Trapping and releasing hydrodynamic microarrays device for trapping microparticles : 미세입자의 포획 및 방출을 위한 정수압 마이크로 어레이 장치

Le, Tuan Anh 경북대학교 대학원 2014 국내석사

본 논문은 MEM공정을 이용하여 마이크로어레이 장치의 제작하였으며, 제작된 장치를 이용하여 미세입자의 포획 및 방출에 대하여 연구하였다. 정수압 마이크로어레이 장치는 포토리소그래피공정으로 제작된 마스터 몰드를 이용하여PDMS 캐스팅으로 제작된다. 제작된 정수압 마이크로 어레이 장치는 메인 채널, 보조채널, 마이크로 포스트 등으로 구성되었다. 미세입자로는 76 um 지름의 폴리비드를 계면활성제인 TWEEN 20이 첨가된 탈이온수에 혼합하여 사용하였다. COMSOL 멀티피직스 시뮬레이션을 이용하여 미세채널 내부 형상, 사이즈에 따른 유체거동에 대하여 연구하였다. 시뮬레이션 해석결과, 메인채널이 길이가 증가할수록 입자의 포획이 용이해짐을 확인할 수 있었다. 시뮬레이션 결과를 바탕으로 설계한 마이크로어레이 장치를 이용하여 실험한 결과, 미세입자의 포획률이 100%에 도달하였다. 포획된 입자들의 방출을 위하여 유속을 반대로 흐르게 하였을 때, 포획시 사용했던 유속보다 상대적으로 높은 유속에서 미세입자들이 다시 방출되었으며 유속이 높을 수록 방출률은 점차적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. Microarrays have an extensive potential for bio-based scientific studies, drug-discovery, and diagnostics. There have been significant developments in two primary classes of microarray: static microarray which consists of bio-molecules immobilized on static substrates and dynamic microarrays which consist of bio-molecules immobilized on mobile substrates, such as microbeads. This thesis describes the fabrication of hydrodynamic microarrays device and trapping technique that can immobile microparticles and retrieve them for resettable purpose. The hydrodynamic microarrays device was fabricated by polydimethylsiloxane (PDMS) casting from SU-8 mold prepared by photolithography. The device has a structure with three parts: main channels, auxiliary channels and microposts. The microparticles were served in this experiment as microbeads with 76.94μm in diameter, were diluted in DI water and TWEEN 20 as a surfactant. This study showed that the efficiency of trapping microparticles does not depend on flow rate of solution, it depends on the dimension of microchannels. The fluid behaviors inside microchannels were also analyzed by simulation via COMSOL Multiphysics. In experiments, we succeeded in arraying 100% microparticles in microposts by using this structure. After that, the trapped microparticles also were retrieved by using high backward flow rates. Microbeads were not completely released from the devices but the results show that more microparticles can be retrieved when increasing the flow rate. Finally, the presented studies were successfully introduced a simple technique with high efficiency to immobile microparticles, the structure of microdevices can be improved to trap more microbeads and completely release microparticles for further purposes.

Microarray를 이용한 복합형질유전자재조합 옥수수의 검출법 구축

김수연 경희대학교 2010 국내석사

본 연구는 지금까지 개발된 복합형질유전자(stacked gene)를 포함하는 21개 유전자변형 옥수수를 검정할 수 있는 microarray 분석법을 개발하는 것이다. 복합형질 유전자변형 옥수수 분석을 위해 옥수수 내재유전자(zSSIIb), screening elements(35S promoter, nos terminator) 그리고 13개의 삽입유전자에 특이적인 primers를 제작하였다. 또한 17개의 probe(30 mers)를 제작하여 슬라이드글라스에 고정화시킨 chip을 제작하였다. 각각의 복합형질 유전자변형 옥수수에 삽입된 유전자들을 multiplex PCR를 이용하여 동시에 증폭하고 이러한 PCR 산물을 16개의 probe가 심어진 chip에 hybridization시킨 후 image 분석을 실시하였다. 현재까지 GA21xMIR604(zSSIIb, nos terminator, mcry3A, mepsps, 18S rRNA), Bt11xGA21xMIR604(zSSIIb, 35S promoter, nos terminator, mcry3A, mEPSPS, cry1Ab, pat, 18S rRNA), MON810xMON863 (zSSIIb, 35S promoter, nos terminator, cry3Bb1, cry1Ab, 18S rRNA), NK603xMON863(zSSIIb, 35S promoter, nos terminator, cry3Bb1, cp4 epsps, 18S rRNA), NK603xMON810xMON863(zSSIIb, 35S promoter, nos terminator, cry3Bb1, cp4 epsps, cry1Ab, 18S rRNA)에 대한 microarray 분석법이 확립되었으며 계속해서 다른 이벤트들에 대한 분석법 개발이 진행 중에 있다. 또한, MON810xMON863, NK603xMON863, NK603xMON810xMON863을 동시에 보다 쉽게 검정할 수 있는 multiplex PCR 분석법을 개발하였다. 이는 옥수수의 내재유전자와 각각에 개별적으로 삽입된 유전자 3종을 증폭시켜 PCR 산물을 agarose gel로 확인하여 3가지 복합형질 유전자 변형 옥수수에 대하여 구분이 가능하도록 하였고 같은 이벤트가 삽입된 다른 복합형질 이벤트들에 대해서도 분석법 개발이 진행 중에 있다. 이 검출방법은 현재까지 개발된 모든 복합형질 유전자변형 옥수수를 검정할 수 있기 때문에 유용하게 활용 될 것으로 생각된다. In this study, DNA Microarray system was developed for simultaneous identification of twenty-one kinds of developed stacked genetically modified (GM). For DNA Microarray of various stacked GM maize, both construct-specific and event-specific primers were used. To detection of stacked GM maize, maize endogenous gene (zSSIIb), screening elements (35S promoter, nos terminator) and thirteen kinds of internal gene specific primer pairs were designed. Additional 18S ribosomal RNA specific target was designed as internal positive control and false negative control. Also 16 kinds of probe (30 mers) was designed and attached to the slide glass. And then Microarray chip was produced. In addition, Microarray analysis was performed to distinguish five different stacked GM maize events [GA21 ⅹ MIR604 (zSSIIb, nos terminator, mcry3A, mepsps), Bt11 ⅹ GA21 ⅹ MIR604 (zSSIIb, 35S promoter, nos terminator, mcry3A, mepsps, cry1Ab, pat), MON810 ⅹ MON863 (zSSIIb, 35S promoter, nos terminator, cry3Bb1, cry1Ab), NK603 ⅹ MON863 (zSSIIb, 35S promoter, nos terminator, cry3Bb1, cp4 epsps), NK603 ⅹ MON810 ⅹ MON863 (zSSIIb, 35S promoter, nos terminator, cry3Bb1, cp4 epsps, cry1Ab)]. Individually inserted gene in the stacked GM maize was amplified by performing the multiplex PCR in a single reaction. And the PCR products were hybridization with seventeen probes into the Microarray chip. Finally, chip image was analyzed by GENEFIX PRO 6.0 program. Also DNA Microarray PCR methods for five different events of stacked GM maize were developed.

