돼지 흉막폐렴에서 COX-2와 iNOS유전자의 발현에 관한 연구 : Expression of COX-2 and iNOS in swine infected with actinobacillus pleuropneumoniae

조완섭 서울대학교 대학원 2004 국내박사

흉막폐렴에 자연감염된 돼지 폐장에서 COX-2의 발현을 조직내 교잡법과 면역염색법으로 검출하고 감염된 폐장조직에서 COX-2를 발현하는 세포를 확인하고자 하였으며, 흉막폐렴에 자연감염된 돼지 폐장조직에서 iNOS가 실제로 기능하는지를 확인하기 위하여 그 중간산물인 nitrotyrosine, 세포자살과정에 관여하는 것으로 알려진 PARS 유전자, 그리고 iNOS의 발현을 유도하는 것으로 알려진 NF-κB를 검출하고자 하였다. 또한 실험실내 환경에서 정상돼지의 폐장조직에서 폐포대식구를 추출하여 LPS나 싸이토카인에의한 PGE2와 NO의 발현유무와 그 정도를 확인하고자 하였고, 마지막으로는 흉막폐렴균을 자돈에 인공감염시키고 iNOS, COX-2억제제를 조합하여 투여하여 생체내에서 iNOS와 COX-2의 기능을 규명하고자 하였다. 세균배양을 통하여 흉막폐렴으로 확진된 15두의 돼지 폐장조직에서 조직내 교잡법과 면역염색법을 수행하여 COX-2 mRNA와 protein을 검출하였으며, nitrotyrosine, 그리고 PARS에 대한 면역염색을 수행하였다. COX-2에대한 조직내 교잡법과 면역염색수행 결과, COX-2가 기관지와 세기관지 상피세포, 폐포대식구, 호중구, 그리고 type I pneumocyte에서 발현한다는 것을 확인할 수 있었다. COX-2의 발현은 급성일때는 호중구에서 주로 발현하지만 만성으로 진행될수록 폐포 대식구에서 주로 발현된다. 이 실험결과 COX-2에서 생산된 prostanoid가 급성과 만성 돼지 흉막폐렴에서 중요한 병인으로 작용함을 알 수 있었다. 흉막폐렴에 자연감염된 돼지 폐장조직의 폐포강내와 그 주변조직에 존재하는 호중구에서 강한 nitrotyrosine양성반응을 확인할 수 있었다. 이 조직을 연속절편하여 iNOS에 대한 면역염색을 수행하여 세포-세포 사이의 상관관계를 조사하였다. PARS의 발현은 염증반응이 있는 부위에서는 강하게 나타났으며, 정상조직에서는 거의 관찰되지 않았다. Nitrotyrosine과 PARS의 연관성을 검사해본 결과 주로 흉막폐렴 병변부 주위에 존재하는 대식구에서 모두 강하게 발현되는 것을 확인하였으며, 이러한 인자들이 돼지 흉막폐렴의 병인에 중요한 역할을 한다는 것을 짐작할 수 있었다. NF-κB에 대한 면역염색 수행결과 염증세포의 핵내에 강한 양성반응을 확인 할 수 있었으며, 연속절편하여 iNOS와 NF-κB에 대한 면역염색을 수행한 결과 유사한 부위에서 양성반응이 확인되어 NF-κB와 iNOS가 서로 관련되어 있는 것을 확인 할 수 있었으며, NF-κB가 돼지 흉막폐렴에서 iNOS를 활성화 시키는데 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다. 돼지 폐포대식구를 추출하고 배양하여 흉막폐렴균을 접종하였을 때 NO와 PGE_(2)의 유의성있는 증가를 관찰하였다. 또한 IFN-γ는 흉막폐렴균과 협력작용을 하는 것을 알수 있었다. iNOS와 COX-2의 억제제를 처치한 군에서는 iNOS와 COX-2의 발현이 감소하는 것을 관찰 하였으며, 이를 통하여 돼지 흉막폐렴에 대한 치료제 개발에 iNOS와 COX-2억제제를 사용하는것도 검토해 볼 수 있었다. 흉막폐렴균을 돼지에 인공감염시키고 iNOS와 COX-2 억제제를 조합하여 인공감염된 돼지에 접종하고, 그 폐장조직에서 bronchoalveolar lavage를 추출하였다. 추출한 bronchoalveolar lavage에서 NO와 PGE_(2)의 농도를 측정 하였으며, iNOS와 COX-2에대한 면역염색과 조직내교잡법을 수행하여 폐장조직에서 발현 유무와 그 정도를 확인하였다. 돼지 흉막폐렴균을 인공감염한 결과 bronchoalveolar lavage에서 PGE_(2)의 상당한 증가를 확인할 수 있었으며 여기에서 NO가 증가하는 것으로 보아 PGE_(2)와 NO가 서로 밀접한 관계에 있는 것을 짐작할 수 있었다. 뿐만 아니라 폐장의 lesion score를 시간대별로 산출하고, bronchoalveolar lavage에서 측정한 NO와 PGE_(2) 수치를 비교하였을 때 서로가 밀접한 상관관계를 가지고 있는것을 확인하였다. 이 실험의 결과, 돼지의 급성흉막폐렴은 결국 eicosanoid가 매개한다는 것을 알 수 있었다. 시간대별 진행 과정 중에서 고농도의 PGE_(2)가 NO 보다 먼저 생성된다는 것을 관찰하였으며, 이후에는 NO와 PGE_(2)가 서로 높은농도로 유도되는 것을 확인하였다. 본 실험결과 돼지 흉막폐렴균에 의한 흉막폐렴은 돼지 호흡기 급성염증반응을 연구할 수 있는 좋은 실험 모델이 될 수 있음을 알수 있었으며, 돼지의 호흡기 급성염증반응에서 iNOS와 COX-2가 중요한 역할을 한다는 것을 알수 있었다. COX-2 mRNA and protein were detected by in-situ hybridization and immunohistochemistry in the lungs of pigs naturally infected with Actinobacillus pleuropneumoniae. The nitrotyrosine and PARS antigen were detected by immunohistochemistry in pleuropneumonic lungs of naturally infected with A. pleuropneumoniae. NF-κB and iNOS antigen were detected by immunohistochemistry in the lungs of pigs naturally infected with A. pleuropneumoniae. Inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase-2 (COX-2) activity were determined by detecting nitric oxide (NO) and prostaglandin E_(2) (PGE_(2)) in alveolar macrophages in response to A. pleuropneumoniae in vitro. iNOS and COX-2 activity were determined by in-situ hybridization, immunohistochemistry and ELISA in lungs from pigs experimentally infection with A. pleuropneumoniae. All 