인간과 쥐의 TGF-β1 유전자에 있어서 RNAi 반응에 따른 차이 연구

전경철 울산대학교 대학원 2011 국내석사

연구 목적: 인간과 마우스에 있어 TGF- ß1 이 RNAi 에 대해 어떠한 반응을 일으키며 인간과 마우스간의 동일성 및 차이 등의 연구를 통하여 면역학 적인 체계에 있어 RNAi 의 변화 및 향후 임상적 적용에 대해 알아보고자 하였다. 실험대상 및 실험방법: Homo sapiens transforming growth factor (TGF) ß1을 target하는 shRNA를 합성하고 인간과 마우스간의 sequence homology를 파악하였고 hTGF-beta #1, hTGF-beta #2, hTGF-beta #3 를 합성하여 인간과 마우스에 있어 TGF- ß1 에 대한 gene silencing 정도를 분석 하였으며 human cell line 인 HeLa 에서, 그리고 mouse cell line-B16F10, Hepa1c1c7 및 3T3L1 에서 gene silencing 정도를 실험하였다. 또한 종 간 RNAi 반응을 확실히 확인하기 위해 mouse specific silencing siRNA target 선정 후 검증 하기 위해 siRNA 로mTGF-beta #5,#7,#8,#9,#10,#11을, shRNA 로 mTGF-beta #10를 합성하여 마우스에 있어 TGF- ß1 에 대한 gene silencing 정도를 확인하였다. 결과: Hela cell line 에서 hTGF-beta #1,#2,#3 에 대한 gene silencing 정도는 양호하였다. 그러나, B16F10 cell line 에서 hTGF-beta1 #1, #2, #3에 모두 silencing 되지 않은 것으로 확인되었으며 Hepa1c1c7 cell line에서는 비록 높은 발현에도 불구하고 TGF-β1 shRNA의 gene silencing 효율은 없는 것으로 나타났고3T3L1 cell line에서도 동일하였다. Mouse specific silencing siRNA target 선정 후 검증한 실험에서도 마우스의 B16F10 Cell line 에서 mTGF-beta #7,#8,#9,#10,#11 에 대해서는 silencing 이 되지 않았고 Hepa1c1c7 cell line에서도 mTGF beta # 5 및 shRNA인 mTGF beta # 10 의 silencing효율은 없는 것으로 나타났다. 결론: 종 간 차이점에 기인하여 종 간 동일한 유전자라도 RNAi gene silencing 에 대해 다른 반응을 보일 수 있으며 다른 종으로부터 기원한 cell line 에 선택적인 siRNA/shRNA 가 서로 다른 종에 모두 영향을 미친다고 생각할 수 없다는 것이다. 따라서 본 연구는 높은 정도의 gene silencing 효과를 나타내는 siRNA 가 다른 종에 있어서도 같은 효과를 내지 못한다는 것을 보여 주는 최초의 중요한 실험이 된다. Objectives: The purpose of this study is to evaluate the different response to RNAi in the human and mouse TGF- β1 gene. We planned this study in order to determine the potential application of siRNA as an immunology research tool as well as its clinical application. Materials and Methods: We identified the human and mouse sequence homology and synthesized shRNA which targets the homo sapiens transforming growth factor (TGFβ1). They were hTGF-beta #1, hTGF-beta #2, and hTGF-beta #3. The gene silencing rate of TGF- β1 was evaluated in HeLa (Human cell line) and in B16F10, Hepa1c1c7, and 3T3L1(Mouse cell lines ). We also evaluated the gene silencing rate with mouse specific silencing siRNA. They were siRNA mTGF-beta #5,#7,#8,#9,#10,#11 and shRNA mTGF-beta #10. Based on these results, we evaluated the different response to RNAi in the human and mouse TGF- β1 gene. Results: In the HeLa cell line, gene silencing of hTGF-beta #1, hTGF-beta #2, and hTGF-beta #3 was effective. However, there was no gene silencing in the B16F10 cell line. Despite the high expression of TGF- β1 shRNA, there was also no gene silencing in the Hepa1c1c7 and 3T3L1 cell lines. After validating the mouse specific silencing siRNA target, mTGF-beta #7,#8,#9,#10,#11 did not suppress in B16F10 cell line and there was no effective gene silencing of mTGF-beta #5 and shRNA mTGF-beta #10 in the Hepa1c1c7 cell line. Conclusion: A homologous gene shows a different response to RNAi gene silencing depending on the organism difference. When a siRNA/shRNA is selected using cell lines originating from different organisms, it is not necessary for the siRNA to be effective in both cell lines. Therefore, this is the first demonstration that siRNA with high gene silencing efficacy for an organism is not necessary in order to show a similar result in a different organism.