Development of a random genomic DNA microarray for the detection of Listeria monocytogenes and Yersinia enterocolitica in food

방지현 Graduate School, Korea University 2012 국내박사

A DNA microarray containing non-sequenced random genomic DNA fragments of Listeria monocytogenes and Yersinia enterocolitica was developed. As a first step, diagnostic abilities of this microarray were verified using cells grown in a laboratory medium. To confirm the diagnostic ability of the microarray, genomic DNAs extracted from other L. monocytogenes or Y. enterocolitica strains, other species of genus Listeria or Yersinia and other bacteria belonging to different genus were hybridized with this microarray. Hierarchical clustering and principal components analysis indicates that the microarray was able to detect L. monocytogenes or Y. enterocolitica strains and clearly distinguished them from other speices in Listeria or Yersinia genus and other bacteria in different genus. As a next step, the diagnostic abilities of these microarrays in milk were determined. When hybridized with genomic DNAs extracted from milk containing L. monocytogenes or Y. enterocolitica strains without other microorganisms, detection limits of this microarray were 6 log CFU/ml. However, when other types of bacterial strains (B. cereus, S. Montevideo, Bacillus spp. [isolated from milk], P. aeruginosa) were present in high number in milk, the detection limits of the microarray were 8 and 7 log CFU/ml for L. monocytogenes and Y. enterocolitica, respectively. Because of high detection limits of this microarray, sample preparation protocols to increase the populations of L. monocytogenes and Y. enterocolitica in milk were investigated. Enrichment conditions for rapid growth of L. monocytogenes or Y. enterocolitica with other bacterial strains (B. cereus, S. Montevideo, Bacillus spp. [isolated from milk], and P. aeruginosa) in various media (TSBY, BHIB, and UVMB) and temperatures (25 and 37°C) were investigated. When 2.2 and 2.7 log CFU/ml of L. monocytogenes and Y. enterocolitica, respectively, in milk were enriched in UVMB at 37°C for 24 h and in TSBY at 25°C for 16 h, populations of L. monocytogenes and Y. enterocolitica increased to 7.7 and 7.3 log CFU/ml, respectively. When the microarray hybridized with the genomic DNAs extracted from these enriched cultures, 100% positive hybridization signal were shown on the microarray. Therefore it was concluded that the microarrays containing random genomic DNA fragments can detect L. monocytogenes and Y. enterocolitica in milk by a combination with culture-based methods. 유전자의 정보 없이 Listeria monocytogenes와 Yersinia enterocolitica의 지노믹 DNA 단편을 이용하여 유전자 칩을 개발하였다. 첫째 단계로, 실험 배지에서 배양한 균을 이용하여 칩의 진단성능을 확인하였다. 칩 제작에 사용하지 않은 다른 L. monocytogenes와 Y. enterocolitica, Listeria와 Yersinia 속 (genus)의 다른 종 (species), 그리고 Listeria와 Yersinia의 다른 속에 속하는 균주의 지노믹 DNA가 칩의 DNA 단편과 혼성화 되었다. 주성분 분석법과 크러스터링을 통한 통계분석결과 이 칩은 L. monocytogenes와 Y. enterocolitica만 검출하고 다른 종과 다른 속에 속하는 균주는 분명하게 구별하였다. 다음 단계로 이 칩이 우유에 오염된 균을 검출할 수 있는지를 확인해 보았다. 먼저, 우유에 L. monocytogenes와 Y. enterocolitica가 단독으로 오염되어 있을 때와 다른 미생물이 함께 오염되어 있을 때 이 칩의 검출한계를 조사해 보았다. L. monocytogenes와 Y. enterocolitica가 단독으로 오염되어 있을 때 이 칩의 검출한계는 6 log CFU/ml이었다. 하지만 우유에 다른 미생물 (Bacillus cereus, Salmonella Montevideo, Bacillus spp. [isolated from milk], Pseudomonas aeruginosa)과 함께 오염되어 있을 때 이 칩의 L. monocytogenes와 Y. enterocolitica의 검출한계는 각각 8 그리고 7 log CFU/ml 이었다. 이 칩의 높은 검출한계 때문에 균수를 증가시킬수 있는 샘플준비 절차로 증균배양방법이 선택되었다. 다양한 종류의 증균배양용 배지 (TSBY, BHIB, 그리고 UVMB)와 온도 (25와 37°C)에 따라 L. monocytogenes와 Y. enterocolitica가 다른 균주 (B. cereus, S. Montevideo, Bacillus spp. [isolated from milk], P. aeruginosa)와 같이 오염된 우유 속에서 개체수가 빠르게 증가되는 증균배양조건이 조사되었다. 2.2 log CFU/ml의 L. monocytogenes와, 2.7 log CFU/ml의 Y. enterocolitica는 UVMB배지와 37°C 에서 24시간 그리고 TSBY배지와 25°C에서 16시간 증균배양 했을 때, 각각 7.7과 7.3 log CFU/ml로 증가하였다. 이 증균 배양액에서 지노믹 DNA 를 추출하여 칩과 혼성화한 결과 L. monocytogenes와 Y. enterocolitica의 DNA 단편부분에서 각각 100% 양성시그널이 나타나는 것이 관찰되었다. 이 결과는 유전자 정보없이 L. monocytogenes와 Y. enterocolitica의 DNA 단편을 이용해서 제작된 이 칩이 일반배양법과 조합처리 되었을 때 다른균에 영향없이 우유에 오염된 L. monocytogenes와 Y. enterocolitica를 검출할수 있다는 것을 보여준다.

