Studies on the Genes Involved in Keratinocyte Differentiation

윤현경 忠南大學校 大學院 2009 국내박사

In mammals, the epidermis is a stratified epithelium that acts as a barrier preserving the organism from dehydration, uncontrolled thermoregulation and potentially environmental damage. It requires a correct balance between proliferation, differentiation and controlled apoptosis. The process of differentiation implies that basal keratinocytes cease to proliferate, lose adherence to the basement membrane and migrate to outer layers called spinous (SL), granular (GL) and stratum corneum (SC). During human skin development, basal cells move outwards. The gene expression of basal keratinocytes such as keratin K5 is repressed and switches towards differentiation specific markers including keratins K1 and K10. Terminal differentiation of skin keratinocytes is a vertically directed multi-step process that is tightly controlled by the sequential expression of a variety of genes. Previously I examined the gene expression profile, throughout the study, many differentiation-related genes are found to be expressed in a temporally-regulated manner. In this study, I attempted to find the hub-molecules and their intracellular signaling networks during keratinocyte differentiation using in silico analysis of data obtained from previous studies. I used protein-protein interaction prediction software called PSIMAP, and drew a hypothetical signaling network. I chose one candidate hub molecule SHC1 that was predicted to link EGFR and MAPK signal, and then evaluated the protein-protein interactions experimentally. As predicted, SHC1 bound to the MEK1 in an EGF-regulated manner. Furthermore, SHC1 bound to the MEK1 and p38 MAPK in a keratinocyte differentiation -dependent manner. These results demonstrate that in silico protein-protein interaction prediction system can be used to efficiently and cost-effectively select the experimental candidates. Also I selected another candidate molecule glucocortioid receptor (GR) that was predicted to involve in keratinocyte differentiation and to play a important role in this conditions. Glucocorticoids (GC) are a class of characterised by an ability to bind with the glucocorticoid receptor and mediate profound and diverse physiological effects in vertebrate development, metabolism, neurobiology and programmed cell death. Although glucocorticoid (GC) analogs are widely prescribed as the treatment of choice in many cutaneous disorders, the role of GCs in skin development has not been completely deciphered. Since GC effects are mediated through the glucocorticoid receptor (GR), studying the impact of the gain- and loss of- function of GR in skin development and function through genetically modified mice constitutes a relevant issue from the basic and clinical perspective. GR acts through the so-called genomic and non-genomic actions exerting pleiotropic roles in many tissues including skin. GR belongs to the superfamily of steroid nuclear receptors and is a ligand-dependent transcription factor. In the absence of ligand, GR resides in the cytoplasm associated with chaperones such as Hsp90 in an inactive form. Upon ligand binding, GR dissociates from cytoplasmic complexes, dimerizes and translocates to the nucleus, where it can then regulate gene transcription by binding to positive and negative glucocorticoid response elements (GREs). In an attempt to delineate the mechanism responsible for the beneficial versus adverse effects of GR in epidermal keratinocytes, I investigate the molecular events of GR involved in keratinocyte differentiation. As a result, the endogenous GR expression was increased in suprabasal region of epidermis of human tissue, also in differentiating keratinocyte by calcium. The involucrin, the early differentiation marker of keratinocyte, was increased by GR overexpression in immortalized human keratinocyte HaCaT. In addition, GR overexpression was sufficient to cause MAPK activation in a ligand-independent manner. 포유동물에서, 표피층은 탈수현상과 체온조절 및 특히 주변 환경으로 인한 위험으로부터 개체를 보호하는 장벽으로서의 역할을 하는 층상구조의 상피세포층이다. 표피층이 이러한 역할을 정상적으로 수행하기 위해서는 표피층을 이루는 세포의 증식과 분화 그리고 세포사멸간에 정확한 밸런스가 절대적으로 필요하다. 세포분화의 과정은 기저 각질형성세포가 증식을 멈추고 기저막에서 떨어져 나와 유극층, 과립층, 마지막으로 각질층이라고 불리는 최외각층 쪽으로 이동하는 것을 일컫는다. 인간의 피부 발생 과정에서, 기저세포가 안에서 바깥쪽 방향으로 이동하면서 기저 각질형성세포의 keratin K5 같은 유전자 발현은 억제되고 keratins K1, K10같은 분화 특이적 마커들의 발현은 올라가는 식으로 전체적인 유전자의 발현이 스위칭된다. 피부 각질형성세포의 최종 분화 과정은 다양한 유전자의 순자척 발현이 정교하게 조절되면서 다양한 단계의 과정이 수직방향으로 전개된다. 본인은 이전에 유전자 발현 profile을 조사하였고 temporally-regulated manner로 발현되면서 분화를 조절하는 것과 관련된 다양한 유전자를 찾아내었다. 이번 연구에서 본인은 이전 연구에서 얻어진 데이터를 바탕으로 in silico 분석법을 이용하여 hub-molecule들과 함께 각질형성세포 분화 과정에서 그것들의 intracellular signaling networks를 찾아내고자 시도하였다. 본인은 PSIMAP이라 불리는 protein-protein interaction prediction software를 사용하여 가상의 신호 전달 네트워크를 그릴 수 있었다. 여기서 hub-molecule 후보유전자들 중, SHC1이 EGFR 과 MAPK signal을 연결할 것이라 예측하고 protein-protein interaction을 실험적으로 증명해보았다. 예측한대로SHC1이 MEK1에 EGF-regulated manner로 결합함을 알 수 있었고, 나아가 SHC1이 keratinocyte-differentiation dependent manner로 MEK1 과 p38 MAPK에 결합하는 것 또한 알 수 있었다. 이러한 결과를 얻음으로써 in silico protein-protein interaction prediction system이 효율적으로 그리고 비용 절감에 효과적으로 실험적 후보자를 선택하는 데에 사용될 수 있음이 밝혀졌다. 또한 본인은 각질형성세포의 분화에 관여하여 중요한 역할을 할 것이라 예상되는 glucocorticoid receptor (GR)를 또 다른 후보 유전자로 선택하였다. Glucocorticoids (GC)는 glucocorticoid receptor에 결합하여 척추동물의 발생과 대사과정, 뇌생물학, 세포사멸 같은 주요하고 다양한 생리활성을 매개하는 것으로 잘 보고가 되어 있다. 비록 glucocorticoid (GC) analogs 가 많은 피부 질환에 처리하는 약물로 보편화되어 있기는 하나 피부 발생에서GC의 역할은 아직 완전하게 규명되어 있지 않은 실정이다. GC의 효과는 glucocorticoid receptor(GR)를 통하여 나타나기 때문에 피부 발생 단계에서GR의 gain/loss- of-function이 미치는 영향과 함께, 유전적으로 변형시킨 생쥐를 통하여 기능을 연구하는 것은 기초와 임상관점에서 상응하는 이슈를 제공해줄 수 있다. GR은 피부를 포함하여 다양한 조직에서 다면발현적으로 역할을 하면서 genomic/non-genomic action으로 작용한다. GR은 steroid nuclear receptor 의 superfamily에 속하며 ligand-dependent transcription factor 이다. Ligand가 없을 때, GR은 Hsp90같은 chaperones과 결합하여 불활성화 상태로 세포질에 존재하지만, ligand와 결합하게 되면 GR은 세포질 내 복합체에서 해리되어 dimer를 이루면서 핵으로 translocation되고 그 곳에서 positive/negative glucocorticoid response elements (GREs)에 결합함으로써 유전자의 전사를 조절할 수 있게 된다. Epidermal keratinocyte에서 GR의 유익한 효과와 역효과를 설명하기 위한 mechanism을 알아보기 위하여 본인은 각질형성세포의 분화에 관련된 GR의 molecular events를 조사하여 보았다. 본인의 데이터상으로, 인간조직 표피의 suprabasal region이나 칼슘으로 분화를 유도한 각질형성세포 모두에서 GR의 endogenous단백질의 발현이 증가됨이 관찰되었고, immortalized human keratinocyte HaCaT 에서 각질형성세포의 초기 분화마커인involucrin 역시 GR의 과발현에 의해 발현이 증가함을 보였다. 게다가 GR의 과발현이 ligand independent manner로 MAPK activation을 야기시키는 충분한 증거가 됨을 증명하였다.