생쥐 간세포에서 siRNA를 이용한 두가지 다른방법에 의한 EGFP유전자의 사일런스 패턴의 비교

최호준 건국대학교 대학원 2005 국내석사

한글초록:RNAi는 transcription 이후 특정 sequence에서 작용하는 유전자 silencing으로 유전자 기능을 조사하기 위해 사용할 수 있는 powerful genetic tool이다. 또한, 다른 gene targeting 방법보다 값싸고, 간편한 방법이다. 본 실험은 특정 유전자를 silencing 시킨 형질전환동물을 생산하기 위한 기본적인 방법을 확립하기 위해 수행되었다. 생쥐 간 세포에서 construct transfection과 virus infection의 두가지 다른 방법으로 생쥐 U6 promotor를 연결시킨 retroviral vector pQCXIN과 pLXIZ를 통하여 siRNA expression을 시킨 후, EGFP 유전자의 silencing 양상을 비교하였고, EGFP 유전자의 발현을 다양한 시간별로 조사하였다. 지속적이고 안정적으로 EGFP를 발현하는 세포주를 생산하기 위해 생쥐 간 세포에 pEGFP-C1 constuct를 도입하였다. 이들 EGFP 발현 세포들에 EGFP siRNA를 발현시키는 retrovirus와 plasmid vector를 도입하였고, EGFP의 발현 정도를 정확히 측정하기 위해 도입 후, 24 시간 동안 3 시간 별로 RT-PCR을 수행하였다. 도입 효율을 비교하면, virus가 plasmid 보다 효율이 더 좋았다. Virus를 infection 시킨 세포에서의 EGFP 발현 정도는 infection 후, 9 시간째부터 유의적으로 감소하였고, vector를 transfection 시킨 세포에서는 transfection 후, 12 시간째부터 유의적으로 감소하였다 (P<0.05). 그러나 두가지의 다른 retroviral vector인 pRNAi와 pLXIZU6에서는 유의적인 차이를 보이지 않았다. 본 실험은 vector와 virus간의 EGFP gene silencing 정도를 비교하기 위한, 그리고 gene silencing이 일어나기 시작하는 시간을 조사하기 위한 첫번째 실험이었다. 본 실험의 결과들은 유전자의 silencing 효과에서 retrovirus를 infection 하는 방법은 vector constuct를 transfection 하는 방법보다 더 효과적이고, 유용하다는 점을 제시하였다 영문초록:RNAi is a process of sequence-specific posttranscriptional gene silencing and is a powerful genetic tool to analyze gene function. In addition, this technique is more inexpensive and simple than other gene targeting methods. This experiment was performed to establish the fundamental protocol to produce the specific gene silenced clone animal. To compare with gene silencing pattern of EGFP in mouse liver cell by two different methods using siRNA, retroviral vectors, pQCXIN and pLXIZ, with mouse U6 promotor were utilized as a construct and a virus. And the level of EGFP expression was investigated at various time after transfectd with constructs and infected with viruses. To produce the cell line continuously expressing EGFP, mouse liver cells were transfected with the pEGFP-C1 construct. These EGFP expressing cells were transfected with the plasmid vector and in vitro packaged retrovirus expressing EGFP siRNA. To measure the level of EGFP expression, RT-PCR was performed in every 3 hours for 24 hours from the time of transfection. When the transfection efficiency was compared between the plasmid vector and the virus, the virus infected cells was higher efficiency of transfection than the plasmid transfected cells. The level of EGFP expression from the virus infected cells was significantly decreased in 9 hours after infection, the level of EGFP expression from the vector transfected cells was significantly decreased and in 12 hours after transfection (P<0.05). However, the levels of EGFP expression between the two different retroviral vectors pRNAi and pLXIZU6 were not significantly different. This study was first experiment to compare the level of EGFP gene silencing between vector and virus, and to detect the start time of gene silencing. Therefore, results from present study suggest that the infection with in vitro packaged retrovirus is more efficient and convenient than the transfection with the retroviral construct in gene silencing effect

Plant functional genomics using virus-induced gene silencing (VIGS) and molecular characterization of NbCHMP1 and NbBTF3 : VIGS(virus-induced gene silencing) 시스템을 이용한 식물의 기능성 유전자 대량발굴과 NbCHMP1, NbBTF3 유전자의 분자적 특성 분석