cDNA microarray를 이용한 대장암에서의 간 전이와 연관된 유전자군 탐색

기동혁 연세대학교 대학원 2006 국내석사

대장암의 주된 사인은 간 전이에 의한 것으로 알려져 있다. 이러한 간 전이 기전을 이해하기 위하여 cDNA microarray를 이용한 gene expression profiling 기법을 사용하여 대장암에서의 간 전이에 관련되어 있는 유전자를 선별하였다.대장암 환자 중 진단 당시 수술적 절제가 가능한 간 전이를 동반한 22명의 환자들로부터 수술 당시 정상 대장 조직, 원발성 대장 종양 조직, 간 전이 종양 조직을 각각 쌍으로 얻고, 가능한 경우 추가적으로 정상 간 조직과 대장 용종을 채취하였다. Total RNA를 추출하여 mRNA T7 linear amplification 방법을 이용해 mRNA만을 선택적으로 증폭한 후, 17K cDNA microarray에 reference RNA를 이용한 indirect 방법으로 microarray 실험을 수행하였다. 결과들을 평준화와 전처리 하고 unsupervised hierarchical clustering을 통하여 전체 유전자의 발현 양상을 살핀 후에, 14개의 학습군과 8개의 검증군으로 나누어 분석을 진행하였다. 학습군에서 Significant Analysis of Microarrays (SAM) 을 이용하여 정상 대장 조직과 간 조직에서 유의하게 발현이 차이가 나는 장기 특이 유전자를 선별하고 추후 분석에서 제외하였다. 장기 특이 유전자군이 제거된 유전자를 이용하여 학습군에서 원발성 대장 종양과 간 전이 종양에서의 특이 유전자를 Prediction Analysis of Microarrays (PAM)을 이용하여 선별 및 검정한 후, NIH-DAVID database (http:apps1.niaid.nih.gov/david/)를 이용하여 유전자의 기능을 살펴보았다.모든 실험 결과를 100 % non-missing proportion에서 선별된 12,823 개의 유전자를 이용하여 unsupervised hierarchical clustering 을 수행하였을 때, unsupervised clustering 임에도 불구하고 크게는 정상 대장, 정상 간, 원발성 대장 종양, 간 전이 종양 조직으로 구분되는 경향을 보였다. 정상 대장과 간 조직으로 SAM 을 이용하여 false discovery rate 0.062 % 에서 4,616 개의 장기 특이 유전자를 선별하고 이 유전자 군을 제거한 8,207 개 유전자를 이용하여 분석을 진행하였다. 14 쌍의 원발성 대장 종양과 간 전이 종양 조직 학습군을 PAM을 이용하여 학습하고 training error와 교차 검정의 misclassification error가 공통으로 0인 구간에서 81개, 126개, 252개의 유의 유전자군을 먼저 선별했다. 이 세 개의 유전자군을 각각 8 개의 독립된 검증군을 이용한 검정과 supervised hierarchical clustering을 통하여 원발성 대장 종양과 간 전이 종양을 적절히 구분할 수 있는 126 개의 최적 유전자군을 선별하였다.이렇게 선별된 126 개의 유전자 중 간 전이 종양에서 38 개는 up regulation 되었고 88 개는 down regulation 되었다. 선별된 유전자에는 중에는 WNT5A, lipocalin 2, E-cadherin, deiodinase 등 기존에 알려진 oncogene 이나 cell adhesion 관련 유전자들과 16 개의 EST 가 포함되어 있었다. 특히 MMP-1, MMP-2, WNT5A 는 원발성 대장 종양에 비해 간 전이 종양에서 발현 양이 감소하였고, 이들은 간으로의 전이하는 초기단계에 관여하는 것으로 여겨진다. 반대로 TIMP-1은 발현 양이 증가함을 관찰하였다 (p < 0.01). 결론적으로, 대장암에서 whole genome의 유전 발현 양상을 살펴보았고, 간 전이 과정에서 중요한 역할을 하리라 사료되는 126개의 유전자를 확인하였다. Liver metastasis is the major cause of death in colorectal cancer patients. By using cDNA microarray gene expression profiling, we selected genes of metastatic potential from colorectal cancer patients with liver metastasis. We performed cDNA microarray in an indirect design based on the T7 linear mRNA amplification method with paired 22 colorectal normal mucosa, primary tumor, normal liver and metastasis liver tumor tissue RNAs using 17K human cDNA microarray. After the normalization, we evaluated the gene expression profilings of all samples with unsupervised clustering. Next, we selected organ specific genes with normal colon mucosa and liver tissue using Significant Analysis of Microarrays (SAM). After that, we selected and validated liver metastasis related genes from colorectal primary tumor and liver metastasis tumor within genes which subtracted organ specific genes using Prediction Analysis of Microarrays (PAM). The selected genes were functionally annotated using NIH-DAVID database (http:apps1.niaid.nih.gov/david/).Unsupervised hierarchical clustering with 12,823 genes with 100% non-missing proportion of the 22 paired samples showed different expression profiling between primary tumor and liver metastasis. Next, we selected 4,616 organ specific genes with normal colon mucosa and liver tissue at the false discovery rate of 0.062% using SAM, which were subtracted for not using further analysis. After that, we identified 38 and 88 genes of up and down regulated in metastatic lesions, respectively, with selected 8,207 genes of 14 train set using PAM, and validated the selected genes in 8 independent test set. 126 selected genes contained many known oncogenes and cell adhesion molecules such as wingless-type MMTV integration site family member 5A, lipocalin 2, E-cadherin, deiodinase as well as 16 ESTs. We especially observed that MMP-1, MMP-2 and WNT5A expressions were significantly decreased in liver metastatic tumors (p<0.001), suggesting their roles in early stage colorectal cancer rather than systemic metastasis. However, TIMP-1 expressions were significantly increased in liver metastatic tumors (p<0.001). In conclusion, we scanned whole genome using a cDNA microarray and identified 126 genes which might play a significant role in liver metastasis in colorectal cancer.

DNA Microarray를 이용한 복합형질유전자재조합 옥수수의 모니터링

이재은 경희대학교 2011 국내석사

In this study, stacked genetically modified organisms(GMOs) were monitored by DNA microarray technology. For DNA microarray of various stacked GM maize, both construct-specific and event-specific primers were used. For the detection of stacked GM maize, maize endogenous gene (zSSIIb), screening elements (35S promoter, nos terminator) and thirteen kinds of internal gene specific primer pairs were designed. Additional 18S ribosomal RNA specific target was designed as internal positive control and false negative control. Also 17 kinds of probe (30 mers) were attached to the slide glass. And then Microarray chip was produced. In addition, Microarray analysis was performed to distinguish six different stacked GM maize events [GA21×MIR604 (zSSIIb, nos terminator, mcry3A, mepsps), Bt11×GA21×MIR604 (zSSIIb, 35S promoter, nos terminator, mcry3A, mepsps, cry1Ab, pat), MON863×MON810 (zSSIIb, 35S promoter, nos terminator, cry3Bb1, cry1Ab), MON863×MON863 (zSSIIb, 35S promoter, nos terminator, cry3Bb1, cp4epsps), MON863×MON810×NK603(zSSIIb, 35S promoter, nos terminator, cry3Bb1, cp4epsps, cry1Ab)]. Individually inserted gene in the stacked GM maize was amplified by performing the multiplex PCR in a single reaction. And the PCR products were hybridization with seventeen probes into the Microarray chip. Finally, chip image was analyzed by GENEFIX PRO 6.0 program. 39 samples in the markets were selected and monitored by microarray detection. Total 150 grains have been monitored and some grains were identified to different king of GM stacked maize. 본 연구는 DNA microarray 기술을 이용하여 복합형질유전자재조합 옥수수에 대하여 모니터링 한 연구이다. DNA microarray 기술에는 다양한 복합형질유전자재조합 옥수수의 형질을 검출하기 위해서 construct-specific 프라이머와 event-specific 프라이머를 사용하였다. 프라이머는 옥수수 내재유전자인 SSIIb(zSSIIb)와 스크리닝 요소인 35S promoter와 NOS terminator 그리고 현재까지 개발된 복합형질유전자재조합 옥수수가 포함하는 13개의 형질을 검출할 수 있도록 개발되었다. 또한 18S ribosomal RNA 프라이머를 제작하여internal positive control 과 false negative control로 사용하여 총 17개의 형질을 검출하도록 제작되었고, 프로브 역시 17종의 형질을 검출할수 있도록 제작되었다. 프로브는 30bp로 제작하여 슬라이드 글라스에 부착하였다. 본 연구는 5가지 복합형질유전자재조합 옥수수[GA21×MIR604 (zSSIIb, nos terminator, mcry3A, mepsps), Bt11×GA21×MIR604 (zSSIIb, 35S promoter, nos terminator, mcry3A, mepsps, cry1Ab, pat), MON863×MON810 (zSSIIb, 35S promoter, nos terminator, cry3Bb1, cry1Ab), MON863×MON863 (zSSIIb, 35S promoter, nos terminator, cry3Bb1, cp4epsps), MON863×MON810×NK603(zSSIIb, 35S promoter, nos terminator, cry3Bb1, cp4epsps, cry1Ab)]에 대해서 분석을 실시하였다. Multiplex PCR을 수행하여 개별적인 유전자를 동시에 증폭하였고, 증폭산물은 17개의 프로브와 하이브리드를 형성하였다. 마지막으로 제작된 Chip의 이미지를 GENEFIX PRO 6.0 프로그램을 이용하여 분석하였다. 시장에서 구입한 39종의 옥수수 샘플에서 낱알을 선별하여 모니터링 하였다. 총 150개의 낱알에 대해서 모니터링하였으며, 몇몇의 낱알에서는 다른 종류의 복합형질유전자재조합 옥수수로 확인되었다.