Effect of Sphingosine kinase activators on the differentiation of keratinocytes : Keratinocyte에서 sphingosine kinase activator의 분화효과

권유빈 Graduate School of Medicine Chungnam National Univ 2006 국내석사

Sphingosine -1- phosphate (S1P) 같은 sphingolipid metabolite는 생물체에 작용하는 molecule로써 세포의 성장과 분화, 생존을 조절한다. 이러한 S1P는 Sphingosine에서 Sphingosine kinase에 의해 활성화 되고 세포내의 Ca2+ 한다. 우리는 keratinocyte의 differentiation을 조절할 수 있는 Sphingosine kinase activator를 찾기 위해서 7가지 novel한 compound를 합성하고 keratinocyte differentiation 효과가 있는지 테스트했다. 또한, Sphingolipid의 일종인 Sphingosylphosphorylcholine (SPC)도 세포내 Ca2+을 증가시킨다는 보고에 따라 keratinocyte에서는 어떤 효과가 있는지 같이 테스트 했다. 먼저 SK activator의 효과를 알아보기 위해서 HaCaT keratinocyte에 몇가지 SK activator 후보 물질을 처리한 다음 total RNA를 추출하고 involucrin, keratin1같은 몇가지 keratinocyte differentiation marker로 gene발현양상을 보았다. 또한, 효과적인 스크리닝 방법으로 세포내 Ca2+intensity를 측정해서 직접적인 효과를 관찰하고 MTT assay를 통해 농도별 세포독성 양상을 알아보았다. 그 결과 3가지 compound(K6PC-4, K6PC-5, and K6PC-9)에서 농도와 시간에 따라 HaCaT keratinocyte의 differentiation을 유도하는 것으로 나타났다. 한편, 우리는 Boyden's chamber assay를 통해서 선택한 compound를 처리했을 때 migration에 영향을 미치는지도 알아보았다. 그러나 K6PC-4, K6PC-5, K6PC-9는 S1P와 SPC에 비해서 keratinocyte의 migration에는 아무런 효과가 없었다. 또한, 우리는 선택한 SK activator가 농도별로 in vivo상에서 얼마만큼의 differentiation효과가 있는지 알아보기 위해서 3차원 skin equivalent를 만들어 테스트했다. 다음으로 K6PC-4, K6PC-5, K6PC-9의 signal pathway를 알아보기 위해서 p42/44, p38, pJNK의 발현양상을 알아보았다. 이상으로 Novel한 Sphingosine kinase activator인 K6PC-4, K6PC-5, K6PC-9는 keratinocyte의 differentiation에 효과가 있는 것으로 결론을 내릴 수 있었고 이러한 기능을 atopic dermatitis에 적용할 수 있을 것으로 보여진다.