양경실 Graduate School of Chungnam National University 2003 국내박사

제1장 VIGS 현상은 재조합형 바이러스가 host 유전인자의 염기 서열을 인지하는 것에 의해 중재되는 상동 의존형 RNA 붕괴의 결과로써 내생의 유전자들의 기능 분석을 위해 일시적인 knockout에 도달하게 하는데 사용할 수 있다. 그래서 VIGS 기술은 주로 담배나 애기장대풀과 같은 한정된 host의 수에서 몇 개의 virus의 사용만으로 제한된다. 본 연구에서는 High throughput VIGS 기술을 이용하여 고추와 담배 EST를 유전자의 source로 기능유전체 연구를 수행하고자 한다. 담배의 종자, 뿌리, 줄기, 꽃에서 RNA를 분리하여 Lambda ZAPll cDNA library를 제조하였고 3000개의 cDNA를 임의로 염기 서열을 분석하였다. 3000개의 염기 서열 중에서 식물 조직 발달, 호르몬 작용, 신호 전달 등에 관련된 유전자 492개와 기능이 밝혀지지 않은 유전자 725개 등 총 1217개를 선발하였다. 선발된 1217개의 EST를 VIGS vector로 cloning하고 재조합된 VIGS plasmid를 Agrobacterium으로 형질 전환하였다. 각각의 유전자 당 6개의 Nicotiana benthamiana 식물체를 사용하여 Agrobacterium 침투 방법으로 VIGS를 수행하였다. VIGS의 positive 대조구로는 cellulose synthase와 Rubisco small subunit 유전자를 사용하였다. Virus 침투 후 2-3주 후 정상적인 온실 조건(24℃)에서 식물체의 형질 변화를 vector 대조구와 비교하여 조사하였다. 표현형은 세포 사멸, 잎의 황색화, 생장 억제, 비정상인 기관, 너무 빠른 노화, 꽃의 기형화, 정부우세성의 파괴 등으로 나누어 분석하였다. 1217개 유전자 중 136개 유전자에서 표현형 변화가 유도되었고 VIGS로 표현형의 변화가 크게 일어난 유전자들의 발현양상과 기능을 분자생물학적, 생화학적, 세포생물학적 기법을 이용하여 분석하였다. 유도되는 표현형과 해당 유전자의 염기 서열을 PHP, CGI, MySQL 프로그램을 이용하여 database로 구축하였다. 제2장 사람의 경우 CHMP1은 핵에서는 염색질 구조의 변형에 관해, endosome에서는 소포낭의 이동에 관여하는 역할을 하는 두 가지의 기능을 가지는 단백질이라고 알려졌다. 최근에 옥수수에서 CHMP1의 상동으로 밝혀진 sal1은 옥수수의 내배유에서 호분 세포층의 발달에 중요한 역할을 한다. 본 연구에서는 Nicotiana benthamiana에서 얻은 CHMP1의 상동인 NbCHMP1의 분자적 특성과 세포질의기능을 연구하였다. NbCHMP1는 아미노 말단에 2부로 나누어진 핵 조준 신호를 가지고 있는 단백질이고 다양한 식물 종으로부터의 대응 유전인자들과 높은 비율의 상동관계를 나타낸다. NbCHMP1의 전령RNA는 뿌리, 줄기, 잎과 꽃에서 유사한 비율로 발견된다. NbCHMP1의 아미노 말단 80개의 아미노산 펩티드와 GFP 단백질을 연합시킨 NbCHMP1(N)-GFP단백질이 핵으로 조준되는데 반해 NbCHMP1의 전체 길이와 GFP 단백질을 연합시킨 NbCHMP1(F)-GFP단백짙은 cytosol에 분포하므로 식물에서의 NbCHMP1 단백질은 이중 표적을 나타냄을 보였다. 효모에서 NbCHMP1의 과다발현은 생장에는 영향을 주지 않았고 flow cytometry에 기초한 기관들이 생육하게 하였고 발현 단백질은 독특한 반점형태로 cytosol로 조준되었다. NbCHMP1의 VIGS는 VIGS line에서 식물의 생육 가능성 흑은 발달에 중대한 영향을 주지 않고 잎의 형태와 색깔면에서 미묘한 변화의 결과를 보일 뿐이었다. 그러므로 CHMP1 동족체는 옥수수 endosome에서 호분 세포층의 결정에 가장 중요한 역할을 하는 것과는 대조적으로, dicotyledonous 식물의 생장하는 조직에서의 발달에는 중대한 역할을 하지 않는다. 제3장 BTF3는 일찍이 전사의 개시에 연루되어 있다고 여겨지는 자궁 경부 세포에서 정의된 단백질이다.전사에서의 BTF3의 륵정한 역할은 아직은 불분명하다. 본 연구에서는 Nicotiana benthamiana로부터 BTF3와 상동하는 유전자 cloning하여 얻었다. 이 유전자, 즉 NbBTF3는 아미노 말단에 핵으로 조준되는 신호 가지면 160개의 아미노산을 인지하며 다양한 식물 종으로부터의 대응 유전 인자들과 높은 비율의 상동관계를 나타낸다. NbBTF3의 전령RNA는 뿌리, 줄기와 꽃에서 유사한 비율로 발견된다. NbBTF3의 아미노 말단 80개의 아미노산 펩티드와 GFP 단백질을 연합시킨 단백질은 핵으로 조준되는 것을 볼 수 있었다. NbBTF3의 VIGS는 표현형면에서는 잎의 형태나 색깔에 변화를 가져왔다. 그러나 NbBTF3가 침묵된 조건에서 밝은 녹색부분의 잎에서 원형질체를 분리하여 엽록소를 관찰해 보았을 때 엽록체의 개수나 엽록소의 함량은 대조구인 TRV의 75-80%로 나타났다. 색소체의 RNA 합성효소인 PEP에 의해 전사되는 색소체의 광합성 관련 유전자들의 발현 양상은 NbBTF3가 침묵하였을 때 감소하는 결과를 보였다. 또 multi-subunit RNA 합성효소인 PEP의 발현 수준도 감소하였다. 엽록체의 유전자 뿐 아니라 미토콘드리아의 유전자들의 발현양상도 NbBTF3의 침묵조건에서 발현수준이 감소하는 결과를 보였다. 이 사실은 general transcription factor인 NbBTF3가 NEP유전자의 발현을 조절하므로서 협록체 내의 유전자의 전사에 관여한다는 것을 시사하고 있다. Chapter 1 The VIGS phenomenon can be used in transient knockout approaches for functional analyses of endogenous genes, as a consequence of homology-dependent RNA degradation mediated by a recombinant virus harboring a host gene sequence (Baulcombe, 1999). So far, VIGS technology has been restricted to the use ofa fsw viruses in a limited number of hosts, mainly Nicotiana benthamiana and Arabidopsis thaliana (Voinnet, 2001). In this study, we carried out functional genomics with high throughput VIGS using selected cDNAs of Nicotiana benthamiana. Among 3,000 sequenced ESTs, total 1,217 genes were cloned into VIGS vectors, and their function was examined by VIGS. The 1,217 genes include 492 genes that are putatively involved in plant development, hormone action, and signal transduction, and 725 unknown/hypothetical genes. The phenotype/sequence database is being constructed (hnp://kribb.re.k.), which contains the information on the o bserved plant phenotypes from VIGS-mediated gene silencing, the EST sequences, and Blas-X results. Chapter 2 In human, CHMP1 encodes a protein with dual function, which plays a role in both modification of chromatin structure in the nucleus and vesicle trafficking in the endosome. Recently, it was found that sall, the CHMP1 homolog in maize, plays a critical role in development of aleurone cell layers in maize endosperm. In this study, we investigated molecular characteristics and cellular function a CHMP1 homolog from Nicotiana benthamiana, designated NbCHMP1 NbCHMP1 encoded a small protein with a bipartite nuclear localization signal at the N-terminus, and exhibited high sequence homology with the corresponding genes from diverse plant and animal species. The NbCHMP1 mRNA was detected in stems, roots, flowers, and leaves at the similar levels. The GFP fusion protein of the full length NbCHMP1 distributed in the cytosol as distinct forms, while the GFP fusion protein of its N-terminal 80 aa peptide was targeted to the nucleus, indicating dual-targeting of the NbCHMP 1 protein in plants. Overexpression of NbCHMP1 in yeast did not affect growth and viability of the organism based on the flow cytometry, and the expressed protein was localized in the cytosol as distinctive specks. Virus-induced gene silencing of NbCHMP1 resulted in subtle alteration in leaf morphology and in leaf color, without significantly affecting plant viability or development in the VIGS lines. Thus CHMP1 homolog apparently does not play a critical role in development of the vegetative tissues of the dicotyledonous plants, in contrast to its essential role in the determination of aleurone cell layers in maize endosperm. Chapter 3 BTF3 is a protein initially identified in HeLa cells that may be involved in the initiation of transcription, During large-scale VIGS screening in N. benthamiana, I found that gene silencing of NbBTF3 encoding a NTF3 homolog in N. benthamiana, resulted in leaf yellowing phenotypes. In this study, I investigated molecular characteristics and putative functions of NbBTF3 of N. benthamiana. NbBTF3 encoded a putative 160 amino acid protein with a nuclear localization signal at the N-terminus, and exhibited high sequence homology with the corresponding genes from diverse plant species. The NbBTF3 mRNA was expressed in stems, roots, leaves and flowers at the similar levels. The NbBTF3 protein was targeted the nucleus when the N-terminal 80 as (including NLS) was expressed as a GFP fusion protein. Suppression of NbBTF3 by virus-induced gene silencing did not significantly affect the growth of plants, while changes were observed in leaf morphology and in leaf color. Chloroplast numbers and chlorophyll contents in the light-green sectors of the TRV:NbBTF3 leaves was reduced to 75-80% of the TRV control. Furthermore, expression of the chloroplast- and mitochondria-encoded genes was downregulated by gene silencing of nuclear-targeted NbBTP3. Based on these results we speculate that NEP-mediated transcription including transcription of the PEP gene encoding plastid-encoded RNA polymerase in the chloroplasts was inhibited by reduced transcription of the NEP gene in the nucleus, hence the reduced amounts of chloroplast-targeted NEP, due to depletion of the general transcription factor NbBTF. The nuclear-targeted BTF3 may play a role in the transcription of nuclear NEP gene.