탄수화물 마이크로어레이 기반의 당과 단백질 상호작용을 위한 분석 및 합성 연구 : Carbohydrate Microarray-based Analysis and Synthesis for Carbohydrate-Protein Interaction

김창섭 포항공과대학교 일반대학원 2013 국내박사

Since active researches on genomics and proteomics, in vitro studies on functions of carbohydrate in living organisms have received significant attention. The carbohydrate plays significant roles for biological processes including the folding of nascent proteins, subcellular targeting of enzymes, mechanisms of an infection (microbe-host interaction), and mechanisms of inflammation and immunity through interaction with protein in solution or on the cell surface. Although functional studies of carbohydrate-protein interaction can provide important information on understanding critical biological roles of carbohydrates and biological processes in living organisms, the function analyses have several restrictions; (1) difficulty of obtaining glycans from nature or synthesizing them chemically and (2) the absence of high-throughput analytical tools. To overcome the limitations and analyze the carbohydrate-protein interaction functionally, we developed efficient and facile method for development of functional and high-throughput carbohydrate microarray platform. By using the carbohydrate microarray, we efficiently analyzed interaction between Vibrio cholerae toxin (ctx) and carbohydrates, and performed glycosyltransferase-based glycosylation reaction. Also, we characterized new glycosyltransferase WbeW from V. cholerae O1 to contribute to prepare a glycan library with various structures and understand the glycosylation process of V. cholerae O1. First, we proposed a facile, efficient, and cost-effective method whereby diverse carbohydrate types are modified in a single step and directly immobilized onto a glass surface, with retention of functional orientation. We modified various types of carbohydrates by reductive amination, in which reducing sugar groups were coupled with 4-(2-aminoethyl)aniline, which has di-amine groups at both ends. The modified carbohydrates were covalently attached to an amino-reactive NHS-activated glass surface by formation of stable amide bonds. This proposed method was applied for efficient construction of a carbohydrate microarray. The carbohydrate microarray prepared by using this method enables to analyze interactions between lectin (glycan-binding protein) and glycan efficiently. This result demonstrated the possibility of carbohydrate microarray for in vitro functional analysis of diverse glycan-related biomolecular interactions. Second, we applied the carbohydrate microarray combined with a fluorescence immunoassay to analyze the interaction of ctx proteins and GM1-related carbohydrates. Understanding the ctx-carbohydrate interaction enables to detect the actual ctx and prevent the ctx-originated infection efficiently. Ctx proteins were loaded onto the surface-immobilized GM1 pentasaccharide and six GM1 analogue carbohydrates, and their binding affinities were detected immunologically. The analysis of the ctx-carbohydrate interactions revealed that the intrinsic selectivity of ctx was GM1 pentasaccharide >> GM2 tetrasaccharide > asialo GM1 tetrasaccharide ≥ GM3 trisaccharide, indicating that a two-finger grip formation and the terminal monosaccharides play important roles in the ctx-GM1 interaction. In addition, whole cholera toxin (ctxAB5) had a stricter substrate specificity and a stronger binding affinity than only the cholera toxin B subunit (ctxB). Based on the quantitative analysis, the carbohydrate microarray showed sensitive detection of the ctxAB5-GM1 interaction with a limit-of-detection (LOD) of 2 ng mL-1 (23 pM), which is comparable to other reported high sensitivity assay tools. In addition, the carbohydrate microarray successfully detected the actual toxin directly secreted from V. cholerae O1, without showing cross-reactivity to other bacteria. These results demonstrate that the functional carbohydrate microarray is suitable for analyzing toxin protein-carbohydrate interactions and can be applied as an effective biosensor for toxin detection. Enzymatic glycosylation on solid surface is a meaningful event to improve the limitation of glycan synthesis and provide diverse glycan sources to use for analyzing carbohydrate-protein interaction on surface. Thus, we checked the feasibility of enzymatic glycosylation on the carbohydrate microarray. Three glycosyltransferases were used as target enzyme to synthesize GM1-related carbohydrates such as GM1 pentasaccharide, GM2 tetrasaccharide, and GM3 trisaccharide. Analysis of enzymatic glycosylation revealed that the glycosyltransferases successfully transferred donor sugar to immobilized acceptor glycan on the solid surface. Through the solid surface-based glycosylation, GM1 pentasaccharide, GM2 tetrasaccharide, and GM3 trisaccharide were successfully synthesized on lactose-immobilized surface although the glycosylation yield was low in current conditions. These results presented that combining the carbohydrate microarray platform with enzyme-based glycan synthesis method can serve a strategy to improve the difficulty of obtaining glycan sources and provide a new direction toward studies about glycan synthesis and glycan-related interaction analysis. Finally, we characterized new glycosyltransferase WbeW from V. cholerae O1 to contribute to prepare a glycan library with various structures and understand the in vivo glycosylation process of V. cholerae O1. Sequence and topology analyses of WbeW revealed that the protein might be a member of polyisoprenyl phosphate hexose-1-phosphate transferase (PHPT) family. Through studies of subcellular location of His6-WbeW protein and its derivatives, which deleted with several amino acids from N-terminus, we found that the His6-WbeW protein was associated to membrane and its membrane association might be affected by diverse factors as well as α-helix transmembrane domain. The activity assay showed that the protein catalyze the transfer of galactose-1-phosphate from UDP-Gal to undecaprenyl phosphate. This is the first report that initial glycan of O-antigen fo

기준 탐침자가 적용된 DNA microarray를 이용한 미생물 군집 구조의 정량적 분석법

송지현 韓國外國語大學校 大學院 2006 국내석사

DNA microarray를 기초로 하여 미생물의 군집 구조를 정량 분석하기 위해, reference probe를 적용 시킨 DNA microarray를 고안하였다. 미생물의 군집 구조를 DNA microarray로 분석하기 위해서 16S rDNA 유전자를 증폭시켜주는 PCR 과정이 필요 하였다. 그러나 유전자의 양에 대한 판단에서 PCR 증폭의 상대적인 효율이 부정확하다는 한계가 발생하였다. 따라서 16S rRNA 유전자의 PCR 증폭에서 잠재적인 bias의 정도를 조사하고, 각 군집 구성원의 상대적인 유전자의 빈도수가 PCR 전의 빈도수를 반영하는지에 대한 실험을 하기 위해, P. fluorescens, R. eutropha의 genomic DNA를 여러 비율로 혼합하여 모델군집을 제작하고, 16S rRNA 유전자를 universal primer로 증폭 시켰다. 각 PCR amplicon의 정량은 DIG로 표지 된 oligonucleotide probe를 사용한 dot-blot hybridization을 하고, hybridization 강도를 densitometric으로 분석하였다. PCR 산물과 template와의 비율을 비교해 본 결과, template들의 비율이 높을 때(<1/10과 >10) 상당히 많거나 적게 증폭됨을 알 수 있었고, 반면에 중간 범위의 비율(1/10~10)에서의 왜곡은 무시 할 수 있을 정도였다. 또한 PCR cycles 수를 감소시키는 것이 산물의 상대적 비율에 영향을 주지 않음을 알 수 있었다(ANOVA, p>0.05). 본 연구를 통해, PCR 증폭 후 소수종은 과대평가, 우점종은 과소평가 됨을 보였고, PCR 증폭의 왜곡은 피할 수 없는 문제이기에 미생물 군집 분석에 있어서 결과 해석에 주의가 필요함을 제시하였다. PCR로 인한 정량적인 왜곡을 배제시키기 위하여 E. coli, P. fluorescens, R. eutropha의 16S rDNA 유전자로 구성된 모델군집과 reference DNA로 lambda(λ) DNA를 사용하여 실험하였다. 결과, Microarray에 고정된 probe 양의 편차와 hybridization 정도의 공간적인 편차에 영향을 받지 않는, 표준화된 signal을 얻었으며, hybridization signal로부터 표적미생물의 농도를 추정할 수 있는 회귀식을 도출하였다. 또한 감지 한도(10ng) 보다 높은 DNA 농도에서 log signal ratio 값과 log DNA 농도 값 간의 유의성 (r2=0.97) 있는 선형을 얻었다. 기준 탐침자가 적용된 oligonucleotide microarray와 본 연구에서 추론된 공식은 hybridization signal ratio로부터 표적 genome을 정량적으로 측정하기 위한 간단하고 편리한 방법으로 사용될 수 있을 것이다. We developed a microarray-based method for analyzing microbial community structure. The method employed reference probe, which provided the standardization that allowed the microarray to quantify the target gene. DNA microarrays for analyzing microbial community structure required the PCR amplification of 16S rRNA genes. We tested the method using a model community comprised of 16S rDNA genes of E. coli, P. florescens, R. eutropha and lambda (λ) DNA as the reference DNA. Regardless of the variations in the amount of DNA spotted on the microarray and spatial variation in the extent of hybridization, these standardized signals were then comparable to each other, providing quantitative measures of the extent of hybridization between probes and samples. We observed a good linearity between the log signal ratio and log DNA concentration at DNA concentration above the method’s detection limit, which was approximately 10ng. This approach for designing quantitative oligonucleotide microarrays and the inferred equation from this study provide a simple and convenient way to estimate the target genome concentration from the hybridization signal ratio. However, inferences about gene abundance have been limited by uncertainties about the relative efficiency of gene amplification in the PCR. To explore the extent of potential bias in PCR amplification of 16S rRNA genes (rDNAs) and especially to test whether relative gene frequencies of individual community members are adequately represented in post-PCR amplicon frequencies, genomic DNAs of two bacterial species were mixed in various ratios establish model communities, and 16S rRNA genes were amplified with universal primers. Quantification of each PCR amplicon was performed by dot-blot hybridization using DIG-labeled oligonucleotide probes followed by densitometric determination of hybridization intensities. Comparison of template to PCR product ratio showed that there were considerable over- and under-amplification in cases of high template ratios (<1/10 and > 10, respectively), while such bias was negligible in mid-range ratios (1/10~10). Reduces number of PCR cycles did not affect the relative product ratios (ANOVA, p>0.05). This study showed that rare members were overestimated and dominant members were underestimated after PCR-amplification, and such PCR-amplification bias is ineviTable, suggesting careful interpretation of the results in microbial community profiling studies

