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- 주제어 : mi transcription factor (검색결과 2 건)
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김대기 OSAKA UNIVERSITY 2000 해외박사
마우스 第6染色體의 mi遺傳子座에는 basic-helix-loop-helix-leucine zipper형 轉寫因子인 mi transcription factor (MITF)이 코드되어 있다. mi遺傳子座에 돌연변이를 일으킨 mi/mi돌연변이 마우스의 피부에는 정상마우스에 비해 비반세포 數의 감소와 分化異常을 보인다. mi/mi 마우스에서 발현하는 變異型 MITF는 DNA結合能과 核移行能의 異常에 의해 특정유전자에 대한 轉寫活性能이 현저히 감소 또는 소실되어 있다. 우리들은 이전에 野生型마우스由來 培養비반세포(+/+ CMC)의 비해 mi/mi 마우스由來 培養비반세포 (mi/mi CMC)의 纖維芽細胞에 대한 接着能이 현저히 저하되어 있는 것을 보고하였다. 최근에 비반세포의 接着에 인테그린이 중요한 역할을 하고 있음이 보고됨에 근거하여 mi/mi CMC에 있어 인테그린 발현이 저하되어 있을 가능성이 높을 것으로 예측되어 그에 관하여 검토하였다. +/+ CMC와 mi/mi CMC에 있어서 인테그린 유전자의 발현을 RT-PCR법으로 해석하였다. 비반세포에 발현하는 인테그린들 중에서 인테그린 알파4亞型의 발현이 +/+ CMC에 비해 mi/mi CMC에서 현저히 저하되어있었다. 그리고 +/+ CMC에서는 인테그린 알파4아형遺傳子 발현이 培養개시후 4주째에 최고가 되고, 그 이후에는 감소하지만, mi/mi CMC에서는 培養후 어느 시기에서도 전혀 발현하지 않았다. 알파4아형의 특이적인 抗體를 이용한 FACS에 의한 解析에서도 RT-PCR법에서와 동일한 결과를 얻었다. 인테그린 알파4亞型의 리간드인 VCAM-1을 强制로 發現시킨 CHO細胞株에 대한 接着率도 +/+ CMC에 비해 mi/mi CMC에서 크게 저하하였다. MITF에 의한 관련성을 조사하기 위해 인테그린 알파4亞型遺傳子의 프로모터領域을 해석하였다. MITF와 結合한다고 알려진 鹽基配列 CACTTG의 존재를 확인하고, CACTTG motif를 포함하는 프로모터領域을 Luciterase 遺傳子의 上流에 揷入하여, 正常型 MITF를 발현하는 IC-2細胞株에 도입하였다 그 결과 Luciferase活性이 증가하였다. CACTTG motif를 消失 또는 變異시키면 Luciferase활성의 상승은 보이지 않았다. CACTTG motif를 포함한 Reporter Plasmid를 正常型 MITF와 동시에 導入하면 Luciferase活性은 상승하지만, 變異型 MITF와 함께 導入하면 Luciferase活性은 상승하지 않았다. 또 EGMSA법에 의한 실험에서 正常型 MITF가 CACTTG motif에 結合함을 알 수 있었다. 이상의 결과로서 mi/mi마우스由來 培養비반세포에는 인테그린 알파4亞型의 발현이 저하되어 있고, 또 정상형 MITF가 인테그린 알파4亞型遺傳子의 프로모터領域에 존재하는 CACTTG motif를 통하여 轉寫를 활성화 한다고 사료된다.