Virulence gene silencing of Ralstonia pseudosolanacearum through small RNA interspecific translocation

김도연 과학기술연합대학교대학원 2023 국내석사

Bacterial wilt caused by Ralstonia pseudosolanacearum occurs on solanaceous plant species, such as tomato, potato, and tobacco. R. pseudosolanacearum can survive in the soil, plant, and even agricultural tools. So, R. pseudosolanacearum can be spread by contaminated soil, infected plants, and contaminated agriculture tools. The most widely used method of controlling R. pseudosolanacearum was a chemical method through soil fumigation. However, the chemical control method had the disadvantage of killing the soil microbes non-specifically and creating the soil dysbiosis, which reduced the bacterial diversity in the soil. Therefore, the particular targeting control of R. pseudosolanacearum was needed for overcoming the broad kill of soil microbes and decrease of the soil bacterial diversity using the chemical compound. In the study, a new strategy for specific control of R. pseudosolanacearum was studied by using host-induced gene silencing. The mechanism of HIGS was employed to silence the virulence gene in pathogens by expressing homologous dsRNAs in the host plant. HIGS system has been studied as a method for controlling eukaryotic phytopathogens, such as fungi, nematodes, insects, and parasitic plants. However, study of control using translocated siRNA from plant to bacterial pathogen was lacking. In my study, the prokaryotic phytopathogen were controlled in plant using HIGS system. 토양 세균 중에 Ralstonia pseudosolanacearum은 토마토, 감자, 담배 등 가지과 작물에 풋마름병을 일으켜 식물을 고사시킨다. R. pseudosolanacearum은 난방제성 병원균으로 방제 방법 중 항생제를 이용한 화학적 방제 방법이 가장 효과적이다. 하지만 비 선택적으로 토양 세균을 사멸시키는 항생제로 인해 토양 내 세균 다양성이 감소된다는 단점을 가지고 있다. 따라서 R. pseudosolanacearum만을 선택적으로 방제하기 위한 새로운 대안이 필요하다. R. pseudosolanacearum의 병원성 유전자만을 인식하여 절단할 수 있는 small interference RNA (siRNA)를 이용하여 R. pseudosolanacearum의 병원성 유전자 침묵 방법이 중요한 대안으로 여겨진다. 이와 같이 식물 세포에서 만들어진 siRNA가 식물 병원균으로 전달되어 병원균의 병원성 유전자가 침묵 되는 현상을 host-induced gene silencing (HIGS) 이라 부른다. 기존의 HIGS 시스템은 식물에서 진균으로 이동하는 siRNA에 의한 식물병원성 진균 방제 방법으로 연구가 많이 진행되었다. 하지만 식물인 진핵 생물과 원핵 생물인 병원 세균 사이를 이동하는 siRNA에 의한 식물 병원 세균 방제에 관한 연구는 미흡했다. 본 논문에서는 HIGS 시스템을 통해 진핵생물인 식물에서 만들어진 siRNAs에 의해 원핵 생물인 식물병원 세균을 방제할 수 있음을 밝혔다.

Simultaneous delivery of multiple gene-targeting siRNAs/anticancer drug for synergistically enhanced treatment of prostate cancer

Yoo, Wonjae Sungkyunkwan university 2018 국내석사

Simultaneous silencing of multiple apoptosis-related genes is an attractive approach to treat cancer. In this paper, it is presented for a multiple gene-targeting siRNA/drug delivery system for prostate cancer treatment with high efficiency. Bcl-2, survivin and androgen receptor genes involved in the cell apoptosis pathways were chosen as silencing targets with three different siRNAs. The colloidal nanocomplex delivery system (<10 nm in size) was formulated electrostatically between anionic siRNAs and a cationic drug (BZT), followed by encapsulation with Pluronic F-68 polymer. The formulated nanocomplex system exhibited sufficient stability against nuclease-induced degradation, leading to successful intracellular delivery for the desired therapeutic performance. Silencing of targeted genes and apoptosis induction were evaluated in vitro on human prostate LNCaP-LN3 cancer cells by using various biological analysis tools (e.g., real-time PCR, MTT cell viability test, and flow cytometry). It was demonstrated that when the total loaded siRNA amounts were kept the same in the nanocomplexes, the simultaneous silencing of triple genes with co-loaded siRNAs (i.e., Bcl-2, survivin, and AR-targeting siRNAs) induced apoptosis of cancer cells more efficiently than the silencing of each single gene alone, offering a novel way of improving the efficacy of gene therapeutics of prostate cancer.