15 pigs infected with A. pleuropneumoniae, confirmed by bacterial isolation, had distinct positive signals for COX-2 in bronchial, bronchiolar epithelial cells, alveolar macrophages, neutrophils, and type I pneumocytes by in-situ hybridization and immunohistochemistry. COX-2 expression was detected primarily in neutrophils from pigs with acute lesions and primarily in alveolar macrophages from pigs with chronic lesions. The results suggest that a prostanoid product of COX-2 is an important component of the inflammatory response to acute and chronic A. pleuropneumoniae infection. Intense immunostaining for nitrotyrosine residue was seen within the lung lesions from A. pleuropneumoniae-infected pigs. Staining was especially strong in neutrophils and macrophages in the periphery of the lesions and within the alveolar spaces. There was close cell-to-cell correlation when serial sections were examined by immunohistochemistry for iNOS and nitrotyrosine in each of 20 lung samples. Expression of PARS was always present within inflammatory lesions but was minimal in unaffected lung of A. pleuropneumoniae-infected pigs. Macrophages in alveolar spaces frequently exhibited a strong staining for PARS. Colocalization of nitrotyrosine and PARS antigen was especially prominent in macrophages in the periphery of lesions. iNOS expression in pleuropneumonic area is associated with protein nitrosation and PARS suggests that iNOS is functionally active during infections caused by A. pleuropneumoniae. NF-κB was detected mainly in nuclei of inflammatory cells, confirming its activation. Intense immunolabelling for NF-κB and iNOS was seen within the lung lesions, but labeling was minimal in unaffected portions of the lung of infected pigs and in normal lung from uninfected (control) pigs. Examination of serial sections from the 20 infected lung samples demonstrated a close association between NF-κB and iNOS. This suggests that NF-κB plays a key role in triggering the activation of iNOS in porcine pleuropneumonia. The addition of A. pleuropneumoniae to alveolar macrophages resulted in significant increase in NO and PGE_(2) production. A. pleuropneumoniae and IFN-γ synergistically induce NO production in vitro in porcine alveolar macrophages. Inhibition of iNOS and COX-2 reduced NO and PGE_(2) production, respectively. In vitro activation of alveolar macrophages by A. pleuropneumoniae resulted in increased production of NO and PGE_(2). NO and PGE_(2) production seemed largely dependent on iNOS and COX-2 activity because these two mediators were suppressed by the selective inhibitor of iNOS and COX-2 activity, respectively. Pharmacologic modulation of iNOS and COX-2 activity may represent a therapeutic target of porcine pleuropneumonia. The sharp increase in PGE_(2) concentration preceded the increase in the concentrations of NO_(2)^(-)/NO_(3)^(-). NO_(2)^(-)/NO_(3)^(-) level was highly correlated with PGE_(2) level (r_(s) = 0.7218, P < 0.05). The correlation between NO_(2)^(-)/NO_(3)^(-) levels and lung lesion scores (r_(s) = 0.9087, P < 0.05) until 24 hpi as was the correlation of lung lesion scores and PGE_(2) levels (r_(s) = 0.925, P < 0.01). The results suggested that acute pleuropneumonia caused by A. pleuropneumoniae is mediated primarily by eicosanoids.