Development of personalized keratinocytes and advanced long-term culture system

ZHENG JIE 고려대학교 대학원 2020 국내박사

인간 케라티노사이트 줄기세포(KSC)란 피부조직 내 기저막에 위치하는 케라티노사이트(keratinocyte)로 분화할 수있는 세포를 말하며, 다른 이름으로는 미분화된 케라티노사이트(undifferentiated keratinocyte) 또는 상피줄기세포(epithelial stem cell) 라고도 표현한다. 핵심적인 기능은 피부 항상성을 유지하고, 피부가 외상을 받았을때 창상치유 과정을 통해 상처부위에 재상피화에 중심적인 역할을 담당한다고 알려져있다. 화상, 중증 외상과 만성궤양같은 자발적 피부재생이 어려운 심각한 피부손상에 대한 기본적인 치료방안은 자가 이식(autografting)으로 여겨지고 있지만, 큰 면적의 피부손상인 경우, 전체 상처부위를 이식하는데 있어 자가 조직 확보가 가장 결정적 한계로 여겨진다. 또한, 동종 이식(allografting)과 이종 이식(xenografting)같은 방법은 상대적으로 보다 많은 양의 조직을 취득할 수 있지만, 면역거부반응(immune rejection response)과 동물유래 병원균감염(pathogen transmission)등 내재되어 있는 잠재적 위험성 때문에 궁극적인 치료라기 보다 진화된 일시적 상처도포제로써로만 기능하는 것으로 보고되어있다. 따라서, 이를 해결하기 위한 방안으로 체외에서 환자의 미분화되 케라티노사이트 분리 및 배양후 인공조직을 재건하여 자가 이식이 한가지 대안으로 여겨진다. 그러나, 전신 화상등 환자의 정상피부조직을 취득할 수 없는 경우 또는, 대량 배양 단계에서 면역거부반응과 동물유래 병원균감염등 잠재 위험성있는 마우스에서 유래한 피더세포(feeder cell)나 소태아혈청(fetal bovine serum)등 사용하는 문제가 있다. 최근연구에서 피더세포 및 혈청 필요성에 대한 문제를 해결하기 위해, 저칼슘 농도인 무혈청 케라티노사이트 기본 배양액에 PAK1-ROCK-MyosinII과 TGF-β signaling pathway들의 억제제를 추가하여 미분화된 케라티노사이트 대량 배양 방법으로 확립 하였다. 그러나, 이 배양액에 동물유래 성분인 소 뇌하수체 추출물 (bovine pituitary extract, BPE)을 사용하기 때문에 여전히 잠재적 위험성을 배제할수 없다. 또한, 다른 접근으로는 인간 유래 피더세포나 혈청을 이용하여 임상 적용 등급의 케라티노사이트 및 인공피부을 확립하는 방법이 있는데, 인간 유래 피더세포 및 혈청의 안전성, 가변성 또는 높은 생산비용등의 의해 대규모 임상 적용에 한계가 있다. 따라서, 본 논문의 제2장에서는 새로운 자가 케라티노사이트 세포원을 개발하기위해, 직접적 역분화기술(direct reprogramming) 이용하여 비침습적 방법으로 간편하게 취득할 수 있는 소변세포(urine cell)에 BMI1 과 △NP63α 두가지 전사 인자(transcription factors) 도입을 통해 피더세포 제외 및 무혈청 유도 조건으로 개인별 맞춤 미분화된 케라티노사이트(iKCs) 배양 조건을 확립하였다. 유도된된 iKCs는 케라티노사이트 줄기세포와 비슷한 세포형태 또는 세포 특이 유전자 발현, 분화능력을 보여주었다. 다른 측면으로는, 유도된 iKCs는 체외에서 대량배양 또는 인공피부 재건 능력을 나타냈다. 본 논문의 제3장에서는 케라티노사이트의 체외 배양시 동물유래 성분 사용에 의한 잠재적 위험성을 줄일 수 있는 방안으로, PAK1-ROCK-MyosinII과 TGF-β signaling pathways 억제제 함유 및 저칼슘 농도의 무혈청 케라티노사이트 기본 배양액에 BPE를 인간 양수에서 유래한 중간엽 줄기세포의 분비물(amniotic fluid-mesenchymal stem cell secretome extract, aMS extract)로 대체함으로써 동물유래 성분을 사용하지 않은 케라티노사이트 배양방법을 확립하였다. aMS extract를 활용한 방법으로 배양한 케라티노사이트는 생물학 특성상 케라티노사이트 줄기세포과 비슷하였고 대량배양 가능성과 인공피부 재건능을 보여주었으며, BPE보다 aMS extrat를 활용하여 배양한 케라티노사이트가 더 두꺼운 피부층 재건을 보여주었다. 유전자 변이를 배제한 세포 역분화 기술의 예로써, 본 논문의 제4장에서는 4가지 저분자성 화학물질 (A-83-01, Thiazovivin, Purmorphamine, Valproic acid )를 이용하여 직접적 역분화방식으로 마우스 체세포로부터 유도 신경줄기세포(ciNSCs)를 확립하였다. 확립한 ciNSCs는 실제 신경줄기세포과 비슷한 세포형태, 유전자 발현특성, 분화능력 또는 기능성을 나타냄으로써 성공적인 역분화 유도된 신경줄기세포 를 보여주었다. 본 연구를 통해, 직접적 역분화기술에 기반하여 확립한 개인 맞춤형 케라티노사이트 또한, 양수 유래 중간엽 줄기세포의 분비물을 활용하여 대량 생산된 케라티노사이트는 향후, 피부 관련 연구 또는 임상응용에 있어 새로운 세포원이 될수있는 가능성을 제시하였다. Major skin injuries and diseases, such as burns, trauma or chronic ulcers, are treated by substitute grafting following debridement and require a large amount of skin for reconstruction of the damaged portion in severe cases. Although allogeneic and xenogeneic sources could be facilitated due to good availability and abundance for skin grafting, the recipients’ immune rejection is an issue that should be addressed for their clinical use. Human skin keratinocyte stem/progenitor cells located in the basement membrane of epidermis basal layer, also termed as basal keratinocytes or skin epithelial stem/progenitor cells, are identified as undifferentiated and self-renewal population and play a crucial role for maintaining skin homeostasis and repairing damaged tissue after injuries during entire lifetime. These undifferentiated keratinocytes hold a great promise as an ideal source for pathological researches, drug screening and therapeutic applications; thus, efforts in exploring a suitable method for long-term expansion of functional keratinocytes in vitro is an indispensable prerequisite. A commonly used method for long-term culture of keratinocytes is to co-culture them with irradiated mouse 3T3J2 feeder cells under a serum-containing culture medium. More recently, it has been demonstrated that keratinocytes can be expanded in vitro for a longer period of time under a feeder- and serum-free condition by inhibiting PAK1-ROCK-Myosin II and TGF-β signaling pathways at low calcium concentration and further as supplemented by bovine pituitary extract (BPE). However, such undefined and animal derived BPE limits their clinical use. On the other hand, the use of human serum and/or human-derived feeder cells has been proposed for clinical grade keratinocytes or skin equivalents; nevertheless, there are still several challenges before their large-scale clinical applications such as stability and safety of cell sources, homogeneity, variability, and cost-efficient processing. Taken together, an alternative strategy for large-scale production of functional keratinocytes under a