Analysis of multi-gene targeting RNAi triggers in the perspective of gene silencing and innate immune activation

Kang, Younggyu Sungkyunkwan University 2022 국내박사

Since the introduction of the original siRNA structure, which harbors 19 bp-long dsRNA region with 2-nt 3' overhangs on both ends, several RNAi triggers that show comparable gene silencing efficiency compared with the original siRNA structure have been reported. However, when devising complex RNAi structures with unique structural features and functionalities, the possibility of non-specific phenomena such as innate immune stimulation by complex RNA structures should be carefully addressed. Herein, I evaluated immunogenicity of complex RNAi triggers, chemically synthesized long dsRNAs and tripodal RNA (tiRNA), which allow multiple target gene silencing. First, I found that blunt-ended tiRNA induced RIG-I-mediated innate immune response, which was suppressed by the introduction of the 2-nt 3' overhang structure. Additionally, I found that linear 16 bp-long dsRNA arm is an immunogenic determinant of tiRNA structure. Second, I found that RIG-I-mediated innate immune stimulation by chemically synthesized long double-stranded RNAs is structure- and sequence-dependent. Surprisingly, in contrast to earlier reports that focused on the sequence of single-stranded RNA, I found that sequence composition of dsRNA termini is important for sequence-dependent RIG-I activation. Third, I identified that tiRNAs and long dsRNAs over 38 bp could elicit multiple target gene silencing, suggesting that those structures can be novel RNAi therapeutics platforms. Taken together, the findings in this study may serve as guidelines to develop an immunostimulatory RNAi trigger to exploit host’s innate immune system as well as a specific multi-gene targeting RNAi therapeutics platform without non-specific innate immune stimulation via RIG-I. 19 bp 길이의 이중 가닥 RNA의 양쪽 말단에 2-nt 3' overhang가 있는 siRNA의 구조가 보고된 이후로, 이 siRNA와 비슷한 수준의 유전자 침묵 효과를 보여주는 많은 RNA 구조체들이 보고되었다. 그러나 독특한 구조와 특수한 기능성을 가지는 복잡한 RNA 구조체들은 선천성 면역반응과 같은 비특이적 반응을 일으킬 수 있다. 따라서 이 RNA 구조체를 치료제로 이용하기 위해서는 각 구조체들이 일으키는 비 특이적 반응들을 반드시 평가하고 또한 최소화할 수 있어야한다. 본 연구에서는 복수의 유전자를 동시에 침묵시킬 수 있는 화학적으로 합성된 긴 이중 가닥 RNA 및 세 개의 짧은 이중 가닥 RNA를 가진 tripodal RNA (tiRNA)가 일으키는 면역반응을 평가하였다. 첫째, blunt 말단을 가진 tiRNA는 RIG-I를 통한 선천성 면역반응을 일으켰으나, 2-nt 3' overhang을 이중 가닥 RNA 말단에 부착하므로 선천성 면역반응의 유도를 억제할 수 있었다. 또한 tiRNA 구조에서 16 bp 길이의 선형 이중 가닥 RNA가 RIG-I 매개 면역반응을 일으키는데 중요한 요소인 것을 밝혀냈다. 둘째, blunt 말단을 가지며 화학적으로 합성된 긴 이중 가닥 RNA 또한 RIG-I를 통한 선천성 면역반응을 일으키는 것을 확인하였으며, RNA의 구조뿐만 아니라 이중 가닥 RNA의 염기서열이 RIG-I 활성화에 중요하다는 것을 밝혀내었다. 특히 단일 가닥 RNA의 염기서열이 RIG-I를 활성화시킬 수 있다는 이전 보고들과는 다르게 이중 가닥 RNA의 염기서열, 특히 이중 가닥 RNA 말단에 있는 염기서열이 RIG-I 매개 면역 반응을 유도할 수 있다는 것을 밝혀내었다. 마지막으로 tiRNA와 화학적으로 합성된 긴 이중 가닥 RNA가 일으키는 유전자 침묵 효과를 확인하므로 본 연구에서는 위의 두가지 RNA 구조가 새로운 RNA 간섭 치료제 platform으로 이용될 수 있는 가능성을 제시하였다. 정리하면, 본 연구의 결과는 환자의 면역 체계를 활성화시켜 질병치료에 도움을 주는 RNA 간섭 치료제를 개발하거나 RIG-I를 통한 선천성 면역반응의 유도 없이 복수의 유전자를 서열 특이적으로 침묵시킬 수 있는 새로운 RNA 간섭 치료제 개발에 중요한 단초를 제공할 것이다.

