidant enzymes in H4IIE cells infected by retrovirus containing GFP : GFP 표지 retrovirus에 감염된 H4IIE 세포에서의 항산화 효소 발현

주홍매 Graduate School Chungnam National University 2006 국내석사

Retrovirus를 이용한 형질전환 기술은 사람의 유전자 치료에 사용되고 있다. 유전자 치료에 사용되는 retrovirus vectors에 대해 사람의 조혈줄기 세포에서 retrovirus vectors의 결합에 의한 백혈병 위험성에 대해서 제기되고 있다. 그러나 retrovirus를 이용한 형질전환 세포에서의 항산화 효소 변화에 대해서는 알려진 바가 없다. 본 실험의 목적은 Green fluorescent protein (GFP)로 표지된 retrovirus에 감염된 H4ⅡE 세포에서의 산화제에 대한 항산화 능력을 평가하는 것이다. 정상 H4ⅡE 세포와 비교하여 retovirus의 감염으로 인한 H4ⅡE 세포에서의 glutathione (GSH)과 malondialdehyde (MDA)의 함량과 라디칼 제거 능력에는 유의성 있는 변화가 나타나지 않았다. 그러나 H_(2)O_(2) 와 t-BHP에 대한 반응성에서는 차이가 관찰되었다. H_(2)O_(2) 처리에 의한 세포독성과 GSH의 고갈, MDA의 상승에 대해서 형질 전환된 H4ⅡE 세포가 더 높은 저항성을 나타내었다. 반면에 t-BHP 처리에 의한 세포독성과 GSH의 고갈, MDA의 상승에 대해서는 형질 전환된 H4ⅡE 세포가 더 낮은 저항성을 나타내었다. 형질 전환된 H4ⅡE 세포에서의 항산화 효소 단백질들(glutamylcysteine ligase, superoxide dismutase Ⅰ, superoxide dismutase Ⅱ, catalase, glutathione peroxidase Ⅰ, pi-class glutathione S-trasferase)의 유의성 있는 변화는 없었다. 그러나 alpha-class glutathione S-trasferase (alpha-class GSH)는 2.5배 증가하였다. 반면에 GSH reductase (GR)은 78% 감소하였다. 위 결과들은 GFP 표지 retrovirus의 감염으로 인해 H4ⅡE 세포에서 항산화 효소발현이 변했음을 의미한다. 본 실험에서 alpha-class GST와 GR의 발현 변화는 형질 전환된 H4ⅡE 세포와 정상 H4ⅡE 세포에서의 산화제에 대한 다른 반응성에 기인한 것으로 제안된다. Retroviral transgenic technology is frequently used for human gene therapy. The leukemogenic risk of integrating retroviral vectors in hematopoietic stem cell has raised safety concerns for the use of integrating gene transfer vectors for human gene therapy. There have been no reports for changes in antioxidant defense system in transgenic cells infected by retrovirus. In this study, we evaluate the antioxidant capacity against oxidant in H4ⅡE cells infected by retrovirus containing green fluorescent protein (GFP). Contents of glutathione (GSH) and malondialdehyde (MDA), and radical scavenging capacity were not changed by infection with retrovirus. However, transgenic H4ⅡE cells showed different response to H_(2)O_(2) or tert butylhydroperoxide (t-BHP) compared with normal H4ⅡE cells. Transgenic H4ⅡE cells exhibited significantly higher ability resistant to cytotoxicity and GSH depletion and MDA elevation induced by H_(2)O_(2) compared with normal H4ⅡE cells. In contrast transgenic H4ⅡE cells showed significantly lower ability resistant to cytotoxicity and GSH depletion and MDA elevation induced by t-BHP compared with normal H4ⅡE cells. Expression of antioxidant enzymes (glutamylcysteine ligase, superoxide dismutase Ⅰ, superoxide dismutase Ⅱ, catalase, glutathione peroxidase Ⅰ and pi-class glutathione S-transferase) in transgenic H4ⅡE cells was not significantly altered. Alpha-class glutathione S-transferase (alpha-class GST) protein levels in transgenic cells increased about 2.5 fold relative to levels monitored in normal H4ⅡE cells. In contrast glutathione reductase (GR) protein levels declined to 78% of levels monitored in normal H4ⅡE cells by infection with retrovirus. These results show that the expression of antioxidant enzymes is changed in H4ⅡE cells by infection with retroviral vector containing GFP. The present study suggests that alteration of alpha-class GST and GR expression may attribute to different response to oxidants between transgenic and normal H4ⅡE cells.