Nitrotyrosine과 Nitrotryptophan을 가진 단백질의 분자역학적 모사

명유찬 강원대학교 대학원 2011 국내석사

세포내 니트로화 스트레스는 tyrosine(Tyr)과 tryptophan(Trp)을 니트로화 하여 nitrotyrosine(NIY)와 nitrotryptophan(NIW)을 형성한다. 아직까지 니트로화된 아미노산을 포함하는 단백질의 3차원구조가 거의 없기 때문에 니트로화된 단백질의 구조와 기능을 연구하는데 한계가 있다. 따라서, 우리는 분자 동역학(molecular dynamics, MD) 모사 방법으로 니트로화된 단백질의 구조의 변화를 예측하고자 했다. MD 모사를 위해서 NIY와 NIW에 대한 force field parameter를 개발하였다. Force field parameter의 힘 상수 중 반데르 발스, 결합, 각도 상수는 generalized AMBER force field로부터, 전하와 이면각에 대한 상수는 양자 역학적 (quantum mechanical, QM) 계산으로부터 도입했다. 개발한 force field parameter를 이용한 분자 역학적(molecular mechanical, MM) 구조 최적화의 결과는 QM에 의해 최적화된 구조와 거의 일치 했다. NIY와 NIW를 도입한 Thioredoxin의 MD 모사에서,각 잔기의 궤적을 분석해본 결과, 개발한 force field parameter가 MD parameter로 적합하다는 것을 확인했다. 우리는 MM 모사를 통해 니트로화된 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)의 비활성화기작을 모델링 해보았다. 먼저, 니트로화된 GAPDH의 MD 모사 결과, NIY^(317)의 C_β-C_γ가 특정 각도로 유지되어 NAD^(+)의 결합자리와의 거리가 가까워지는 것을 보였다. MD 모사 후의 구조에 NAD^(+)의 분자 도킹(molecular docking) 모사 결과, 회전한 NIY&(317)에 의해 NAD^(+)의 결합이 저해 됨을 볼 수 있었다. 이로써, 우리는 MM force field parameter를 개발하고, MD 모사 및 분자 도킹 방법을 통해서 니트로화된 GAPDH의 비활성 기작을 규명하였다.

알레르기비염에서 항원유발반응 후 비즙 내 일산화질소 및 Nitrotyrosine의 형성

김성민 인하대학교 2001 국내박사

인체 골관절염의 관절연골에서 Matrix metalloproteinase (MMP)-1, MMP-3, 아포프토시스 및 Nitrotyrosine 발현