Identification and functional characterization of potential thermo-tolerance genes in Solanum tuberosum : 유전자 기능성 스크리닝, 발현억제 및 과발현 방법을 이용한 감자의 (Solanum tuberosum) 고온 스트레스 적응 유전자 기능연구

간가다르히레마스 건국대학교 대학원 2015 국내박사

Potato (S. tuberosum) is a highly heat sensitive crop; a slight rise from optimal temperature can lead to drastic decline in tuber yield. Acclimatization to elevated temperature often demands transcriptional reprogramming of an array of genes to evoke protection from heat stress. First step towards understanding the thermo-tolerance mechanism is to identify the key genes involved in it. Here yeast functional screen method was used to identify potential thermo-tolerance genes from potato. Two cDNA libraries were constructed from heat stressed potato plants (35°C) after 2 and 48 h treatment to identify genes involved in early and late heat stress responsive genes. Ninety-five potential thermo-tolerance candidate genes were identified from yeast cells expressing different cDNAs based on their ability to survive lethal heat stress condition. Moreover, cross- resistance analysis of these clones indicated 20 genes were responsive to drought, 14 to salt and 11 to both stress; suggesting the functional relevance of these genes in abiotic stress tolerance. To obtain molecular evidence on which genes are functionally important for innate and/or acquired thermo-tolerance in higher plants, knockdown (KD) lines for five potato homologs, including GLP1 (Germin-like protein 1), nsLTP (Non-specific lipid transfer protein), PI-PLC (phosphoinositide-specific phospholipase-c), CHP (Conserved hypothetical protein) and RPL4 (60 S Ribosomal L4/L1 protein) were generated using virus induced gene silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana. Silencing of these genes was proved to be effective; an observation was supported by significant reduction in quantitative abundance of the target gene transcripts in respective lines. Among the genes tested, GLP1-KD lines exhibited a strong hypersensitive phenotype under heat stress. To substantiate the inference from the VIGS study, potato transgenic plants constitutively over-expressing StGLP gene were generated and its performance under heat stress was studied. Three (G9, G12 and G15) StGLP transgenic lines exhibited enhanced thermo-tolerance through H2O2 mediated up-regulation of StCAT, StAPX , StGR and other heat stress responsive genes, StHSP70, StHSP20 and StHSP90. These results confirmed further confirmed inference obtaibed from VIGS study, that H2O2 produced by over-expression of StGLP in the transgenic potato plants triggered the ROS scavenging signaling pathways controlling antioxidant and heat stress responsive genes imparting tolerance to heat stress in transgenic plants. To the best of knowledge, this is the first study to describing the role of GLP1 in association with improved thermo-tolerance any economically important crop using transgenic techniques. 감자는 고온 스트레스에 민감한 작물이다; 생육적온에서 약간의 온도상승만으로도 감자 수확량에 큰 감소를 야기시킬 수 있다. 고온 스트레스에 대한 적응과정은 많은 수의 유전자 발현의 재조정이 필요한 복잡한 과정이다. 이런 고온 적응 기작에 대한 이해는 핵심유전자의 발굴로부터 시작된다. 감자의 고온 적응성 유전자의 분리를 위하여 효모를 이용한 기능성 탐색기법을 이용하였다. 이를 위해 고온 (35°C) 에 2시간과 48시간 노출된 감자로부터 효모 발현 cDNA 유전자 은행 각각 만들고, 고온 조건에서 기능성 탐색을 거쳐 95개의 후보 유전자를 선발하였다. 이들에 대한 다중 스트레스 저항성 시험에서 건조에 대해서는 20개 유전자, 염 스트레스에는 14개 유전자 그리고 11개 유전자는 염과 건조 및 고온에 대하여 저항성을 보였다. 이는 이들 유전자의 비생물적 스트레스 저항성 관련 가능성을 시사한다. 이들 유전자의 식물에서의 고온 저항성 여부를 알아보기 위하여 GLP1 (Germin-like protein 1), nsLTP (Non-specific lipid transfer protein), PI-PLC (phosphoinositide-specific phospholipase-c), CHP (Conserved hypothetical protein) 그리고 RPL4 (60 S Ribosomal L4/L1 protein) 유전자들에 대해 Nicotiana benthamiana를 이용하여 virus induced gene silencing (VIGS)을 적용하였다. VIGS를 통한 대상 유전자들의 발현억제가 모두 확인 되었으며, GLP1-KD 억제 담배의 경우 심한 고온스트레스 민감성을 나타내었다. 이 결과는 GLP1유전자가 정상 발현상태에서 고온 적응성에 주요한 역할을 수행 할 수 있음을 의미한다. VIGS 결과의 검증을 위하여 StGLP1 유전자의 과발현 감자 형질전환체 3개체 (G9, G12 그리고 G15)를 만들고 이들에 대한 고온 저항성을 조사하였다. StGLP1 형질전환 감자는 고온스트레스에 대한 저항성을 보였으며 이는 H2O2 를 통한 세포의 활성산소 제거 유전자인 StCAT, StAPX, StGR 및 단백질 폴딩 조절 유전자 StHSP70, StHSP20 그리고 StHSP90등 스트레스 관련 유전자의 발현증가를 통해 이루어졌다. 이는 VIGS 결과를 뒷받침하며 StGLP1 유전자의 과발현이 H2O2의 증가와 이를 통한 ROS 관련 신호전달 체계를 활성화하여 항산화 물질 및 고온 스트레스 관련 유전자의 발현 증가를 이끌고 결과적으로 형질전환체의 고온스트레스 저항성을 유기한다. 이 결과는 고온 스트레스 저항성에 GLP1 유전자가 관여한다는 최초의 결과이며, 형질전환을 통한 주요경제 작물의 고온 적응성 증진에 주요한 정보이다.