feeder-, serum- and animal-free condition are urgently needed. In chapter I, this study developed a direct reprogramming method to generate feeder- and serum-free expandable and functional induced keratinocyte-like cells (iKCs) from human urine cells. I wondered whether expandable keratinocytes are directly reprogrammed from human urine cells. a) two keratinocyte-specific transcription factors, △NP63α and KLF4, can contribute to reprogramming of human neonatal dermal fibroblasts and human colon carcinoma cells into keratinocyte-like phenotype. b) KLF4 allows basal keratinocytes to differentiate into their terminal state. c) BMI1 promotes self-renewal and growth of keratinocytes, and d) ectopically expressed △NP63α causes epithelial-mesenchymal transition. When △NP63α and BMI1(BN) were co-transduced into human urine cells under serum or serum-free conditions, keratinocyte stem cell-like holoclones were successfully formed and exhibited the molecular characteristics and differentiation potential, resembling neonatal epidermal keratinocytes. Moreover, these BN-iKCs functionally self-assembled to reconstitute stratified skin in vitro. Consequently, these results show that a novel approach for generation of expandable and functional iKCs by direct reprogramming technology and thus the generated iKCs would serve as a promising cell source for efficient and personalized applications. In chapter II, this study established an animal-free keratinocyte growth medium, enabling to replace BPE from EPIX medium with supplement amniotic fluid-mesenchymal stem cell (aMSC) secretome extract (referred to as aMSM) for long-term expansion of functional keratinocytes in vitro. I wondered whether aMSC secretome extract (referred to as aMS extract) can contribute to long-term expansion of functional keratinocytes based on previous studies. a) aMS improved proliferation and migration of fibroblasts in vitro and its therapeutic potential in in vivo wound healing models. b) aMS promoted proliferation and migration of immortalized human keratinocytes (HaCaT cells) in vitro, c) the keratinocyte-serum free medium, supplemented with BPE at low calcium concentration, with PAK1-ROCK-Myosin II and TGF-β signaling pathway inhibitors, allowed epithelial keratinocytes to be expanded for a long-term period of time. Primary keratinocytes were successfully expanded under animal-free aMSM for long-term culture, while maintaining their biological characteristics, and further actively participated in the skin reconstitution in vitro. Moreover, aMSM resulted in enhanced self-renewal and differentiation potential during long-term expansion and formed a more thicker skin equivalent in comparison to EPIX with BPE that. Overall, these findings suggest that aMS can play a role in fostering a similar environment to the dermal niche of keratinocytes. Therefore, the present method for xeno-free production of keratinocytes not only offers their broad applicability in a cost-effective and safe manner, but also serves as a cell source to explore the cellular and molecular cues governing skin repair and regeneration. In chapter III, this study identified a combination of chemicals that can directly convert mouse embryonic fibroblasts (MEFs) into induced neural stem cells (iNSCs). I wondered whether sets of chemicals are sufficient for reprogramming of MEF into iNSCs based on previous reports. a) activation of sonic hedgehog (Shh) signaling contributed to the established of uncompleted NSC-like cells through a reprogramming process. b) Fibroblasts were directly reprogrammed into NSCs (iNSCs) by a defined set of chemicals leading to induction of expression of endogenous Sox2, including VPA (histone deacetylase (HDAC) inhibitor), E-616452 (TGFβ inhibitor), CHIR99021 (Wnt agonist), SB431542 (TGFβ inhibitor), A-83-01 (TGFβ inhibitor) Purmorphamine (Shh agonist), Parnate (LSD1 inhibitor) and Thiazovivin (ROCK inhibitor), c) ESC culture medium with combination of VPA, CHIR99021, and RepSox could allow somatic cells to be reprogrammed into neural progenitor cells under physiological hypoxic conditions. In addition, a combination of four chemicals (A-83-01, Thiazovivin, Purmorphamine, and VPA) showed successful direct-reprogramming of MEFs into iNSCs and these chemically-induced NSCs (ciNSCs) were similar to wild-type NSCs in terms of their morphology, molecular features, differentiation potential and functionality. The present study proposes a novel method for generation of directly reprogrammed ciNSCs from somatic cells without any genetic manipulation that can be broadly applied for research and application of neurological disorders.