Identification and classification of endogenous retroviruses in the canine genome

조혜인 건국대학교 대학원 2010 국내석사

The purpose of this study was to identify the endogenous retrovirus (Benachenhou, Jern et al., 2009) sequences in the dog genome. Pooled genomic DNA isolated and mixed with equal amounts from 10 dogs was subjected to PCR with degenerate primers that targeted to amplify the retroviral pro/pol region. Sequence analysis of 120 clones obtained by PCR showed that 81 clones were of retroviral origin. Phylogenetic analysis based on the amplified products showed that the entire amplified dog ERVs (DERV) belonged to gammaretrovirus. Subsequent screening of the dog genome database by in silico analysis allowed us to identify additional gamma and beta DERVs which were unidentified from PCR identification and to characterize full-length DERV elements. Phylogenetic analysis using the protease (PR) and the reverse transcriptase (RT) regions of the combined PCR amplified and in silico derived DERV sequences resulted in identifying 8 DERV β and 18 DERV γ families. The in silico analysis of the pro/pol related DERV elements using the canine genome sequencing results (CanFam2.0) showed their chromosomal coordinates, integrated length, LTR length and 5’ and 3’ LTR sequence identity. The average length of DERV β and γ retroviruses were 6,400bp and 6,391bp nucleotide-long, respectively. Our result shows that the canine genome harbors approximately 1Mb (0.05 %) of endogenous retroviral sequences which is much smaller than amount of ERVs (8%) reported for the human genome. The chromosomal distribution of DERVs was variable among chromosomes. We identified only two β and twelve DERV γ retroviral sequences which maintained completeness in structure (5’-LTR-gag-pro-pol-env-3’-LTR). Calculation of proviral ages from two most abundant gamma and entire beta retroviruses suggested that DERV γ1 and DERV γ2 integrated into the canine genome from 1.28 to 17.49 and from 0.57 to 15.0 million years ago (MYA). The age of DERV βs were from 0.18 to 11.72 MYA. In conclusion, here we reported the results of a genome scale study on the canine endogenous retroviruses. Our study is the first report to analyze ERVs in the canine genome and classify them into the family level. 본 연구는 개의 게놈 내에 존재하는 내인성 레트로바이러스 (ERV)를 찾아내어 구조적, 분자적 특징을 밝히고 ERV에서 가장 보존적인 Pro/Pol 유전자를 기준으로 개의 ERV를 그룹(Family)단위로 분류하는데 목적이 있다. 10마리 개에서 추출한 genomic DNA를 같은 양으로 섞은 시료에서 Degenerative PCR 기법을 이용하여 개의 내인성 레트로바이러스의 pro/pol 지역을 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물을 클로닝 한 뒤 시퀀싱을 하여 총 120 개의 클론을 확보하였고 그 중 81개가 레트로바이러스에 기원한 시퀀스였다. 계통발생분석법(Phylogenetic analysis)으로 이미 알려진 다양한 종의 내인성 레트로바이러스 시퀀스와의 비교를 통해 증폭된 개의 레트로 바이러스 시퀀스는 모두 감마 레트로바이러스에 속하는 것을 확인했다. 생명정보학 분석기법을 이용하여 개의 게놈을 분석하여 PCR 기법으로 발굴되지 않았던 감마 레트로바이러스 및 베타 레스로바이러스도 확보하였다. 그 결과 175개의 pro/pol 지역 연관 개 내인성 레트로바이러스 시퀀스를 발굴하였다. 개의 게놈 DNA에서 증폭한 내인성 레트로바이러스 염기서열들과 인실리코 분석에서 찾아낸 염기서열들을 통합하여 계통발생분석기법으로 서열보존성이 높은 지역인 PR-RT 지역에 대한 비교분석을 실시하였다. 최종적으로 8개의 DERV 베타 그룹과 18개의 DERV 감마 그룹(family)이 분류되었다. 2005년 발표된 개의 게놈 시퀀싱 결과(CanFam2.0)에서 인실리코 분석기법을 통해 확보된 pro/pol 지역 연관 개 내인성 레트로바이러스 시퀀스 각각에 대하여 염색체상 위치, 염기서열 길이(bp), 5’-와 3’-LTR의 길이(bp), 그리고 5’-와 3’-LTR 서열간의 유사성 일치 비율(%)을 정리하였다. 평균적으로 DERV 감마는 6,400bp, 그리고 DERV 베타는 약 6,391bp의 크기를 나타내었다. 결과적으로 현재까지 염기서열 분석이 98% 완료된 2,400Mb의 개 게놈상에 약 1Mb (0.05%)의 감마와 베타 내인성 레트로바이러스가 존재하며 이는 인간 ERVs가 휴먼게놈의 약 8 %를 차지한다고 알려진 것에 비하여 상대적으로 적은 비율이다. 염색체상 분포를 조사한 결과 개의 내인성 레트로바이러스 시퀀스는 38개의 상염색체와 X 염색체 상에 불규칙하게 삽입되어있다. 하위 구조 분석(substructural analysis)에서는 pro/pol DERV가 서로 다른 다양한 하위 구조의 조합을 가지고 있었다. 12개의 DERV 감마 시퀀스와 2 개 DERV β시퀀스만이 5’-long terminal repeat (LTR)-gag-pro-pol-env-LTR-3’ 이라는 전형적인 레트로바이러스의 특징을 나타내었다. 개 게놈내의 내인성 레트로바이러스들의 게놈진화적 측면의 이해를 위하여 DERV γ 그룹 중 가장 빈도수가 높은 DERV γ1 및 DERV γ2 그리고 DERV β 에 대한 프로바이러스 삽입 시점 예측을 실시하였다. DERV γ2와 DERV γ1는 1천 7백만 년부터 57만년 사이, 그리고 DERV β는 최대 1천 1백만년전에 삽입된 것으로 나타났다. 본 연구는 개의 내인성 레트로바이러스에 관한 게놈 수준의 연구로, 개의 게놈내의 내인성 레트로바이러스에 대한 분석과 그룹(family)별 분류에 대한 최초의 보고이다.