부분적으로 절편된 조직의 RNA를 이용한 위장관 암의 유전자 발현 양상

양연주 연세대학교 대학원 2006 국내석사

cDNA microarray 기법은 암 연구 분야에서 여러 종류의 종양을 진단하는데 있어서 생물학적 표지자를 동정하거나 항암치료의 효과를 예측하는데 널리 적용되고 있다. 하지만 유용하게 사용되고 있는 cDNA microarray의 경우 많은 양의 RNA나 양질의 RNA를 필요로 하는 제한점을 가지고 있다. RNA amplification은 RNA의 양의 제한점을 극복하기 위해 고안되었으며, 현 시점에서 실험에 사용될 수 없어 절편된 RNA를 이용할 수 있는 방법이 필요로 되고 있다. 따라서, 본 연구에서는 절편된 RNA를 이용한 cDNA microarray 실험의 가능성과 그 유용성을 알아보고자 하였다.YCC-16 위암 세포주의 양질의 RNA에 RNase와 NaOH를 처리하여 절편된 RNA를 만들어 RNA 증폭이 가능함을 확인하였고, 7.5K cDNA microarray를 이용하여 RNA 증폭을 기반으로 한 cDNA microarray를 수행하여 분석 가능한 결과를 얻을 수 있었다. 양질의 RNA와 절편된 RNA를 비교하기 위하여 상관계수와 discordance를 구하여 비교한 결과, 양질의 RNA와 절편된 RNA를 이용한 실험의 결과가 유사함을 확인하였다.실제 임상시료 중 절편된 대장암과 위암의 정상 및 종양조직을 각각 10 예씩을 가지고 17K cDNA microarray를 이용하여 RNA 증폭을 기반으로 한 cDNA microarray를 수행하였다. 그 결과 소량의 ribosomal peak이 남아있을 정도로 절편된 경우 microarray 실험을 통하여 유전자 발현 양상을 관찰할 수 있음을 확인하였고, unsupervised clustering을 통해서 절편된 RNA로도 위 조직과 대장 조직 및 정상과 종양조직이 구분되는 것을 관찰하였다.조직을 이용한 microarray 실험에서 절편된 RNA와 양질의 RNA를 비교하고자 대장암과 위암에서 정상과 종양조직, 각각 절편된 RNA 10 예, 양질의 RNA 10 예씩의 microarray 결과를 비교하였다. Unsupervised clustering 결과, 양질의 RNA와 절편된 RNA의 유전자 발현 양상이 다르다는 것을 알 수 있었다. 또한 양질의 RNA에서 정상과 종양조직간의 유의한 유전자로 선정된 169 개 (FDR 0.39%)의 유전자와 절편된 RNA에서 선정된 114 개 (FDR 0.36%)의 유전자 중 12 개의 유전자 만이 겹침으로서, 양질의 RNA와 절편된 RNA의 발현 양상이 차이가 있다는 것을 확인할 수 있었다.RNA의 절편된 정도가 유전자 발현 양상이 달라지는 데에 영향을 미치는지 확인하기 위하여 대장의 절편된 RNA를 깨진 정도에 따라 세 그룹으로 나누어 각 그룹에서 정상과 종양조직간에 유의한 유전자를 선정하였다. 선정된 유전자 군을 비교하였을 때 (A, B, C 각 84, 98, 98 개), 절편 정도가 심하지 않은 A 그룹에서 선별된 유전자 군과 절편 정도가 심한 B나 C그룹에서 선별된 유전자 군은 전혀 일치하지 않았다. 양질의 RNA에서 정상과 종양조직 간에 유의한 것으로 선정된 유전자 (FDR 1 % 142 개)와 비교한 결과, A그룹에서 선정된 유전자 중 38개가 일치하였고, B나 C그룹에서 선정된 유전자와는 일치하지 않음을 관찰하여, RNA의 절편된 정도가 결과에 영향을 미치는 것으로 사료된다.한편 대장암에서 절편된 RNA에서 정상과 종양조직 간에 유의한 유전자로 선정된 유전자 군을 이용하여 양질의 RNA microarray data로 clustering을 시행한 결과 정상과 종양조직이 구분되는 것을 확인하였다. 또한 이는 양질의 RNA에서 선정된 유전자를 가지고 절편된 RNA 결과를 이용하였을 때도 같은 결과를 얻을 수 있었다. 즉, 절편된 RNA를 이용하였을 경우 양질의 RNA를 이용한 실험에서와는 다른 종양 관련 유전자 군이 선정되나, 그 유전자 군도 생물학적으로 유용함을 제시하고 있다.본 연구의 결과를 통하여 부분적으로 절편된 RNA를 이용하여 유전자 발현 양상의 관찰이 가능하다는 것은 보여주었고, 적절한 생물학적 의미를 위해서는 좀 더 주의 깊은 분석과 검증이 필요할 것으로 생각된다.Recently, cDNA microarrys are widely applied in cancer research to identify the candidate biomarkers for prognosis of various cancers or predicting the efficacy of cancer therapy. Besides the limitation of RNA amount in cDNA microarray, the other significant limitation is the requirement of good quality of RNA. Various RNA amplification methods have been devised to overcome limitation of amounts and there had been strong demands to use even the partially degraded RNAs for gene expression analysis.The purposes of this study are to evaluate the possibility of using degraded tissue RNAs for gene expression analysis and to evaluate the reliability of the microarray data from the degraded RNA.Intact RNA from YCC-16 gastric cancer cell and their degraded products were prepared by RNase A or NaOH treatment. T7 linear RNA amplification-based cDNA microarray with intact and degraded RNA using 7.5K human cDNA microarray in an indirect design was performed. The degraded RNA was successfully amplified and the quality of microarray data was acceptable for gene expression profiling. To evaluate the similarity between intact and degraded RNA a Pearson correlation coefficient (r2) and discordance rates were analyzed. The correlation coefficients between 3 conditions were 0.93 between I-RNA and Rd-RNA and 0.86 between I-RNA and Nd-RNA. The quantity discordance rate was decreased at the larger fold-changes.Next, T7 linear RNA amplification-based cDNA microarray with partially degraded colon and gastric tissue RNAs (10 normal & 10 tumor tissues for each tumor type) using 17K human cDNA microarray in an indirect design were performed. After the preprocessing, the gene expression profiling was compared with previous microarray data of intact tissue RNAs (10 normal & 10 tumor tissues for each tumor type) using unsupervised clustering and the differentially expressed genes between normal and cancer tissues using SAM.The degraded tissue RNAs with at least one ribosomal peak could be successfully amplified and resulted in reliable gene expression profiling. However, the gene expression patterns of intact and degraded RNAs were different both in clustering and selected genes. Among the selected colon cancer specific genes, 114 (FDR 0.36%) in intact and 169 (FDR 0.39%) in degraded tissues, only 12 genes between them were overlapped, and the functional category of selected genes in each condition was not exactly identical.In order to evaluate the influence of degraded states, a partially degraded colon tissue RNAs were divided into three groups. As the selected significant genes from intact RNA data tend to more similar to A group of mild degraded RNA than B, C group of moderate to severely degraded RNA, it is suggested that the degree of RNA degradation might affect the expression profiling.Although the selected genes differ with in intact RNA and degraded RNA, to observe the reliability of selected significant genes in degraded RNA microarray data, results of clustering using the selected significant genes in degraded RNA to intact microarray data set showed could classify normal and tumor, and vise versa.In summary, the gene expression profiling is possible using partially degraded tissue RNAs, but the cautious data analysis for relevant biological meaning is needed.