Keratinocyte와 Melanocyte를 이용한 길경추출물의 미백, 주름억제, 피부보습 및 항산화 효과

반효정 경희대학교 대학원 2019 국내박사

Objective: In this study, the activity of Platycodi radix extract on Anti-oxidant, anti-wrinkle, moisturizing and whitening effect was investigated in keratinocyte and melanocyte. Methods: Cell viability was determined by MTS assay in keratinocyte and melanocyte. Anti-oxidant activity was determined by DPPH free radical assay. MMP-1, MMP-9, Filaggrin and Aquaporin3 measured the levels of mRNA by RT-PCR in keratinocyte. Tyrosinase and TRP-2 protein level were evaluated by western blotting analysis in melanocyte. Results: DPPH free radical scavenging activity were investigated by high-dose of Platycodi radix extract showed the inhibition activity. Platycodi radix extract induced up-regulation of Filaggrin and Aquaporin3 mRNA expression via keratinocyte. Co-treatment with LPS and high-dose of Platycodi radix extract led to down-regulation of MMP-1 and MMP-9 protein level. Western blot was performed to confirm whitening-related protein (Tyrosinase and TRP-2) level from Platycodi radix extract in melanocyte, and it was investigated that the inhibition activity was superior to that of the α-MSH used for the comparison test. Platycodi radix extract markedly showed the anti-oxidant, anti-wrinkle, moisturizing and whitening activity in keratinocyte and melanocyte. Conclusion: Through the results of the experiments, the applicability as a nature cosmetic material of Platycodi radix extract was verified.

B16F10 및 HaCaT 피부세포에서 건지황 추출물의 피부보습 및 미백 효과

오소미 경희대학교 대학원 2019 국내박사

Objective: This study is aimed to investigate skin moisturizing and whitening effect of Rehmannia glutinosa extract. Methods: Cell viability was determined by WST-1 assay in keratinocyte and melanocyte. Anti-oxidant activity was determined by DPPH free radical assay. HAS1, Filaggrin and Aquaporin3 measured the levels of mRNA by RT-PCR in keratinocyte. MITF and TRP-2 protein level were evaluated by western blotting analysis in melanocyte. Results: DPPH free radical scavenging activity were investigated by Rehmannia glutinosa extract showed the 30% of inhibition activity. Rehmannia glutinosa extract induced up-regulation of HAS1, Filaggrin and Aquaporin3 mRNA expression via keratinocyte. Immunoblotting was performed to confirm whitening-related protein (MITF and TRP-2) level from Rehmannia glutinosa extract in melanocyte, and it was investigated that the inhibition activity was superior to that of the α-MSH used for the comparison test. Rehmannia glutinosa extract markedly showed the anti-oxidant, moisturizing and whitening activity in keratinocyte and melanocyte. Conclusion: Through the results of the experiments, the applicability as a nature cosmetic material of Rehmannia glutinosa extract was verified.

정상, 불멸화 사람 구강 각화세포 및 악성 구강 각화세포에서 SPRRⅠ의 다양한 발현 : Various SPRRⅠExpression of Normal and Immortalized Human Oral Keratinocyte and Malignant Oral Keratinocyte

林秉采 단국대학교 대학원 2005 국내박사

Cultured normal human oral keratinocyte(NHOK) & immortalized human oral keratinocyte(IHOK) provide a valuable model in cellular proliferation and differentiation after proper stimulation. And it is interesting to study these established cell lines escaping normal control on their growth and differentiation. SPRR1 is induced during terminal differentiation of human epidermal keratinocytes but is rarely in anaplastic cells of keratinocyte origin. Then SPR1 expression has not yet been explained during differentiation of NHOK and transformed oral keratinocytes. The purpose of this stusy were to examine mRNA and protein expression of SPR1 in response to a known differentiation signal, calcium conc. in NHOK, IHOK and oral SCC cell line(HN 4), and to apply these results for investigating the molecular mechanisms of transformed celluar differentiation. Primary cultured NHOK, established IHOK and HN 4 cell line were cultured in KBM bullet kit. When the cells reached confluence, terminal differentiation was induced by switching the medium to KGM bullet kit containing 1.2mM Ca^(++). Preconfluency of NHOK as control group was used. Under 0.15mM Ca^(++) conc(Precon, Postcon), and 1.2mM Ca^(++) conc (Postcon), the insoluble final pellets were measured with 310nm of spectrophotometer for cornified cell envelope measurements, and RT-PCR for SPRR1 mRNA measurement, and immunoblotting for SPRR1 protein measurements in triplicate, respectively. The obtained results were as follows. 1. The terminal differentiation of cultured NHOK and IHOK was depend on calcium concentration, while HN4 cell line was not. 2. SPRR1 mRNA and protein expression of cultured NHOK showed the highest among cultured IHOK & HN 4 cell line in higher cacium condition. 3. SPRR1 mRNA and protein expression of cultured IHOK showed higher than that of HN 4 cell line in higher cacium condition. 4. SPRR1 was expressed in differentiation of NHOK and IHOK transfected by E6/E7 genes but rarely expressed in malignant oral keratinocytes. From the aboving results, it suggested that SPRR1 expression as keratinocyte terminal differentiation marker involved in cellular cornification would be differentially effected by immortalization and carcinogenic transformation. 배양된 정상 및 불멸화 사람 구강 각화세포는 적절한 자극후 세포의 증식 및 분화에 적절한 모델을 제공한다. 그리고 정상적인 성장과 분화의 경로를 통하지 않은 확립된 세포주들이 있는데 이 들을 연구하는 것은 흥미로운 일이다. 사람 각화세포의 최종분화시에는 SPRR1의 발현이 유도가 되지만 각화세포 기원의 악성 종양세포에서는 거의 발현되지 않는다. 그런데 정상 사람 및 변환된 구강 각화세포의 분화시에는 이러한 SPRR1 발현은 아직 설명이 되지 않고 있다. 본 연구의 목적은 잘 알려진 분화 인자로 칼슘을 사용하여 농도에 따라 정상 및 불멸화 사람 구강 각화세포 및 악성 구강 각화세포에서 mRNA 및 단백질 발현을 관찰하고 이 결과를 분자 생물학 방법을 사용하여 변환된 세포 분화의 기전연구에 응용하고자 하였다. 일차배양된 정상 사람 구강 각화세포, 불멸화 사람 구강 각화세포 및 악성 구강 각화세포는 KBM bullet kit에서 배양하였다. 세포 충만후 최종분화는 칼슘농도가 1.2mM 인 KBM bullet kit에서 배양하여 유도하였다. 충만 전 대조군으로 정상, 불멸화 사람 구강 각화세포는 대조군으로 사용되었다. 0.15mM 칼슘농도(충만 전후) 및 1.2mM 칼슘농도(충만후)에서 비 용해성인 최종 산물울 만들어 분광 광도계를 사용하여 파장은 310nm에서 각화세포막 양을 측정하였다. RT-PCR로 SPRR1 mRNA 발현을 측정하고 immunoblotting 으로 SPRR1 단백질 발현을 각각 세 번 측정하였다. 결과는 다음과 같았다. 1. 배양된 정상 사람 구강 각화세포 및 불멸화 사람 구강 각화세포의 최종분화는 칼슘농도에 의존성이 있으나 HN 4 종양세포주는 무관하였다. 2. 정상 사람 구강 각화세포의 SPRR1의 mRNA와 단백질 발현은 다른 세포주에 비하여 고농도 칼슘에서 가장 높게 발현되었다. 3. 불멸화 사람 구강 각화세포의 SPRR1의 mRNA와 단백질 발현은 HN 4 종양 세포주에 비하여 고농도 칼슘에서 더 높게 발현되었다. 4. SPRR1 발현은 정상 사람 구강 각화세포 및 E6/E7 유전자로 변형감염된 불멸화 사람 구강 각화세포의 분화시 발현되었으나 종양세포주에서는 거의 발현되지 않았다. 위와같은 결과에서 세포의 각화세포막 형성에 관여하는 각화세포 최종 분화 표지자로서 SPRR1 발현은 구강 각화세포가 불멸화되거나 구강 종양세포로 변형될때 다양하게 영향을 받는다고 생각되었다.