Pseudotyped retroviral vector를 이용한 유전자 형질도입율 향상

송재진 연세대학교 대학원 2001 국내박사

원하는 유전자를 효율적으로 표적세포에 전달하기 위한 운반체로써 현재 가장 빈번하게 사용되고 있는 것 중의 하나가 레트로바이러스 운반체이다. 하지만 이는 형질도입의 효율이 낮고, 사람혈청에 의해 쉽게 비활성화되는 단점 등이 부각되면서 그 사용이 점차 제한되어지고 있다. 본 연구는 이러한 레트로바이러스의 단점을 이해하고 보완하여 유전자 형질도입율을 개선함을 목표로 하였다. 이를 위하여 본 연구는 먼저 레트로바이러스 감염에 의한 유전자 형질도입의 일차적 관문에 결정적인 영향을 주는 바이러스 막단백질의 구성을 변경시키거나, 다양한 종류의 화학적 첨가제를 사용하여 사람 암세포주들에 대한 유전자 형질도입 효율을 증대시키고자 하였다. 형질 변형된 레트로바이러스의 유전자 전달효율을 알아보기 위하여 우선 murine leukemia virus (MLV)를 기본골격으로 하는 pBabepuro 레트로바이러스 벡터에 LacZ 유전자가 도입된 pBabepuro/LacZ 레트로바이러스 벡터를 제작하였다. 다음으로 서로 다른 성질의 막을 가진 레트로바이러스를 생산해낼 수 있는 PA317, PG13, FLYRD18, Bing 및 293T/G/GP 포장세포주를 이용하여 pBabepuro/LacZ 바이러스를 생산하였다. 또한 양이온 리포솜을 포함한 여러 가지 화학적 첨가제의 도입 및 초원심분리로 바이러스를 농축시킨 후 각종 바이러스들의 유전자 전달의 효율성 증대 유무를 비교하였다. 그리고 레트로바이러스의 단점중의 하나인 비분열세포에 대한 낮은 유전자 형질도입율을 보완하기 위하여 MLV 대신 feline immunodeficiency virus (FIV) 벡터를 개발하여 그 특성을 규명하였다. FIV 벡터는 포장세포주의 도움없이 3 plasmids (포장용 플라즈미드, transfer 벡터, VSV-G를 발현하는 플라즈미드) cotran sfection에 의하여 vesicular stomatitis virus (VSV)의 G 단백질을 막단백질로 가지는 FIV 벡터를 제작하였다. 실험결과 레트로바이러스로부터 유래한 막단백질을 가지는 레트로바이러스는 polybrene 등의 첨가물이 있어야만 세포내로 삽입될 수 있음을 확인하였다. 이러한 화학적 첨가물중 특히 리포솜이 우수한 효과를 보여주었으며, 특히 PG13/LacZ 바이러스의 경우 Lipofectamine이 존재하면 5 moi(multiplicity of infection)에서 SK-Hep 1이나 U251-N 세포 등에서 첨가물이 없는 경우에 비하여 유전자 형질도입율이 100배 이상 증가하여 전체세포의 30%가 감염되는 효과를 보였다. 한편, VSV-G를 막단백질로 가지는 293T/G/GP/LacZ 바이러스는 어떤 다른 형태의 레트로바이러스보다 개선된 유전자 형질도입율을 보여 주었으며, 특히 뇌암세포주에서 유전자 형질도입율이 뛰어났다. VSV-G를 막단백질로 가지는 바이러스의 가장 큰 장점은 화학적 첨가물의 도움없이 효과적으로 세포를 감염시킬 수 있었다는 것이다. 이 결과를 바탕으로 in v ivo에서의 유전자 형질도입율을 조사한 결과, 뇌암세포가 이식된 쥐에서 VSV-G 레트로바이러스를 단독으로 처리하는 경우 유전자 형질도입율이 10%에 도달하였다. 더불어 VSV-G 레트로바이러스에 의한 유전자 전달효율을 결정하는 주된 인자는 VSV-G 막단백질에 대한 수용체로 알려져 있는 phosphatidylserine 함량과 세포증식율에 기인하는 것을 알 수 있었다. 한편, 본 연구에서 자체적으로 제작한 FIV 벡터는 MLV를 근간으로 하는 기존의 레트로바이러스와는 달리 비분열세포와 분화된 세포에서 상대적으로 우수한 유전자 형질도입율을 보여주었다. 특히 바이러스의 vif 유전자내에 미성숙 종결코돈을 삽입시킨 돌연변이 형태의 FIV는 세포에 대한 독성이 상당부분 제거되었음을 확인할 수 있었다. 또한 VSV-G를 막단백질로 가지는 MLV 또는 FIV는 초원심분리를 통해 고역가로 손쉽게 농축할 수 있으며 이러한 처리는 바이러스의 유전자 전달 효율을 더욱 향상시킴을 확인하였다. 따라서 이상의 결과들로부터 VSV-G를 포함하는 MLV 근간의 레트로바이러스의 in vivo 형질도입 우수성을 검증할 수 있었고, MLV 대신 FIV를 근간으로 하는 레트로바이러스는 기존의 레트로바이러스에 비해 비분열세포 및 분화세포에 유전자를 효율적으로 전달해줌을 알 수 있었다. A retroviral vector constructed from marine leukemia virus (MLV) can only express transgenes in the cells undergoing mitosis, indicating the suitability as a delivery vehicle for cancer gene therapy. However, the retroviral vector, one of the most popular gene transfer vehicle, has recently experienced the limited usage due to its poor transduction efficiency in a variety of human cells. To overcome this drawback, we attempted to enhance the transduction efficiency by employing a variety of retroviral packaging cell lines and additive chemicals. For the complementation of low transduction efficiency of retrovirus to nondividng cells, we also explored the potential of FIV vector by modifying the packaging and transfer constructs. To evaluate the transduction efficiency, we constructed a pBabepuro/LacZ encoding LacZ as a reporter gene driven by the MLV LTR. Various kinds of retroviruses were produced by transfecting pBabepuro/LacZ into various packaging cell lines, such as PA317, PG13, FLYRD1S, Bing or 293T/G/GP. For the generation of VSV-G pseudotyped FIV, 3 plasmids (packaging plasmid, transfer vector, VSV-G gene containing plasmid) were cotransfected into 293T cells. The addition of cationic chemicals exerted the most striking effect on the transduction efficiency with PG13-derived retrovirus. Especially, the transduction efficiency in SK-Hepl or U251-N was substantially increased by the addition of Lipofectamine during the viral infection. 293T/G/GP/LacZ virus, a VSV-G pseudotyped retrovirus, was superior in transduction efficiency in most cancer cells, particularly in brain tumor cells, compared to that of other retroviruses, such as PA317-, PG13 or Bing-derived. In addition, VSV-G retrovirus could efficiently transduce human cancer cells regardless of the absence of chemical additives. Transduction efficiency of VSV-G retrovirus was mainly influenced by cell growth rate and phosphatidylserine expression level on the plasma membrane of target cells, which indicating both the relative growth rate and phosphatidylserine level were major determinants of transduction efficiency. Based on these results, we chose the VSV-G pseudotyped retrovirus to evaluate the transduction efficiency in brain tumor model. An average of 10% gene expression was routinely obtained exclusively in tumor mass when the concentrated virus was directly administrated to pre-established brain tumors in animal models. Modified FIV vector of of gene mutated with premature termination was proven to be much less cytopathic to target cells and relatively superior in transduction efficiency to MLV-derived retrovirus in nondividing or differentiated cells. Taken together, these results suggested that the transduction efficiency of retrovirus in human cancer cells can be certainly improved when an appropriate viral vector or chemical additive is chosen.