강성수 順天鄕大學校 2001 국내박사

DOCA-salt 및 L-NAME 고혈압 흰쥐에서 Tempol이 혈압과 조직 산화 스트레스에 미치는 영향

조정원 전남대학교 대학원 2007 국내석사

배경 및 목적: 고혈압 발생과 유지는 부분적으로나마 산화 스트레스와 관련됨이 알려졌다. 서로 다른 두 가지 모델의 고혈압 흰쥐에서 산화 스트레스 감약제가 동맥 혈압과 조직의 산화 스트레스에 미치는 영향을 조사하였다. 방법: 실험 재료는 Sprague-Dawley 숫쥐를 사용하였으며 deoxycorticosterone acetate (DOCA)-salt 또는 NG-nitro-L-arginine methyl ester(L-NAME)를 처치하여 고혈압을 유발하였다. 각 고혈압 모델은 두 군으로 나누어 한 군에서 산화 스트레스를 억제하기 위하여 4-hydroxyl-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl(Tempol, 3 mM)을 함유한 마실 물을 공급하였으며, 그리고 다른 한 군에서는 약물을 함유하지 않은 보통 수돗물을 공급하였다. 고혈압을 유발하고 나서 4주째 되는 날 신장과 동맥을 채취하여 조직의 endothelial nitric oxide synthase(eNOS)와 3-nitrotyrosine 단백 발현을 조사하였다. 결과: DOCA-salt 또는 L-NAME 처치는 각각 유의한 고혈압을 일으켰다. DOCA-salt 고혈압은 Tempol에 의하여 차단되었으나, L-NAME 고혈압은 유의하게 영향 받지 않았다. DOCA-salt 군에서 신피질의 eNOS 발현은 유의하게 상승하였으며 그 정도는 Tempol에 의해 감약되었다. 반면 신피질의 3-nitrotyrosine 발현은 DOCA-salt 군에서 유의하게 감소하였으며 그 정도는 Tempol에 의해 강화되었다. 대동맥에서 eNOS 및 3-nitrotyrosine 발현은 DOCA-salt 군과 DOCA-salt/Tempol 군에서 모두 대조군에 비해 유의한 감소를 보였으며 그 정도는 두 군간에 유의한 차이가 없었다. L-NAME 고혈압에서 신피질의 eNOS 발현은 유의하게 상승하였으며 이는 Tempol에 의해 차단되었다. 그러나 신피질의 3-nitrotyrosine 발현은 L-NAME 군과 L-NAME/Tempol 군에서 모두 유의한 변화를 보이지 않았다. 대동맥에서 eNOS 발현은 L-NAME 군과 L-NAME/Tempol 군에서 모두 작지만 유의한 감소를 보였으며, 3-nitrotyrosine 발현은 L-NAME 군과 L-NAME/Tempol 군에서 모두 감소하되 그 감소 정도는 Tempol에 의해 더욱 강화되었다. 결론: DOCA-salt 고혈압에서 산화 스트레스를 억제하면 혈압과 조직 손상을 경감시킬 수 있으며, L-NAME 고혈압에서 산화 스트레스가 비록 혈압에 직접 영향을 미치지 않으나 산화 스트레스 억제는 조직의 스트레스 관련 손상을 완화할 수 있을 것임을 시사하였다.

플루오린화 탄소 태그를 이용한 질산화 펩타이드의 선택적 분리와 질량분석학적 동정

김재경 건국대학교 대학원 2011 국내석사

Protein tyrosine nitration (PTN) is a post-translational modification that is related to several acute or chronic diseases. PTN introduces a nitro group in the ortho position of the phenolic hydroxyl group of tyrosine residues. PTN has been shown to be involved in the pathogenesis of inflammatory responses, cancers, and neurodegenerative and age-related disorders. Furthermore, it has been proposed that PTN regulates signal cascades related to nitric oxide (NO?) production and NO-mediated processes. Although nitrated proteins as markers of oxidative stress are confirmed by immunological assays in various affected cells or tissues, it is not known how many different types of proteins in living cells are nitrated. Since protein nitration is a low-abundance post-translational modification, development of an effective enrichment method for nitrated proteins is needed to detect nitrated peptides or proteins from the limited amount of pathophysiological samples. In the present study, we developed an enrichment method using specific chemical tagging. Nitroproteome profiling using chemical tagging and mass spectrometry was validated by model proteins. Furthermore, we successfully identified numerous nitrated proteins from the Huh7 human hepatoma cell line. 단백질 타이로신 질산화는 급성 또는 만성 염증과 관련된 전사 후 수식 중에 하나이다. 단백질 타이로신 질산화는 타이로신 잔기에 있는 페놀링 수산기의 ortho 위치에 질산기가 붙는 현상을 말한다. 질산화는 염증 반응, 암 그리고 퇴행성 신경질환과 노화의 발병에 관련되어 있다고 알려져 있다. 이 뿐만 아니라, 단백질 타이로신 질산화는 nitric oxide의 생성과 매개된 반응에 관련된 신호 전달 과정을 조절한다고 제안되어 왔다. 산화적 스트레스의 표지인자로서 질산화 단백질들은 다양한 세포와 조직에서 면역학적 분석법에 의해 확인되었지만 살아있는 세포 안에서 얼마나 다양한 형태로 질산화가 일어나는지는 알려져 있지 않다. 질산화 단백질은 소량으로 존재하기 때문에 이것의 분석을 위한 효과적인 enrichment 방법의 개발은 제한된 시료로부터 질산화 펩타이드 혹은 단백질의 동정을 위해 필수적이다. 최근 연구에서, 우리는 특이적 화학 tagging을 이용한 enrichfment 방법을 개발했다. 화학적 tagging과 질량분석기를 이용한 질산화 단백체의 동정은 모델 실험을 통해 확인 되었다. 더욱이, 우리는 간암세포에서 성공적으로 다수의 질산화 단백질들을 동정했다.