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인간비만세포에서 트립타아제 유전자 발현에 전사인자 MITF-A 아형이 미치는 영향
Mast cells play a central role in initiation and development of allergic diseases through release of various mediators. Tryptase may be a key mediator in mast cell-mediated inflammatory reactions. In the present study, we investigated whether the transcription of tryptase gene in human mast cells was involved in mi transcription factor (MITF). We observed that the human CD34+ progenitor drived cultures and HMC-1 cell line mast cells expressed strongly MITF-A, which is one of MITF isoforms. The overexpression of MITF-A elevated the production of tryptase in the immature human mast cell line HMC-1, while the introduction of specific siRNA against MITF attenuated their expression. Moreover, the transfection of MITF-A overexpression vector and tryptase promoter region-harboring reporter plasmid into Jurkat cells (MITF-negative) increased significantly the luciferase activity. Using mutant constructs of tryptase promoter, we identified that two E-box (CANNTG) motifs associate with MITF-A to transactivate tryptase gene. An experiment by EMSA also showed that these E-box are able to bind to MITF for tryptase gene transcription. These data suggest that MITF might play a role in regulating the transcription of tryptase gene in human mast cells. 비만세포는 다양한 알러지 유발 매개물을 통해 일어나는 알러지의 개시와 전개에 중요한 역할을 한다. 단백질분해 효소인 트립타아제는 비만세포 매개 염증반응의 중요한 매개물이다. 전사인자 MITF (mi transcription factor)는 bHLH-Zip(basic- helix-loop-helix-leucine zipper) 단백질계에 속하는 분자이다. 비만세포의 분화 및 특이적 단백분해효소들의 전사활성을 조절하는 중요한 전사인자임이 보고되었으며, 세포조직에 따라 다수의 MITF아형이 발현하고 있음이 알려졌다. 최근 마우스 골수유래 비만세포에서 MITF 아형 중MITF-A가 강하게 발현함을 보고하였다. 본 연구자는 인간비만세포에서의 트립타아제 유전자의 전사활성이 MITF와 관련함에 대하여 연구하였다. 이를 위해 인간 제대혈에서 전구세포를 분리하여 IL-3, SCF, IL-6존재 하에서 8주 이상 배양하여 성숙 및 분화 시킨 비만세포와 비만세포 세포주를 RT-PCR법을 통해 MITF아형 및 트립타아제 아형 mRNA발현을 분석하였다. 배양된 비만세포 세포주에서 전사인자 MITF-A, -E, H 의 다양한 mRNA가 강하게 발현함을 관찰하였다. 그러나 제대혈로부터 분화된 비만세포에서는 전사인자 MITF-A만 발현하고 있음을 관찰하였다. 트립타아제 아형 mRNA는 세포주와 제대혈로부터 분화된 비만세포주 모두에서 트립타아제 베타1 만이 발현함을 관찰하였다. 따라서 MITF-A가 트립타아제 전사 활성을 조절하는지 여부를 확인하기 위해 전사인자 MITF-A강제발현 프라스미드를 합성하였고, 트립타아제 프로모터영역을 삽입한 repoter 벡터 그리고 이들을 일정크기로 삭제하거나 점돌연변이 시킨 프라스미드를 제작하였다. 강제발현 프라스미드를 트립타아제 프로모터 프라스미드와 함께 Jurkat 세포에 형질도입 하였을 때. 트립타아제 전사활성이 MITF-A의 형질도입에 의해 의미 있게 증가됨을 확인하였다. 트립타아제 프로모터 영역을 일정크기로 단계적으로 삭제한 reporter 프라스미드를 HMC-1에 형질도입 할 경우 -817~-715 사이와 -421~-202 사이의 프로모터 영역이 삭제된 경우에서 Luciferase 활성이 유의적으로 감소함을 관찰하였다. 이 영역에 MITF 결합예상부위인 E-box (CANNTG)가 각각 1개씩 존재하였다. 이들 결합부위를 점돌연변이 시킨 reporter 프라스미드를 HMC-1에 도입 할 경우 전사 활성이 감소함을 확인하였다. EMSA에서 또한 두 전사인자결합부위 모두에 MITF가 결합을 확인하였다. 한편, 미성숙 비만세포주에 MITF-A의 강제발현에 의해 트립타아제 생산이 증가되었으며 MITF 특이적siRNA 의해 트립타아제 생산이 감소되었다. 이러한 결과들은 전사인자 MITF-A가 인간 비만세포에서 트립타아제 프로모터의 E-box 와 결합하여 트립타아제 전사를 조절하는 중요한 인자 일 것으로 사료된다.
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