DIRECT TRANSFER OF RETROVIRUS-PRODUCING CELLS INTO GERM CELL-DEPLETED TESTIS IN VIVO : 레트로바이러스 생산세포의 정자생성세포가 결여된 정소내 직접주입

박희대 Graduate School of Agriculture and Animal Science, 1997 국내박사

본 연구는 외래유전자를 정소조직내에 도입함으로서, 성숙정자는 물론 정자생성근원세포인 정조세포에 직접 유전자를 감염시킴으로서 형질전환동물을 생산하기 위하여 실시하였다. 공시된 동물로는 수컷 흰쥐, 돼지, 소를 사용하였으며, 이들 각 동물의 정소조직에 외래 유전자를 도입하기 위하여 3종류의 레트로바이러스벡터를 작성 하였다. 이들 레트로바이러스에 의한 표적세포의 감염유무는 체외에서 이들 바이러스를 생산하는 세포와 표적세포를 공배양후, 외래유전자의 도입유무와 발현여부를 Southern blot분석과 X-gal 염색에 의하여 확인하였다. 그 결과, 이들 벡터는 유의하게 높은 효율로 외래유전자를 웅성세포에 도입하였으며, 또한 이들 유전자는 모든 표적세포에서 높은효율로 발현되었다. 따라서, 이들 세포를 직접 정소 조직내에 도입한 결과, 이들 세포는 생체내의 정자생성세포의 약 15%를 감염하였으며, 성숙된 정자세포의 약 39%가 외래 유전자를 가지는 것으로 slide-PCR에 의하여 확인되었다. 또한 레트로바이러스를 생산하는 세포를 흰쥐의 정소에 도입한 경우, 정자를 통하여 난자내로 외래유전자를 도입하였으며, 이들 수정란을 이용한 형질전환 동물의 생산효율은 최저 2% 에서 최고 100% 의 범위였다. 따라서, 본 연구결과는 레트로바이러스를 생산하는 세포를 직접 정소내로 투입하는 기법은 형질전환가축의 생산에 있어 매우 유용한 방법으로 사용가능함을 시사하였다. The objective of this study was designed to produce transgenic animals by the transfection of male stem cells, spermatogonia, as well as matured sperm with foreign DNA by means of direct gene transfer into testis in vivo. To study the integration and expression of transgene in the adult rat, boar, and bull testis in vivo, three kinds of retrovirus vector containing a bacterial lacZ gene and pHook gene under the control of two different internal promoter were used as a marker. The retrovirus vector was first tested on rat and boar male germ cells by co-culture on retrovirus -producing cells in vitro. This results showed that it efficiently expressed transgene in testicular somatic cells and male gonic cells. Therefore, the possibility of in vivo to the spermato-genic cells of the rat, boar, and bull testes was further confirmed by the fact that transfected testis resulted in transgenic offspring. This result suggested that injection of retrovirus -prodcuing co into germ cell depletion testis can be used as a feasible tools for the production of transgenic livestock.