병원성 미생물 특이적 검출을 위한 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이의 바이오마커 개발

신화희 포항공과대학교 일반대학원 2016 국내박사

Foodborne diseases occur world-widely and threaten the public health. Their symptoms are generally mild, but severe symptoms and/or death can be occurred in particular patients. The most common causative agent of foodborne diseases is pathogenic bacteria. To prevent the foodborne diseases and minimize the damages from pathogenic bacteria which are contaminated in foods, it is important to detect and diagnose pathogenic bacteria rapidly, accurately, and simultaneously. A lot of detection and diagnosis methods have been developed to detect bacteria. Culture-based conventional methods are commonly used to detect bacteria, but they are time-consuming, labor-intensive, and difficult to quantitatively analyze. To overcome the long detection time, diverse technologies including molecular-based methods have been devised. Particularly, DNA microarray is considered as potential device for pathogen identification because it can allow multiple, rapid (high-throughput), specific, and sensitive screening. A DNA microarray for pathogen detection is composed of many separately located capture probes of pathogen-specific DNA sequences. Ribosomal DNA or bacterial species-specific genes including housekeeping genes, virulence factors, and antibiotic resistance determinants have been commonly selected as biomarkers for pathogen detection. Several oligonucleotide microarrays based on 16S rRNA sequence information have been developed to detect bacteria, because 16S rRNA containing conserved and variable sequences has been widely used for phylogenetical discrimination. Previously, 16S rRNA-based oligonucleotide microarray was established to detect eleven strains of pathogenic bacteria in our research team. In spite of advantages of 16S rRNA as detection marker, 16S rRNA-based microarray systems, including those in our previous system, showed limitation of difficulty in analysis of actual pathogenicity of bacteria such as Vibrio cholerae and definitive discrimination of serotype or phylogenetically close species such as Salmonella enterica subsp. enterica due to the low sequence diversity among them. In this thesis, several new detection biomarkers-based oligonucleotide microarrays were devised for effective, selective, and accurate detection of pathogenic bacteria. 16S rRNA-based oligonucleotide microarray was developed to detect the common pathogenic bacteria being frequently occurred in contaminated foods. Next, a hybrid microarray containing DNA and carbohydrate capture probes was suggested to detect pathogen and simultaneously analyze its pathogenicity. In addition, novel detection maker genes-based oligonucleotide microarrays were constructed for selectively identifying and discriminating highly closed serotypes of S. enterica subsp. enterica. First, we additionally designed specific capture probes based on 16S rRNA genes to supplementarily detect extra five pathogenic strains such as Bacillus cereus, Campylobacter jejuni, Clostridium perfringens, Shigella boydii, and Shigella sonnei, which are frequent in contaminated foods and agricultural products. Capture probes were designed and verified by in silico analysis and hybridization. Using 16S rRNA-based microarray, we could successfully detect 15 pathogenic bacteria using distinctive signal patterns. Additionally, for practical application of the microarray, we employed simple pretreatment protocol of various food matrixes. It was possible to successfully isolate bacteria from foods and use in microarray-based detection. Consequently, the oligonucleotide microarray based on 16S rRNA is able to selectively, sensitively, and practically detect common bacteria pathogens and useful to monitor food safety. Next, we constructed a hybrid type microarray system that was composed of double biomolecular DNA and carbohydrate capture probes to detect cholera toxin-producing Vibrio cholerae. 16S rRNA-based DNA capture probes and GM1 carbohydrate capture were used to discriminate V. cholerae from other pathogenic bacteria and detect cholera toxin for evaluating its pathogenicity, respectively. We also employed a simple preparation method to directly obtain genomic DNA and secreted toxin from cultured cells. Both V. cholerae and produced cholera toxin were detected specifically by using the constructed double biomolecular marker (DBM) microarray without cross-reactivity to other nonspecific pathogenic bacteria. The DBM microarray was also able to evaluate the pathogenicity of the detected V. cholerae regardless of toxin production. Collectively, these results demonstrate that the proposed DBM microarray is an efficient, simple, and powerful tool to detect both V. cholerae and CT for simultaneous evaluation of bacterial pathogenicity. Particularly, serotypes of S. enterica subsp. enterica could not be selectively discriminated by using the 16S rRNA-based oligonucleotide microarray due to highly similar gene sequences of 16S rRNAs. Thus, novel detection biomarker gene, the carbamoyl-phosphate synthetase (CPS) large subunit (carB) gene was selected to detect and discriminate three major pathogenic S. enterica subsp. enterica serotypes: Choleraesuis, Enteritidis, and Typhimurium. We designed serotype-specific capture probes and one Salmonella positive control probe, based on the carB sequence and constructed an oligonucleotide microarray. Using the developed oligonucleotide microarray and the designed universal primer set for preparing a labeled fragment of the target carB gene, three serotypes of S. enterica subsp. enterica were specifically and clearly analyzed and discriminated. The serotype-specific capture probes did not display cross-reactivity with common pathogenic bacteria. Consequently, the developed carB-based oligonucleotide microarray can be used as a potential biosensor system to detect and distinguish the major S. enterica subsp. enterica serotypes efficiently, rapidly, selectively, and reliably. Even though the carB-based oligonucleotide microarray was effective and specific to detect three major serotypes, it was quite difficult to extend the additional target