Identification of hyperkeratinization signaling in keratinocytes of X-linked ichthyosis caused by steroid sulfatase deficiency

권태욱 중앙대학교 대학원 2025 국내박사

Identification of Hyperkeratinization Signaling in Keratinocytes of X-Linked Ichthyosis Caused by Steroid Sulfatase Deficiency Tae-Uk Kwon Major in Bio-Pharmaceutical Science Department of Pharmacy The Graduate School of Chung-Ang University Steroid sulfatase (STS) catalyzes the desulfation of steroid sulfates, activating them biologically. STS deficiency leads to X-linked ichthyosis (XLI), a genetic disorder characterized by scaly, hyperkeratinized skin, resulting from a skin barrier dysfunction caused by cholesterol sulfate accumulation. This study investigates the mechanisms underlying hyperkeratinization due to STS deficiency and explores potential therapeutic targets for XLI. In Part I, STS deficiency in keratinocytes (HaCaT cells) impaired cell motility and increased cell death, contributing to excessive stratum corneum accumulation. RNA sequencing of STS-overexpressing and -deficient mouse skin revealed critical regulation of pathways, including Wnt/β-catenin and Hippo, which influence cell motility and apoptosis. STS-deficient cells exhibited increased E-cadherin and suppressed EMT markers such as N- cadherin and vimentin, regulated by Hippo pathway activation and decreased HIF-1α. Additionally, mitochondrial respiration and ROS production were elevated, activating apoptotic markers including Bax, Bak, and cytochrome c release. In Part II, STS deficiency enhanced keratinocyte differentiation. Gene ontology analysis showed upregulation of calcium signaling genes, with increased calcium influx driven by elevated calcium-sensing receptor (CasR) expression. G0/G1 arrest in STS-deficient cells promoted differentiation, increasing the expression of keratinocyte early and terminal differentiation markers such as keratin 1, keratin 10, involucrin, and loricrin. These cells also exhibited heightened sensitivity to calcium treatment, emphasizing the role of calcium signaling in keratinization. In Part III, therapeutic strategies for XLI were explored using STS deficiency mice and keratinocytes. STS deficiency increased E-cadherin and keratinization marker expression while reducing E-cadherin ubiquitin E3 ligase Hakai-mediated degradation, further stabilizing E-cadherin. Cholesterol sulfate accumulation accelerated keratinization, while miR-6766 treatment and genetic modifications of the E-cadherin N-terminal domain downregulated keratinization markers, highlighting potential therapeutic interventions. In conclusion, STS deficiency disrupts cell motility, promotes cell death, and drives keratinocyte differentiation through calcium signaling and E- cadherin stabilization. These findings provide valuable insights into XLI pathogenesis and suggest promising therapeutic approaches for XLI and related disorders. 스테로이드 설파타제 (STS)는 스테로이드 황산염의 탈황화를 촉매하여 생물학적으로 활성화한다. STS 결핍은 X-연관 어린선(XLI)을 유발하며, 이는 콜레스테롤 황산염의 축적으로 인한 피부 장벽 기능 장애로 인해 비늘모양의 과각질화 피부가 특징적인 유전 질환이다. 본 연구는 STS 결핍으로 인한 과각질화의 기전을 규명하고 XLI의 잠재적 치료 표적을 탐구하였다. 1부에서는, 케라티노사이트 (HaCaT 세포)에서 STS 결핍이 세포 이동성을 저하시켰으며 세포 사멸을 증가시켜 과도한 각질층 축적을 초래하였다. STS 과발현 및 결핍 마우스 피부의 RNA sequencing 결과, Wnt/β-catenin 및 Hippo 경로를 포함한 세포 이동성과 세포 사멸을 조절하는 주요 신호 경로가 규명되었다. STS 결핍세포는 E-cadherin의 발현이 증가하고, N-cadherin 및 vimentin과 같은 EMT 마커가 억제되었다. 이는 Hippo 경로의 활성화와 HIF-1α 감소에 의해 조절되었다. 또한, STS 결핍 세포는 미토콘드리아 호흡과 ROS 생성이 증가하였으며, cytochrome c의 방출과 Bax, Bak와 같은 세포 사멸 마커를 활성화하였다. 2부에서는, STS 결핍이 케라티노사이트의 분화를 촉진하였다. gene ontology 분석 결과, 칼슘 신호 전달 관련 유전자가 상향 조절되었으며, 이는 칼슘 감지 수용체 (CasR) 발현 증가에 의해 유도된 세포 내 칼슘 유입 증가와 관련이 있었다. STS 결핍 세포는 G0/G1 세포 주기 정지를 나타내어 분화를 촉진하였으며, keratin 1, keratin 10, involucrin, loricrin과 같은 케라티노사이트 초기 및 후기 분화 마커의 발현이 증가하였다. 이러한 세포는 칼슘 처리에 대한 민감도가 증가하여 각질화에서 칼슘 신호의 역할을 강조하였다. 3부에서는, XLI 치료 전략을 위해 STS 결핍 마우스와 케라티 노사이트를 사용하여 탐구되었다. STS 결핍은 E-cadherin과 각질화 마커 발현을 증가시키는 동시에, E-cadherin ubiquitin E3 ligase Hakai에 의한 분해를 감소시켜 E-cadherin을 안정화시켰다. 콜레스테롤 황산염 축적은 각질화를 가속화하였으며, miR-6766 처리와 E-cadherin N234 말단 도메인의 유전적 변형은 각질화 마커를 감소시켜 잠재적 치료 개입의 가능성을 제시하였다. 결론적으로, STS 결핍은 세포 이동성을 방해하고 세포 사멸을 촉진하며, 칼슘 신호 전달 강화와 E-cadherin 안정화를 통해 케라티노사이트 분화를 유도하였다. 이러한 발견은 XLI 병태생리를 규명하는 데 기여하며, XLI 및 관련 피부 질환에 대한 유망한 치료 전략을 제시하였다.