레트로바이러스를 이용한 Cardiac Ankyrin Repeat Protein 유전자 전달과 그 효능 분석

신성호 단국대학교 대학원 2011 국내석사

최근 식생활의 서구화 및 노령인구의 증가로 인해 죽상경화증이 주 원인이 되어 혈류의 흐름이 원활하지 못하여 생기는 허혈성 질환 (ischemic disease)의 발생빈도가 지속적으로 증가하는 추세이다. 이런 허혈성 질환의 치료에는 약물요법, 스탠트 시술 및 동맥 수술 등이 있으나 항상 시행할 수 있는 것은 아니고 또 이런 기존 치료법을 적용할 수 없는 소위 ‘no-option patients’에게는 새로운 치료법의 개발이 절실한 실정이다. 유전자치료는 기존 치료법의 한계를 극복할 수 있는 새로운 치료법으로 기대되고 있으며, 이에 본 연구에서는 레트로바이러스벡터를 이용한 허혈 개선 유전자 전달연구를 수행하였다. Cardiac ankyrin repeat protein (CARP)은 혈관신생을 촉진시킬 수 있는 유전자로 주목받고 있다. CARP는 cardiogenesis시와 허혈 부위에서 과량발현되고 wound healing, tissue repair와 neovascularization에도 관여하며, p53과 함께 cell cycle을 조절한다고 알려졌다. CARP는 N-terminal에 nuclear localization signal을 가지고 있으며 protein-protein interaction에 중요한 4개의 ankyrin repeat domain을 C-terminus에 갖고 있어 transcription factor로서도 작용할 것으로 생각되고 있다. 현재 cell proliferation 및 survival에서의 CARP의 역할과 허혈모델에서의 기능은 거의 밝혀지지 않은 바, 레트로바이러스를 이용한 human CARP 유전자의 전달을 통하여 혈관신생의 지표들을 증가시킬 수 있는지를 조사하였다. 재조합 레트로바이러스 생산을 위하여 gag와 pol을 발현하는 GP293 packaging cell에 pVSV-G env vector와 pLPCX retroviral vector를 co-transfection시키는데, 그 비율을 0.1:1의 molar ratio로 최적화하였다. 이렇게 VSV-G protein으로 pseudotyping되어 생산되는 재조합레트로바이러스는 물리적인 안정성이 증가되고 감염력이 향상되는 것으로 알려져 있다. 이 pseudotyped retrovirus의 일회감염성(single-hit infection)을 확인하기 위해 LPC-nlsLacZ 혹은 LPC-eGFP 바이러스를 NIH3T3세포에 1차 감염시킨 후 새로운 배지로 갈아주고 얻어진 conditioned medium으로 2차 감염을 시도했을 때 아무런 transgene의 발현을 볼 수 없어 자가 복제가 가능한(replication-competent) retrovirus가 생산되지 않았음을 확인하였다. 또 eGFP reporter를 이용하여 LPC기반 레트로바이러스에 의한 eGFP 유전자의 발현지속기간을 조사한 결과, 감염 후 3달까지 eGFP를 발현시킴을 확인하였다. LPC-hCARP 레트로바이러스를 감염시킨 NIH3T3 세포에서 CARP 단백질의 양이 증가하는 것을 관찰하였으며, cell proliferation 증가여부를 레트로바이러스로 감염시킨 후 3일간의 발현시간을 준 뒤 WST-1 assay로 측정하였을 때, LPC-hCARP 레트로바이러스를 처리한 세포에서 proliferation이 유의하게 증가함을 확인하였다. 또한 real-time cell analyzer를 사용하여 세포의 doubling time을 조사한 결과, LPC-hCARP 레트로바이러스를 처리한 군의 doubling time이 대조군에 비해 줄어들었음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과들은 VSV-G env로 pseudotyping된 LPC기반 레트로바이러스와 CARP 유전자를 이용하여 효과적인 허혈성 질환 유전자 치료범을 개발할 수 있음을 시사하여 준다. Incidence rate of ischemic diseases are rising rapidly these days with increased western diet and aging population. Ischemic diseases are caused mainly by atherosclerosis and the constriction or obstruction of blood vessel lead to insufficient blood flow and tissue damage. To develop a better therapeutic modality for no-option patients who are unsuited to conventional therapies, a novel strategy using retrovirus-mediated angiogenic gene transfer was investigated. Cardiac ankyrin repeat protein (CARP) plays a unique role as a transcription factor, which are overexpressed in cardiogenesis and ischemic region. CARP is not only involved in wound healing, tissue repair and neovascularization but also regulates the cell cycle together with p53. CARP is a putative transcription factor that has nuclear localization signal in N terminal and 4 ankyrin repeat domains in C-terminus which mediates protein-protein interaction. Despite these previous studies, the role of CARP in cell proliferation/survival or in ischemic tissue is poorly understood. Here, LPCX-based retroviral gene delivery system was utilized for long-term expression of CARP. Recombinant retrovirus was produced by co-transfection with pVSV-G env and pLPCX retroviral vector into GP293 packaging cell. This recombinant retrovirus was pseudotyped with vesicular stomatitis virus-G (VSV-G) envelope protein to confer two important advantages: (1) increased physical stability including the ability to withstand the shearing forces encountered during ultracentrifugation and (2) their broadened host-cell range. LPC-nlsLacZ and LPC-eGFP viruses were all found to be replication-defective. VSV-G-pseudotyped retrovirus EGFP transgene expression remained stable for 3 months. Transduction with LPC-hCARP increased NIH3T3 cell proliferation with decreased doubling time as measured by WST-1 assay and real-time cell analysis system (RT-CA). This observation is consistent with the increased level of CARP protein in the cells transduced with LPC-hCARP retrovirus. Taken together, these results warrant further study on the angiogenic capacity of LPC-hCARP and suggest that CARP gene therapy could be a viable option for treatment of ischemic diseases in the not so distant future.