Functional studies of antisense oligonucleotides targeting IRES on hepatitis C viral RNA genome : C형 간염 유전체의 IRES를 표적으로 하는 안티센스

김효선 건국대학교 대학원 2013 국내석사

Peptide nucleic acids (PNAs) that bind to complementary nucleic acid sequences with extraordinarily high affinity and sequence specificity can be used as antisense oligonucleotides against microRNAs, namely antagomir PNAs. However, methods for efficient cellular delivery must be developed for effective use of PNAs as therapeutic agents. Here, I demonstrate that antagomir PNAs can be delivered to hepatic cells by complementary DNA oligonucleotide and cationic liposomes containing galactosylated ceramide and a novel cationic lipid, DMKE (O,O′-dimyristyl-N-lysyl glutamate), through glycoprotein-mediated endocytosis. An antagomir PNA was designed to target miR-122, which is required for translation of the hepatitis C virus (HCV) genome in hepatocytes, and was hybridized to a DNA oligonucleotide for complexation with cationic liposome. The PNA-DNA hybrid molecules were efficiently internalized into hepatic cells by complexing with the galactosylated cationic liposome in vitro. Galactosylation of liposome significantly enhanced both lipoplex cell binding and PNA delivery to the hepatic cells. After 4 h incubation with galactosylated lipoplexes, PNAs were efficiently delivered into hepatic cells and HCV genome translation was suppressed more than 70% through sequestration of miR-122 in cytoplasm. PNAs were readily released from the PNA-DNA hybrid in the low pH environment of the endosome. The present study indicates that transfection of PNA-DNA hybrid molecules using galactosylated cationic liposomes can be used as an efficient non-viral carrier for antagomir PNAs targeted to hepatocytes. Short hairpin RNA transcribed with T7 RNA polymerase contains 5’-triphosphate, which has been recognized as a pathogen association molecular pattern motif by the cytosolic RNA sensor, retinoic acid inducible gene I (RIG-I). This transcribed small duplex RNA is hypothesized to not only execute selective gene silencing via RNAi, but also induce type I interferon (IFN) through activation of RIG-I signaling. I first evaluated gene silencing efficacy of the short hairpin RNA containing 5’-triphosphate (3p-shRNA) targeting the hepatitis C virus (HCV) RNA genome in hepatic cells. Gene silencing activity of the 3p-shRNA was diminished due to the presence of the 5’-triphosphate moiety in shRNA, whereas the shRNA counterpart without 5’-triphosphate (HO-shRNA) showed a strong antiviral activity without significant induction of type I IFN in the cells. I observed that the 3p-shRNA is a better activator of the RIG-I signaling than the HO-shRNA with an elevated induction of type I IFN in cells that express RIG-I. Physical association between RIG-I protein and each shRNA indicated the importance of the 5’ terminal triphosphate of duplex RNA in the binding and stimulation of ATPase activity in vitro. I further demonstrated that presence of the 5’ terminal triphosphate in siRNA attenuates the efficacy of selective gene silencing of GFP when cells were transfected with various siRNAs at low dosage. Taken together, the results of this study suggest that competition in 3p-shRNA binding between RIG-I and RNA interference factors compromises the efficacy of selective gene silencing.

Identification of the CaAN3 Gene that Regulates Fruit-specific Anthocyanin Biosynthesis in Pepper (Capsicum annuum)

변진영 서울대학교 대학원 2022 국내석사

The key regulatory gene CaAN2 encoding R2R3 Myeloblastosis (MYB) transcription factor has been known to regulate anthocyanin biosynthesis in various tissues in pepper. CaAN2 is not expressed in certain pepper accessions showing fruit-specific anthocyanin accumulation. In this study, a novel locus named CaAN3 that regulates fruit-specific anthocyanin biosynthesis was identified. An F2 population segregating for CaAN3 was constructed by self-pollination of an F1 hybrid cultivar showing purple immature fruits. Total RNA was extracted from the F2 plants and separately pooled according to purple and green phenotypes. Three RNA pools containing six individuals were prepared for each phenotype. Bulked segregant RNA sequencing was conducted for two different RNA pools via the Illumina platform. Raw sequences were aligned to the pepper reference genome ‘Dempsey’, and a total of 6,672 significant single nucleotide polymorphisms (SNPs) were identified by calculating (SNP index) between the two pools. Molecular mapping was conducted to delimit the target region of CaAN3 spanning 184.6 - 186.4 Mbp of chromosome 10. Fifteen candidate genes were annotated in the target region, and Dem.v1.00043895, an R2R3 MYB transcription factor, was selected from them as the strongest candidate gene based on the differentially expressed genes analysis result. Sequence analysis revealed that there are four indel variations in the promoter region of the CaAN3 green allele. Virus-induced gene silencing and transient overexpression assay were performed to characterize the function of the candidate gene. When Dem.v1.00043895 was silenced, anthocyanin accumulation in pericarps was significantly reduced. When Dem.v1.00043895 was overexpressed in Nicotiana benthamiana leaves, anthocyanins accumulated around the inoculation sites. These results showed that Dem.v1.00043895 functions as CaAN3, an activator of anthocyanin biosynthesis in pepper fruits. Gene expression analysis and genotypic screening were performed using 24 different pepper accessions to test whether CaAN3 functions generally. CaAN3 was expressed only in the fruit-specific purple accessions. However, genotype analysis revealed that the structural variations in the promoter region were not directly related to the expression of CaAN3, indicating that another genetic factor is involved in anthocyanin biosynthesis in pepper fruit. R2R3 MYB 전사 인자를 암호화하는 주요 조절 유전자 CaAN2는 고추의 다양한 조직에서 안토시아닌 생합성을 조절하는 것으로 알려져 있다. 그러나 CaAN2는 과실 특이적으로 안토시아닌을 발현하는 일부 고추에서 발현하지 않는다. 이 연구에서는 과일 특이적 안토시아닌 생합성을 조절하는 CaAN3라는 새로운 유전자좌를 확인하였다. Capsicum annuum 'Salad Piment Purple' 품종에서 유래한 F2 분리집단을 구축하여 유전자 매핑을 위한 집단으로 활용하였다. F2 집단의 식물체 과실을 샘플링하여 RNA를 추출하였고 보라색 및 녹색의 표현형으로 구분하여 풀링하였다. 각각 6개씩의 서로 다른 과실에서 추출한 RNA로 구성된 3개의 RNA 풀을 보라색, 녹색 표현형에 대해 준비하였다. Illumina 플랫폼을 통해 이 두 개의 서로 다른 RNA 풀에 대해 Bulked-segregant RNA 시퀀싱(BSR-Seq)을 수행하였다. 읽어 낸 염기서열은 고추 표준유전체인 'Dempsey'를 기준으로 정렬되었으며 두 풀 간의 (SNP index)를 계산하여 총 6,672개의 유의한 SNP를 식별하였다. 분자 표지를 통한 매핑 결과 CaAN3의 후보 구간을 10번 염색체 상의 184.6-186.4Mbp로 특정할 수 있었다. 이 후보 구간 안에서는 15개의 후보 유전자를 발견하였으며, 이 중 DEG 분석 결과를 기반으로 가장 강력한 후보 유전자로서 R2R3 MYB 전사 인자인 Dem.v1.00043895를 선택하였다. 해당 유전자에 대한 염기서열 분석을 통해 녹색 대립 유전자의 프로모터 영역에 4개의 INDEL 변이가 있음을 확인하였다. 또한 후보 유전자의 기능 분석을 위해 virus-induced gene silencing 및 transient overexpression 분석을 수행하였다. Dem.v1.00043895를 침묵시켰을 때, 안토시아닌 생합성 유전자의 발현과 과피에서의 안토시아닌 축적이 감소하였다. 또한 N. benthamiana 잎에서 Dem.v1.00043895를 과발현시켰을 때 접종 부위 주변에 안토시아닌이 축적되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 통해 Dem.v1.00043895가 고추의 과실에서 안토시아닌 생합성의 조절 유전자인 CaAN3로 기능한다는 것을 확인하였다. 마지막으로 CaAN3가 일반적으로 기능하는지 여부를 테스트하기 위해 유전자 발현 분석 및 유전형 스크리닝을 24가지 다른 고추 계통에 대해 수행하였다. 과실 특이적으로 자색을 발현하는 계통들에서는 CaAN3만이 발현되는 것을 확인하였다. 그러나 전반적인 유전형 검토 결과 프로모터 구간의 구조적 변이가 CaAN3의 발현과는 직접적인 관련이 없음을 확인할 수 있었다.