(The) effects of bullous pemphigoid autoantibodies on apoptosis of keratinocyte and expression of BP180

김태형 Graduate School, Yonsei University 2015 국내석사

아토피 피부염 환자에서 프로테오믹스 기법을 이용한 혈청 자가항체와 반응하는 각질형성세포 단백의 발굴

오상호 연세대학교 대학원 2003 국내석사

현재까지 아토피 피부염의 병인은 유전적 배경과 면역학적 기전, 환경적 요인 등으로 설명되고 있다. 최근 아토피 피부염의 병인으로 자가항원에 대한 자가면역이 대두되었고 이에 따라 IgE에 반응하는 여러 가지 자가항원이 밝혀졌다. 이러한 자가 항원에 대한 IgE 매개성 과민반응은 아토피 피부염을 유발 또는 만성적으로 증상을 악화시키는데 중요한 역할을 하는 것으로 생각되고 있다. 본 연구에서는 프로테오믹스 기법을 통해 아토피 피부염 환자 혈청내 자가항체와 반응하는 표피내 아토피 피부염 특이 표지단백을 찾아내어 이의 특성 및 관련성을 규명하고자 하였다. 임상적으로 Hanifin 및 Rajka의 기준에 의해 아토피 피부염으로 진단된 환자 48명과 정상 대조군 5명의 혈청을 이용해 각질형성세포에 대한 IgE, IgG 자가항체의 존재를 확인하기위해 ELISA를 시행한 결과, 아토피 피부염 환자군에서 각질형성세포 단백에 대한 IgE 자가항체의 수치가 약간 높은 양상을 보였다. ELISA검사에서 높은 수치를 보인 환자의 혈청으로 각질형성세포 단백에 대한 면역블롯을 시행한 결과, IgE 자가항체 검출에서 정상 대조군에서 나타나지 않던 45-65 kd의 단백 스팟이 나타났고 IgG 자가항체 검출에서는 정상 대조군과 환자군 모두에서 다양한 분자량의 단백 스팟이 나타났다. IgE 자가항체에 반응을 보인 45-65 kd의 각질형성세포 단백 스팟을 규명하기위해 배양된 각질형성세포 단백을 이용해 2차원 면역블롯을 시행하였다. 2차원 면역블롯에서 반응을 보인 단백 스팟의 위치를 확인하고 이에 해당되는 각질형성세포의 2차원 전기영동 gel 부분을 분리하여 질량분석기로 단백을 찾아내었다. 아토피 피부염 환자의 혈청 IgE와 반응을 보인 각질형성세포 항원은 56 kd, 등전점 5.3의 ATP synthase beta chain과 60 kd, 등전점 5.7의 heat shock protein 60으로 나타났다. 본 연구를 통해 아토피 피부염 환자의 혈청에서 각질형성세포 단백에 대한 자가항체가 존재함을 관찰하였고 그 항원을 동정하였다. 이러한 결과는 아토피 피부염의 병리기전을 이해하는데 기초자료로 도움을 줄 것으로 생각한다. Until now, the pathogenesis of atopic dermatitis has been explained by immunological mechanisms and environmental factors. Recently, autoimmunity theory has appeared as a pathogenesis of atopic dermatitis and so forth many autoantigens have been discovered. IgE mediated hypersensitivity to autoantigen is thought to be a important aggravating factor of symptoms of atopic dermatitis. In this paper, we would like to find out autoantigens in the epidermis that reacts with autoantibody in the sera of atopic dermatitis patients through proteomics and identify its characteristics and relationship. According to Hanifin or Rajka’s classification, we collected 48 atopic dermatitis patients’ and 5 normal patients’ sera and performed ELISA to verify the existence of IgE and IgG autoantibody against proteins of cultured keratinocytes. As a result, in the group of atopic dermatitis patient the titer of the IgE autoantibody was slightly higher. We sorted out serums which showed higher values in ELISA test and performed immunoblot against keratinocyte protein. Keratinocyte proteins of 45-65 kd that didn’t react with sera of normal control reacted with IgE autoantibody in the patient group. Variable molecular size proteins of keratinocyte reacted with IgG antibody in sera of both patients and normal group. To verify the 45-65 kd keratinocyte protein spot, we performed a 2-dimensional immunoblot using cultured keratinocyte protein. Through 2-dimensional immunoblot, we confirmed the site of the protein spot and found the protein by separating the site in the electrophoresis gel. Keratinocyte antigens which reacted with serum IgE autoantibody of atopic dermatitis patients were to be ATP synthase beta chain (56 kd, PI 5.3) and heat shock protein 60 (60 kd, PI 5.7). In this study, we observed the existence of autoantibodies to proteins of cultured keratinocytes in the sera of atopic dermatitis patients and identified autoantigens. These results will be used as fundamental data in understanding the pathogenesis of atopic dermatitis.