Prototype Foamy Virus Integrase의 핵 수송 신호 위치 파악

안덕근 중앙대학교 대학원 2007 국내석사

다른 foamy virus와 마찬가지로, Prototype Foamy Viruse(PFV)는 다른 retrovirus와 구별되는 독특한 morphology, 원형질막보다는 소포체를 통한 방출, 독특한 복제 전략등의 특징들을 갖는다. 생산적인 감염을 위해, foamy virus를 포함하는 retrovirus는 세포안으로 바이러스 입자가 들어간 후 PIC(preintegration complex)라 불리는 큰 핵단백질 복합체로 재구성된다. 대부분의 retrovirus에서, integrase와 viral DNA로 구성되어 있는 PIC는 integrase에 의해 감염된 세포의 세포질에서 숙주 DNA와 integration하는 핵안으로 이동된다. PFV PIC의 핵내 수송에 대한 mechanism은 현재까지는 잘 알려지지 않았다. PFV PIC의 NLS를 결정하는 PFV integrase의 기능적인 잔기와 영역을 확인하기 위하여 PFV integrase의 세부영역과 점돌연변이 시킨것들을 GFP(green fluorescent protein)과 MBP(maltose binding protein)와 융합시켰고, 그들의 핵친화적인 특성을 COS-1 cell상에서 형광현미경을 통해 확인하였다. 그 결과 PFV integrase의 C말단 영역이 강력한 NLS를 갖고 있었고, N말단 영역과 Central 영역은 독립적으로는 융합단백질의 핵 안으로 위치화를 유도하지는 않지만, 두 영역간의 협력활성은 지니고 있음을 확인하였다. 이 외에도 C말단 영역안에 아미노산의 돌연변이를 통한 분석은 308,313,318,324,329번째 arginine 또는 lysine이 PFV integrase의 핵안으로 위치화에 있어서 결정적인 아미노산임을 확인하였다. 게다가 C말단 영역의 NLS작용에 있어서 최소한의 크기는 289~352아미노산까지 필요하고, 341,349,369번째 arginine 또는 lysine은 C말단 NLS에 있어서 보조적인 역할을 한다는 것을 확인하였다. Like other Foamy Viruses, Protype Foamy viruse(PFV) has many characteristics that set it apart from the other well-known retroviruses, including a distinct morphology, budding from the endoplasmic reticulum rather than the plasma membrane and a unique replication strategy. To establish a productive infection, retroviruses including foamy virus are reorganized into a large nucleoprotein complex termed the pre-integration complex(PIC) after entry of the virion into the cell. In many retroviruses, pre-integration complex(PIC) composed of integrase and viral DNA moves from the cytoplasm of the infected cells to the nuclei where viral DNA is integrated into cellular genomic DNA by viral integrase. The mechanism in which prototype foamy virus (PFV) PIC traverses the nuclear envelope remains unknown up to now. To identify the functional residues and domain of PFV integrase that determines nuclear localization of the PIC, various sub-domains and point mutants of the PFV integrase were prepared as green fluorescent protein (GFP) and maltose binding protein (MBP) fusion constructs and their karyophilic properties were investigated in COS-1 cells by fluorescence microscopy. The results showed that the C-terminal region of PFV integrase has strong nuclear localization signal (NLS)and the karyophilic properties of N-terminal and central regions were not individually strong enough to direct localization of the fusion proteins to nuclei, but their cooperative activity for nuclear import was confirmed. In addition subsequent mutational analysis of the amino acids present in the C-terminal region showed that the arginine or lysine residues present at the positions of 308th, 313rd, 318th, 324th, and 329th are critically involved in nuclear localization of PFV integrase. Moreover, it was confirmed that the minimum region in the C-terminal of NLS was from 289th to 352th and the arginine or lysine residues of 341th, 349th, 369th are assistant for C-terminal NLS.