serotypes, because the highly related serotypes share almost the same sequences of carB gene. Therefore, it was necessary to find a new biomarker for discrimination of most of serotypes. We performed the comparative genome analysis to find appropriate marker gene for effective serotype discrimination. Based on the comparative genome analysis, we selected the thiazole synthase subunit H (thiH) gene. ThiH gene was expected that it could be used as marker gene to specifically discriminate the serotypes of S. enterica subsp. enterica because it was verified through phylogenetic analysis. Thus, we designed 43 serotype-specific capture probes based on thiH gene to detect 30 serotypes of S. enterica subsp. enterica. Using the constructed thiH-based oligonucleotide microarray and designed universal primer set for preparing a labeled thiH amplicons, total 30 serotypes of S. enterica subsp. enterica were successfully detected based on the distinctive signal codes. When the detected spots were visually analyzed, there were some doubtful signals to consider as positive or negative. Thus, we applied the quantitative and statistical determination of signals based on log2(S/N) and paired t-test. According to evaluated values of log2(S/N) and p-values, the signals of capture probes were determined and optimized by eliminating several probes which did not make signals or were not essential to produce signal codes. In addition, the thiH-based specific capture probes were confirmed to have no cross-reactivity with five non-Salmonella pathogenic bacteria which are closely related with Salmonella. Collectively, the thiH-based oligonucleotide microarray containing 28 specific capture probes can be applied to detect and differentiate the various serotypes of S. enterica subsp. enterica serotypes selectively, reliably, and efficiently. 식중독은 매년 전세계적으로 발생하며 공중 위생을 위협한다. 식중독 증상은 보통 가벼운 편이지만 특정 환자에게서 심각한 증세 혹은 사망까지도 일으킬 수 있다. 식중독의 가장 빈번한 원인은 병원성 미생물이며 식중독을 예방하고 오염된 음식물 내 병원성 미생물로 인한 피해를 최소화하기 위해서는 빠르고 정확하게 병원성 미생물들을 동시 검출하고 진단하는 것이 매우 중요하다. 많은 병원성 미생물 검출 및 진단법들이 현재까지도 개발되고 있다. 그 중 배양 기반의 전통적 검출 방법이 가장 보편적으로 사용되지만 검출 시간이 길고, 많은 노동력을 요하며 정량 분석이 어렵다는 한계가 있다. 이에 긴 검출 시간의 한계를 극복하기 위해서, 분자생물학적 기반의 다양한 기술들이 개발되고 있다. 그 중 DNA 마이크로어레이는 특이적이고 민감하며 다양한 대상을 동시에, 빠르게 검출할 수 있어 병원성 미생물 검출을 위한 잠재적인 기술로 기대되고 있다. 병원성 미생물을 검출을 위한 DNA 마이크로어레이는 많은 수의 특이적 검출 탐침 (Probe)으로 구성되어 있는데 이 검출 탐침은 미생물에 특이적인 DNA 유전자 서열들이다. 리보솜 DNA나 하우스키핑 유전자, 독성 인자 유전자, 그리고 항생제 내성 유전자와 같은 미생물 특이적 유전자가 주로 사용되고 있다. 16S rRNA는 보전적 유전자 서열과 가변성 유전자 서열을 모두 가지고 있으며 계통 발생적 분류에 폭넓게 이용되고 있기 때문에 16S rRNA 기반으로 여러 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이들이 병원성 미생물 검출을 위해서 개발되었다. 11종의 병원성 미생물 검출을 위한 16S rRNA 기반의 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이도 본 연구팀에서 개발한 바가 있다. 검출 마커 유전자로써 16S rRNA는 여러 장점이 있지만, 살모넬라와 같이 매우 유사한 유전자 서열을 가진 병원성 미생물의 혈청형 혹은 계통 발생적으로 가까운 종 간의 완벽한 구분 검출이 어렵다. 또한, 비브리오 콜레라와 같은 병원성 분석도 필요한 미생물의 경우, 검출은 가능하지만 실질적인 미생물의 병원성을 분석하기는 어렵다. 따라서, 본 연구에서는 이러한 한계들을 보완하며 효과적이고 특이적이며 정확하게 병원성 미생물을 검출할 수 있는 새로운 검출 마커들을 기반으로 한 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이들을 고안하였다. 먼저, 기존처럼16S rRNA 기반의 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이를 이용하여 식품에서 주로 발생하며 지속적인 감시가 필요한 주요한 16종의 병원성 미생물을 검출하고자 하였다. 그리고 당과 DNA 기반의 검출 탐침을 가진 하이브리드 마이크로어레이를 제안하였으며 이것을 이용하여 박테리아 (비브리오 콜레라)를 검출하는 동시에 그것의 병원성을 분석하고자 하였다. 또한, 높은 유사성을 가진 살모넬라의 혈청형 (Serotype)을 특이적으로 구분 검출하기 위해서 새로운 유전자 기반의 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이들을 개발하였다. 제 2장에서는 기존의 11종 병원균 검출 외에 식품 공전에서 자주 발생하며 빠른 검출을 필요로 하는 바실러스 세리우스, 시겔라 보이드, 시겔라 소네이, 클로스트리디움 퍼프린젠스의 5종의 병원성 미생물을 추가적으로 검출하기 위해 16S rRNA를 기반의 특이적 검출 탐침을 디자인하였다. 디자인한 검출 탐침들은 인실리코 분석 및 DNA 혼성화 실험을 통해 검증하였으며 이 검출 탐침들을 포함한 16S rRNA 기반 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이를 이용하여 15종의 병원성 미생물들을 각각의 특이적 신호 패턴을 이용하여 성공적으로 검출할 수 있었다. 또한, 개발한 마이크로어레이의 실용적 응용을 위하여 다양한 식품 매트릭스들을 위한 간단한 전처리 방법을 개발하였다. 전처리를 통해 얻은 박테리아 세포들을 마이크로어레이에 직접적으로 적용이 가능함을 확인하였다. 결과적으로 16S rRNA 기반 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이는 빈번이 발견되는 병원성 미생물에 대한 특이적이며 민감하며 실용적인 검출이 가능하며 식품 안전 감시 및 감독에도 유용할 것이다. 제 3 장에서는 하이브리드 타입으로 DNA와 당 (Glycan) 탐침으로 이루어진 이중 생체 분자 마커 마이크로어레이 시스템을 콜레라 독소를 생산하는 비브리오 콜레라를 검출하기 위해 개발하였다. 비브리오 콜레라를 다른 병원성 미생물로부터 구분 검출하기 위해 16S rRNA 기반 DNA 탐침을, 콜레라 독소를 검출하고 병원성을 알아보기 위해 GM1 당 탐침이 사용되었다. 또한, 배양액으로부터 유전체 DNA와 분비된 콜레라 독소를 바로 얻기 위한 간단한 준비 방법도 개발했다. 제작된 이중 생체 분자 마커 마이크로어레이를 이용하여 비브리오 콜레라와 콜레라 독소 모두 다른 비특이적 병원성과의 교차반응성 없이 선택적으로 검출되었다. 또한, 검출된 비브리오 콜레라의 독소 생산 여부를 통해 비브리오 콜레라의 병원성을 추정할 수 있다. 이러한 결과를 토대로 종합해보면, 제안된 하이브리드 이중 생체 분자 마커 마이크로어레이는 비브리오 콜레라와 콜레라 독소를 검출하고 동시에 미생물의 병원성을 분석할 수 있는 효과적이며 간단하고 강력한 방법이다. 제 4 장에서는 매우 높은 유전자 유사성으로 인해16S rRNA 기반 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이를 이용해 특이적 구분 검출이 어려웠던 중요한 살모넬라 엔테리카의 혈청형 3종 (살모넬라 엔테라이티디스, 살모넬라 콜레라수이스, 살모넬라 티피뮤리움)을 효과적으로 검출하기 위해서 새로운 유전자 마커인 carB (카르바모일인산합성효소 큰 소단위체 유전자)를 선정하였다. 우리는 carB 유전자 서열을 기반으로 혈청형 특이적인 검출 탐침과 살모넬라 양성 대조군 탐침을 디자인하였으며 이를 기반으로 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이를 제작하였다. 이를 이용하여 대상인 3종의 혈청형을 특이적이고 명확하게 구분 검출할 수 있었으며 또한, 다른 병원성 미생물과 교차반응성이 없음을 확인하였다. 결과적으로 개발된 carB 기반 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이는 주요 살모넬라 혈청형을 효과적이고 빠르며, 특이적이며 신뢰성 있게 구분 및 검출할 수 있는 가능성 있는 바이오칩 시스템이 될 수 있다. CarB 기반 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이는 살모넬라 엔테리카 주요 3종을 효과적이고 특이적으로 검출 할 수 있었지만 추가적으로 대상 혈청형을 확장하는데 어려움이 있었는데 이는 몇몇 매우 가까운 혈청형들이 동일한 carB 유전자 서열을 가지기 때문이다. 따라서, 대부분의 혈청형을 구분 검출할 수 있는 새로운 바이오마커 유전자가 필요했다. 이를 위해 제 5장에서는 새로운 적절한 바이오마커 유전자를 찾기 위해 유전체 비교 분석을 하였으며 그 결과 티아졸 합성효소 소단위체 에이치 (thiH) 유전자 서열을 선정하였다. ThiH 유전자 서열은 계통수 분석을 통해 살모넬라 엔테리카 혈청형들을 특이적으로 구분할 수 있을 것으로 기대되었다. 총 30종의 살모넬라 엔테리카 혈청형을 검출하기 위해서 thiH 기반 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이를 위해 43개의 혈청형 특이적 검출 탐침을 디자인 하였다. 이를 이용하여 30종의 혈청형에 대해서 각각의 특유 시그널 코드가 형성되어 성공적으로 검출할 수 있음을 확인하였다. 검출된 스팟을 시각적 분석한 결과, 신호의 양/음성 판별이 모호한 경우가 있었다. 이를 해결하기 위해 정량적이고 통계적인 판별법을 도입하였는데 신호 대 배경값 비율의 바이너로그값(log2(S/N))과 대응표본 검증(t-test)을 신호 판별에 이용하였다. 계산된 수치를 바탕으로 검출 탐침 신호를 판별하고 이를 바탕으로 최종적으로 최적화하였다. 또한, thiH 기반 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이는 살모넬라에 속하지 않지만 가까운 5종의 병원성 미생물과 교차반응성을 가지지 않음을 확인하였다. 따라서, thiH 기반 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이는 살모넬라 엔테리카의 다양한 혈청형을 선택적이며 신뢰성이 있으며 효과적으로 검출 및 구별할 수 있다.