Quantitative analysis of ceramide metabolites in Ca2+ and vitamin C treated keratinocytes : Ca2+와 vitamin C로 분화된 표피 각질형성세포에서 Ceramide 대사체 함량 분석

윤혜정 경희대학교 동서의학대학원 2011 국내석사

Ceramides which are the major constituent of sphingolipids in epidermis known to play diverse roles in the outermost layers of skin such as water holding capacity and physical barrier property. Moreover they can be hydrolyzed into free sphingoid bases such as C18 Sphingosine(SO), C18 Sphinganine(SA) or further metabolized to C18 So-1-Phosphate(S1P), C18 Sa-1-Phosphate(SA1P) in keratinocytes. The significance of the ceramides metabolites has been emerged; altered levels of SO, SA in skin disorders and roles of S1P, SA1P as signaling lipids have been reported. However, the overall metabolism of sphingoid bases and their phosphates during keratinocytes differentiation has not been discussed in great details. Thus, in this study we analyzed these ceramide metabolites in the process of keratinocyte differentiation. 3 distinct keratinocyte differentiation stage were prepared with 0.07 mM Ca2+ (proliferation stage), 1.2 mM Ca2+ (early differentiation stage) in serum free culture medium, and serum containing medium with Vit C (50 ㎕/㎖) (late differentiation stage). And also serum containing medium was used to elucidate whether Vit C per se increases sphingoid bases and their phosphates. Sphingoid bases and their phosphates after alkaline phosphatase reaction were also determined by HPLC system. Compared to 0.07 mM Ca2+, levels of SO, SA, S1P and SA1P were not altered in 1.2mM Ca2+ treatment. However, in keratinocytes cultured under Vit C containing serum medium, levels of SO, SA, S1P and SA1P were dramatically higher than those in 0.07 and 1.2mM Ca2+ treated cells, but compared to serum containing medium, Vit C did not enhance their production significantly. Taken together, we demonstrate that the late differentiation process of keratinocytes induced by Vit C and serum was accompanied with dramatic increase of sphingoid bases and their phosphates, but Vit C per se had no effects on their production. 표피 내에는 칼슘의 기울기가 존재하여, 낮은 칼슘농도(0.07mM)에서는 각질형성세포는 증식하는 반면에 고 칼슘의 농도(1.2mM)는 세포의 분화를 유도하게 된다. 그리고 비타민 C(50㎍ per ㎖)와 10%의 Serum, 고 칼슘(1.2mM)의 농도가 유지가 되면 세포의 분화는 더 진행이 된다고 알려져 있다. 이러한 세포배양방법을 이용하여 세포 분화에 따른 세포 형태학적, 많은 생화학적 변화가 밝혀져 있지만, 세라마이드 대사체 연구는 아직 밝혀진 바가 없으며, 또한, 사전연구에서 비타민 C는 스핑고지질의 합성에 관련한 효소 및 지질함량을 증가시킨다고 보고되었지만 세라마이드 대사체에 관련한 변화를 아직 밝혀지지 않았다. 이에 본 연구에서는 칼슘과 비타민 C를 이용하여 각질형성세포의 분화를 유도한 후 세라마이드 대사체인 C18 Sphingosine(SO)과 C18 Sphinganine(SA), 그리고 그들의 인산화 형태인 Sphingo-sine 1 Phosphate(S1P)와 Sphinanine 1 Phosphate(SA1P)를 HPLC를 이용하여 함량분석을 통해 각질형성세포에 따른 이들의 변화를 관찰하였고, 비타민 C가 이들의 함량을 증가시키는지 알아보았다. SO, SA, S1P, 그리고 SA1P 모두 후기 분화가 진행되었을 때, 크게 증가하지만, 칼슘의 변화에 따른 변화는 동반되지 않았다. 그래서 이들 대사체들은 표피의 후기 분화에 필수적이라고 생각한다. 반면, 후기분화를 촉진한다고 보고되었던 비타민 C 자체는 SO, SA, S1P, 그리고 SA1P 생성에 아무런 영향은 주지 않았다.