Identification of Novel Genes Regulating the Capsaicinoid Biosynthesis Pathway in Pepper Using Transcriptome Analysis

김정민 서울대학교 대학원 2023 국내석사

Capsaicinoid is a unique secondary metabolite that is synthesized only in Capsicum spp. It provides a pungent taste that made pepper commercially popular as spice. Genes encoding acyltransferase (Pun1), putative aminotransferase (pAMT), CaMYB31 (Pun3), and putative ketoacyl-ACP reductase (KR) were functionally validated to be involved in the capsaicinoid biosynthesis. However, the whole biosynthetic pathway and its regulatory network has not been fully understood. In addition, the mechanism controlling capsaicinoid biosynthesis in pericarp tissues of certain Capsicum spp. remains to be revealed. In this study, transcription data of pepper placenta tissues and pericarp tissues from the previous studies were used to find candidate genes involved in capsaicinoid biosynthesis. Differentially expressed genes (DEG) analysis and Weighted correlation network analysis (WGCNA) discovered candidate genes that might be involved in capsaicinoid biosynthesis. By aligning these genes to QTL positions reported in the previous studies, three genes (Pun1, pAMT, G3PAT) in placenta transcriptome data and two genes (KR, HDG11L) in pericarp transcriptome data were identified. G3PAT and HDG11L encoding acyltransferase and transcription factor, respectively, were newly identified in this study. To validate the function of the genes, two genes were silenced by the virus induced gene silencing (VIGS) method. VIGS of G3PAT resulted in reduction of capsaicinoid content in placenta of pepper fruit, and expression changes in phenylpropanoid pathway and branched fatty acid pathway genes were observed. The results in this study will be useful for further understanding the capsaicinoid biosynthesis. 캡사이시노이드 (capsaicinoid)는 고추속에서만 만들어지는 특이한 2차 대사산물이다. 이는 고추가 신미를 내게 해주는 물질이며, 조미료로써 상업적인 중요도를 갖게 해 주었다. 캡사이시노이드 생합성에는 Pun1, pAMT, Pun3, CaKR1가 관여한다고 기능적으로 검증되었다. 하지만 전체적인 생합성 경로와 이를 조절하는 네트워크는 명확하게 규명되지 않았다. 이에 더해, 과피 조직에서 캡사이시노이드를 합성하는 기작에 대해서 역시 밝혀진 바가 없다. 본 연구에서는 기존에 공개된 고추의 태좌와 과피의 전사체 자료를 사용하여 캡사이시노이드 생합성에 관여하는 후보 유전자를 찾고자 하였다. 차등발현유전자 분석과 WGCNA 방법을 사용하여 캡사이시노이드 생합성에 관여하는 후보유전자를 발견할 수 있었다. 후보유전자들을 기존에 보고된 QTL 지역과 비교하여 태좌 전사체 자료에서 세 개 유전자(Pun1, pAMT, G3PAT)를, 과피 전사체 자료에서 두 개 유전자(KR, HDG11L)를 얻을 수 있었다. G3PAT와 HDG11L은 각각 아실기전이효소와 전사인자를 코딩하는 유전자로, 기존에 신미에 관여한다고 밝혀진 바 없는 유전자이다. 기능 검정을 위해 두 유전자는 VIGS 방식으로 silencing되었다. G3PAT의 VIGS를 통해 고추 태좌의 캡사이시노이드 함량이 줄어들었으며, 페닐프로파노이드와 분지지방산 합성 경로에 관여하는 유전자 발현에도 변화가 일어난 것을 확인하였다. 이러한 결과는 추후 캡사이신 생합성 과정을 이해하는데 도움이 될 것이다.