NOx donor 전처리시의 rOAT3 추정

윤현지 서울대학교 대학원 2007 국내석사

NOx donor 전처리 후 rOAT3 중 nitrated tyrosine의 확인

심효정 서울대학교 대학원 2009 국내석사

Study on the analysis of post-translational modification in protein by mass spectrometry

신영식 서울대학교 대학원 2012 국내박사

매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화에 의해 생성된 펩타이드 이온 및 질량이 작은 단백질 이온의 광분해를 위해 이 단계 질량분석기를 제작하였다. 이온의 감속 후 두 번째 이온원에서 광분해를 하였다. 펩타이드 이온의 193 파장 광분해 스펙트럼은 기존에 제작된 질량분석기와 거의 같은 경향을 보였으나 더 좋은 감도와 분별능을 보였다. 하지만 선택적 동위원소 광분해를 할 수 없었고 잡음이 많았다. 단백질 이온이 분해되기 위한 충분한 내부에너지를 레이저가 공급할 수 있는지를 확인하기 위해 유비퀴틴 이온의 광분해를 실시하였고 광분해를 할 수 있었다. 하지만 질량이 커지면서 생성 이온의 신호가 급격하게 감소하였다. 질량 대 전하비가 1000 인 펩타이드 이온의 광분해 스펙트럼처럼 질량 대 전하비가 2000-4000 인 펩타이드 이온의 광분해 스펙트럼도 아르기닌의 위치에 따라 생성된 이온이 결정되었다. 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화에 의해 생성된 펩타이드 이온의 다중 광분해를 위해 두 개의 리플렉트론으로 이루어진 비행시간형 질량분석기를 제작하였다. 선형 포텐셜 리플렉트론은 이온의 고분별능을 위해 설치하였고 생성 이온의 분석을 위해 이차 포텐셜 리플렉트론을 사용하였다. 고전압이 적용된 셀 내부에서의 광분해로 최종 생성이온의 중간 이온들의 질량을 확인하였다. 이는 삼 단계 질량분석 스펙트럼의 하나이다. 4 Da 내의 오차로 모든 생성 이온의 중간 이온을 한 번에 알아 낼 수 있었다. 번역 후 수식은 단백질의 화학적 변형이다. 아미노산의 번역 후 수식은 단백질의 구조와 기능에 영향을 주는데, 인산염, 황산염, 탄수화물 등의 기능 그룹이 결합되면서 발생한다. 기존에 제작한 질량분석기를 이용하여 다양한 단백질의 번역 후 수식에서 인산화와 나이트로화를 연구하였다. 트립신에 의해 만들어진 인산화 펩타이드 분석은 중간물질을 알 수 있는 다 단계 질량분석기를 이용하였다. 이 단계 질량 스펙트럼에서 볼 수 없는 펩타이드 순서 결정 이온을 다 단계 광분해 질량 스펙트럼에서 확인 할 수 있었다. 이를 이용하여 인산화 펩타이드의 순서 결정을 할 수 있었다. 염기도가 큰 아미노산인 아르기닌, 히스티딘, 라이신 아미노산이 펩타이드의 N 말단에 있는 인산화 펩타이드의 광분해 스펙트럼에서 특징적인 이온이 검출되었다. 이 이온은 인산화가 된 아미노산이 있는 위치에서만 생성되어 나오는 것으로, 이 이온이 검출되는 위치만으로 인산화 자리를 결정할 수 있었다. 단백질 내 타이로신의 나이트로화는 알츠하이머 병과 관련된 중요한단백질 번역 후 수식이다. 355 파장의 레이저를 이용하여 효과적이고 선택적으로 나이트로화 펩타이드를 광분해 할 수 있었다. 이온원 외 광분해 스펙트럼은 나이트로화 펩타이드의 순서 결정을 하는데 도움이 되는 방법이었다. 트립신에 의해 만들어진 펩타이드 혼합물에 나이트로화 펩타이드를 넣은 후 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화로 이온을 만들어 이온원 내에서 355 레이저로 광분해 하였다. 나이트로화 펩타이드만을 선택적으로 광분해 할 수 있었고 이로써 쉽게 나이트로화 펩타이드만을 찾을 수 있었다. A tandem time-of-flight mass spectrometer was built for photodissociation of singly protonated peptides and small proteins generated by matrix-assisted laser desorption ionization. Photodissociation was done in a second source after deceleration of precursor ions. The delayed extraction/post-acceleration scheme was used for the product ions. For the photodissociation at 193 nm of small singly protonated peptides, the present instrument showed much better sensitivity and resolution for product ions than the previous one, even though the overall spectral patterns obtained with the two instruments were similar. The present instrument was inferior in precursor ion selection and background noise level. Photodissociation was achieved for precursor ions as large as the singly protonated ubiquitin (m/z 8560.63), indicating that the photoexcitation is capable of supplying a sufficient amount of internal energy to dissociate large singly protonated proteins. As the precursor ion m/z increased, however, product ion signals deteriorated rather rapidly. As in the photodissociation of small peptide ions with m/z around 1000, the types of the product ions generated from singly protonated peptides with m/z in the range 2000-4000 were mostly determined by the positions of arginine residues. Namely, an and dn ions dominated when an arginine residue(s) was near the N-terminus while vn, wn, xn and yn dominated when the same residue(s) was near the C-terminus. In addition, dn, vn and wn ions were generated according