In vitro integration of avian retrovirus

하영미 Tufts University 1990 해외박사

조류에 감염하는 retrovirus를 통하여 retrovirus가 숙주세포의 핵DNA에 들어가는 독특한 integration과정의 분자생물학적 기작을 연구하였다. 이를 위하여 우선 모든 integration과정을 생체밖(in vitro)에서 수행할 수 있는 시스템이 필요하였다. 본 과제는 바이러스 DNA가 있는 세포로 부터 세포 추출물을 만들어내고 세포DNA가 아닌 박테리오파지DNA 또는 plasmid DNA를 사용이 바이러스가 타DNA에 들어갈 수 있는 시스템을 개발하였다. 개발된 in vitro 시스템을 이용 바이러스의 integration 기작을 분석한 결과, 바이러스의 integration 전구체는 기존에 추정되어왔던 구형 DNA 모양이 아니라 선형(linear) DNA임이 밝혀졌다. 또한 바이러스 DNA의 복제과정은 integration과정과 밀접한 관계는 가지고 있었으며, 핵내의 단백질 또는 타겟DNA등이 바이러스의 integration과정을 영향을 미침을 밝혀내었다.

생쥐 간세포에서 siRNA를 이용한 두가지 다른방법에 의한 EGFP유전자의 사일런스 패턴의 비교

최호준 건국대학교 대학원 2005 국내석사

한글초록:RNAi는 transcription 이후 특정 sequence에서 작용하는 유전자 silencing으로 유전자 기능을 조사하기 위해 사용할 수 있는 powerful genetic tool이다. 또한, 다른 gene targeting 방법보다 값싸고, 간편한 방법이다. 본 실험은 특정 유전자를 silencing 시킨 형질전환동물을 생산하기 위한 기본적인 방법을 확립하기 위해 수행되었다. 생쥐 간 세포에서 construct transfection과 virus infection의 두가지 다른 방법으로 생쥐 U6 promotor를 연결시킨 retroviral vector pQCXIN과 pLXIZ를 통하여 siRNA expression을 시킨 후, EGFP 유전자의 silencing 양상을 비교하였고, EGFP 유전자의 발현을 다양한 시간별로 조사하였다. 지속적이고 안정적으로 EGFP를 발현하는 세포주를 생산하기 위해 생쥐 간 세포에 pEGFP-C1 constuct를 도입하였다. 이들 EGFP 발현 세포들에 EGFP siRNA를 발현시키는 retrovirus와 plasmid vector를 도입하였고, EGFP의 발현 정도를 정확히 측정하기 위해 도입 후, 24 시간 동안 3 시간 별로 RT-PCR을 수행하였다. 도입 효율을 비교하면, virus가 plasmid 보다 효율이 더 좋았다. Virus를 infection 시킨 세포에서의 EGFP 발현 정도는 infection 후, 9 시간째부터 유의적으로 감소하였고, vector를 transfection 시킨 세포에서는 transfection 후, 12 시간째부터 유의적으로 감소하였다 (P<0.05). 그러나 두가지의 다른 retroviral vector인 pRNAi와 pLXIZU6에서는 유의적인 차이를 보이지 않았다. 본 실험은 vector와 virus간의 EGFP gene silencing 정도를 비교하기 위한, 그리고 gene silencing이 일어나기 시작하는 시간을 조사하기 위한 첫번째 실험이었다. 본 실험의 결과들은 유전자의 silencing 효과에서 retrovirus를 infection 하는 방법은 vector constuct를 transfection 하는 방법보다 더 효과적이고, 유용하다는 점을 제시하였다 영문초록:RNAi is a process of sequence-specific posttranscriptional gene silencing and is a powerful genetic tool to analyze gene function. In addition, this technique is more inexpensive and simple than other gene targeting methods. This experiment was performed to establish the fundamental protocol to produce the specific gene silenced clone animal. To compare with gene silencing pattern of EGFP in mouse liver cell by two different methods using siRNA, retroviral vectors, pQCXIN and pLXIZ, with mouse U6 promotor were utilized as a construct and a virus. And the level of EGFP expression was investigated at various time after transfectd with constructs and infected with viruses. To produce the cell line continuously expressing EGFP, mouse liver cells were transfected with the pEGFP-C1 construct. These EGFP expressing cells were transfected with the plasmid vector and in vitro packaged retrovirus expressing EGFP siRNA. To measure the level of EGFP expression, RT-PCR was performed in every 3 hours for 24 hours from the time of transfection. When the transfection efficiency was compared between the plasmid vector and the virus, the virus infected cells was higher efficiency of transfection than the plasmid transfected cells. The level of EGFP expression from the virus infected cells was significantly decreased in 9 hours after infection, the level of EGFP expression from the vector transfected cells was significantly decreased and in 12 hours after transfection (P<0.05). However, the levels of EGFP expression between the two different retroviral vectors pRNAi and pLXIZU6 were not significantly different. This study was first experiment to compare the level of EGFP gene silencing between vector and virus, and to detect the start time of gene silencing. Therefore, results from present study suggest that the infection with in vitro packaged retrovirus is more efficient and convenient than the transfection with the retroviral construct in gene silencing effect