Detection of Genetically Modified Organisms Using Multiplex PCR and DNA Microarray

김재환 경희대학교 2008 국내박사

본 연구는 다양한 유전자변형 작물들을 동시에 검출할 수 있는 multiplex PCR법과 microarray법 개발에 관한 것이다. 여러 유전자변형 작물에 대한 multiplex PCR을 위해 construct-specific primers와 event-specific primers가 제작되었다. 8종의 유전자변형 옥수수(Bt176, Bt11, MON810, MON863, NK603, T25, TC1507, GA21)의 multiplex PCR은 2개의 tube에서 각각 4종씩의 유전자변형 옥수수들이 분석될 수 있도록 개발되었다. 또한 3종의 유전자변형 카놀라(GT73, MS8xRF3, T45)와 4종의 유전자변형 면화(MON1445, MON15985, MON88913, LLcotton25)에 대한 multiplex PCR법이 개발되었다. 그리고 18종의 유전자변형 작물을 구별할 수 있는 microarray분석법이 개발되었다. 18종의 유전자변형 작물들은 2종의 유전자변형 콩(GTS 40-3-2, A2704-12), 12종의 유전자변형 옥수수 (Bt176, Bt11, MON810, MON863, NK603, GA21, T25, TC1507, Bt10, DAS59122-7, TC6275, MIR604), 3종의 유전자변형 카놀라(GT73, MS8xRF3, T45), 그리고 1종의 유전자변형 면화(LLcotton25)를 포함한다. 이러한 유전자변형 작물들에 대한 microarray분석법은 screening targets(35S promoter, nos terminator), endogenous reference targets, event-specific targets, 그리고 internal targets에 대한 각각의 event-specific primers와 probes을 포함한다. 18S rRNA probe가 반응의 효율성을 평가하기 위한 internal control로 이용되었다. lectin, starch synthase IIb (SSIIb), fatty acyl-ACP thioesterase (FatA), acyl carrier protein (Acp1), sucrose phosphate synthase (SPS) 유전자들이 콩, 옥수수, 카놀라, 면화, 쌀에 대한 각각의 내재유전자로 선별되었다. 각각의 probes의 특이성은 microarray를 실시하여 평가되었고, 개발된 microarray분석법의 검정한계치(Limit of detection)는 콩(GTS 40-3-2)과 옥수수(MON810)의 %별 표준시료를 이용하여 측정되었다. 각각의 검정한계치는 콩의 경우 0.5%, 옥수수의 경우 1% 로 나타났다. 본 연구에서 개발된 이러한 방법들이 다양한 유전자변형 작물들에 대한 신뢰할 만한 효과적인 검사법으로 이용될 수 있을 것이다. In this study, multiplex polymerase chain reaction (PCR) method and microarray system were developed for simultaneous identification of various genetically modified organisms (GMOs). For multiplex PCR of various GMOs, construct-specific and event-specific primers were used. Multiplex PCR for eight different events (Bt176, Bt11, MON810, MON863, NK603, T25, TC1507, and GA21) of genetically modified (GM) maize were performed in two tubes. Two sets of multiplex PCR system were used to amplify each of four GM maizes. Also, multiplex PCR methods for three different events of GM canola (GT73, MS8xRF3, and T45) and four different events of GM cotton (MON1445, MON15985, MON88913, and LLcotton25) were developed. In addition, microarray analysis was performed to distinguish eighteen different GM events, which contain two GM soybeans (GTS 40-3-2 and A2704-12), twelve different events of GM maize (Bt176, Bt11, MON810, MON863, NK603, GA21, T25, TC1507, Bt10, DAS59122-7, TC6275, and MIR604), three different events of GM canola (GT73, MS8xRF3, and T45), and one GM cotton (LLcotton25). The microarray system includes event-specific primers and probes for screening targets (35S promoter and nos terminator), endogenous reference targets, event-specific targets, and internal targets. The 18S rRNA probe was used as an internal control to assess the efficiency of all reactions and to eliminate false negatives. The genes corresponding to lectin, starch synthase IIb (SSIIb), fatty acyl-ACP thioesterase (FatA), acyl carrier protein (Acp1), and sucrose phosphate synthase (SPS) were chosen as endogenous reference genes of soybean, maize, canola, cotton, and rice, respectively. Evaluation of the specificity of probes was performed using the microarray. Limit of detection (LOD) of the microarray system was measured using certified reference materials (CRMs), GM soybean GTS 40-3-2 and GM maize MON810. The values were 0.5% and 1% for GTS 40-3-2 and for MON810, respectively. These methods may offer the possibility of reliable and effective GMO screening analysis.