to the correlation rules previously observed in the collisionally activated dissociation. Isoleucine and leucine isomers could be easily distinguished based on the wn and dn ions. A time-of-flight mass spectrometer equipped with two reflectrons was constructed for multiplexed photodissociation tandem mass spectrometry of peptide ions generated by matrix-assisted laser desorption ionization. A linear reflectron was used for high resolution selection of a precursor ion while a quadratic reflectron was used for product ion analysis. By photoexciting a precursor ion inside a cell floated at high voltage, information (MS3) on intermediate ions generating a particular product ion was obtained. Fully multiplexed detection resulted in good MS3 signal levels. Use of the quadratic reflectron allowed intermediate ion mass determination within 4 Da. Post-translational modification is the chemical modification of a protein. After translation, the post-translational modification of amino acids changing the structure and functions of protein by attaching to them other biochemical functional groups such as phosphate, sulfate, carbohydrates. In various post-translational modifications, phosphorylation and nitration of protein were investigated. For tryptic phosphopeptide analysis, we used photodissociation (PD) multi-stage (MSn) time-of-flight mass spectrometry that can monitor reaction intermediates with lifetime as short as 100 nsec to study the formation of dephosphorylated sequence ions such as yn − H3PO4. yn − H3PO4 was found to be formed mainly by H3PO4 loss from yn. Even when yn was absent in PD-MS2 spectrum, its m/z could be predicted from those of yn − H3PO4. Complete sequence coverage was possible when the data from PD-MS2 and PD-MS3 were combined, demonstrating the utility of transient ion detection by PD-MS3 for structure analysis. In ultraviolet photodissociation of phosphopeptide ions with a basic residue (arginine, lysine, or histidine) at the N-terminus, intense an − 97 peaks were observed. These ions were formed by cleavage at phosphorylated residues only. For multiply phosphorylated peptides, this site-specific cleavage occurred at every phosphorylated residue. H/D exchange studies showed that an − 97 was formed by H3PO4 loss from an + 1 radical cations. Nitration of tyrosine residues in proteins is an important post-translational modification related to various diseases such as Alzheimer’s. In this work, efficient and selective photodissociation (PD) at 355 nm was observed for [M + H]+, [M + H – 16]+, and [M + H – 32]+ generated by matrix-assisted ultraviolet laser desorption ionization (UV-MALDI) of tyrosine-nitrated peptides (nitropeptides). Product ion spectra obtained by post-source PD at this wavelength contained useful information on amino acid sequence. The spectra for nitropeptides obtained with 355 nm irradiation inside the ion source (MALDI/in-source PD) displayed characteristic triplet patterns due to PD of the above ions. For peptides displaying prominent signal in MALDI mass map of a tryptic mixture, which are mostly those with arginine at the C-terminus, in-source PD allowed positive identification of their tyrosine-nitrated forms. Identification of such nitropeptides was possible at the 10 fmol level in tryptic digest of 100 fmol BSA.

수핵이식 및 신경근 결찰에 의한 실험적 신경근병증에서 단백질 니트로화의 역할

이성재 서울대학교 대학원 2004 국내박사