파충류에서 분리한 세균과 바이러스의 특성

조연숙 건국대학교 대학원 2010 국내박사

파충류는 다양한 체온의 변화가 특성인 동물로서 포유동물에 비해 체온이 낮은 동물이다. 세균성 질병이나 바이러스성 질병에 감염되면 임상증상의 발현 없이 갑작스럽게 폐사하는 경우가 많다. 그러나 국내에 존재하는 파충류의 세균성 및 바이러스 감염에 관한 연구보고가 드물며 체계적인 수의학적 접근 방법 또한 확립되어 있지 않다. 따라서 멸종 위기 보호종을 진단하고 치료하여 생명을 유지시키는데 커다란 어려움이 있을 뿐만 아니라, 외국에서 유입된 파충류는 국내에서 서식하고 있는 파충류에게 병인체를 전파시키거나, 생태 환경미생물의 변화를 유발할 수 있어 파충류가 보유한 미생물의 특성 및 분포에 관한 자료의 필요성이 요구된다. 그러므로 본 연구에서는 외래종과 국내종이 보유하고 있는 호기성세균과 항생제 내성, 파충류 유래의 인수공통전염병인체 및 바이러스의 특성을 규명하여 기초자료를 제시하고 진단체계를 확립하고자 하였다. 파충류의 구강과 배설강의 호기성 세균(통성 혐기성 세균포함)의 분리 동정을 함에 있어, 변온동물인 파충류의 체온생리 특성을 고려하여 각각의 조건을 37°C에서 18시간, 20°C에서 72시간 배양하여 실험하였고, colony polymerase chain reaction을 활용하였다. 20°C에서 배양한 균주에 대한 항생제 감수성검사를 병행하였으며, 선택 배지를 이용하여 파충류가 보유하고 있는 Salmonella spp.를 검출하였다. 실험을 통하여 분리된 균주는 모두 581개 94종이며 국내종에서 327개, 외래종에서 254개이다. 주요 상재균의 분포는 국내종에서 Serratia spp. 14%, Psychrobacter spp. 10%, Pseudomonas spp. 10%, Staphylococcus spp. 8%, Flavobacterium sp. 7%, Myroides spp. 7%, Proteus vulgaris 5%, Arthrobacter spp. 5%로 나타났다. 외래종에서 Pseudomonas spp. 11%, Proteus spp. 11%, Citrobacter spp. 8%, Escherichia coli 7%, Acinetobacter spp. 6%, Klebsiella spp. 6%, Aeromonas spp. 5%, Stenotrophomonas maltophilia 2%로 나타났다. Hafnia alvei는 국내종에서, Stenotrophomonas maltophilia, E. coli는 외래종에서만 분리되었다. Salmonella spp.의 경우 국내종에서 약 23%가 분리되었으며 국내 동물원에서 사육되는 외래종에서는 약 53%가 검출되었다. 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)을 이용하여 검출된 바이러스의 염기서열을 분석한 결과, 2종류의 도마뱀류에서 Helodermatid adenovirus, 한 마리의 도마뱀에서 Lizard paramyxovirus, 5두의 비단뱀에서 Python moralus endogineous retrovirus가 확인되었으며 그 중 한 마리의 도마뱀에서 adenovirus와 paramyxovirus의 중복 감염이 확인되었다. Python moralus endogineous retrovirus의 경우 바이러스의 상동성은 반입지와 연관성이 없는 것으로 나타났다. 이상의 실험을 통하여 유입지역에 관계없이 외래종 간의 상재균의 분포는 유사하지만 기후가 다른 국내종과 외래종의 분포는 다르다는 것을 알 수 있다. 따라서 파충류의 세균을 검출함에 있어 서식지 환경에 따라 다양한 배양조건이 필요하며 특히 20°C 배양 세균의 동정방법으로 colony PCR이 시간과 노력을 절약하는 가장 효율적인 방법으로 생각된다. 파충류가 보유하고 있는 Salmonella spp. 이외에 Stenotrophomonas maltophilia, Hafnia alvei 등도 인수공통전염병을 유발할 수 있는 것이 확인되었다. 본 연구를 통하여 미생물의 저장소로 알려진 파충류에 관한 수의학적 연구의 필요성과 중요성을 확인할 수 있었다. 따라서 국내 최초 보고되는 본 연구의 결과는 생태환경의 중요한 위치에 있는 파충류에 관한 체계적 연구 기반을 확립하는데 기여하리라 생각된다.

한국인에서 발생한 악성 림프종의 분자생물학적 연구 : 한국인에서 발생한 악성 림프종과 Retrovirus감염과의 관계

김완중 朝鮮大學校 大學院 1995 국내박사

Objectives: The relationship between malignant T-cell lymphoma and retroviral infection was examined in sixty-two cases of non-Hodgkin's lymphoma arising in nodal and extranodal sites to presume the etiologic factors in the pathogenesis of T-cell lymphoma in Korean. Methods: Sixty-two cases of malignant lymphoma were examined with battery of monoclonal and polyclonal antibodies directed to T-cell, B-cell and macrophage-lineage to determine the immunophenotypes. Reverse transcriptase activity were examined by RNA-directed DNA polymerase assay on the 7 cases of T-cell malignant lymphoma, and the pol, env and tax gene region of the HTLV-Ⅰ were examined by polymerase chain reaction(PCR) on 17 cases of B-cell and 7 cases of T-cell malignant lymphoma. Immunohistochemical staining to the gag region(p19 and p21). env region(gp46) and px gene(NCC-PX-1G) of the HTLV-I on the 24 cases of the malignant B- and T-cell lymphoma were performed to elucidate the evidence of HTLV-I infection. Results: There was no evidence of retroviral infection including HTLV-I in examined 7 cases of peripheral T-cell lymphomas and 17 cases of B cell lymphomas. Conclusion: These results suggest that the evidence of retroviral infection as an etiological factor in the pathogenesis of T-cell lymphoma in Korean might be poor.