Pre-mRNA processing factor 4 and Prostaglandin E2 blocks curcumin-induced apoptosis in cancer models : 여러 암세포 모델에서 pre-mRNA processing factor 4와 프로스타글란딘 E2에 의한 curcumin-유도성 세포사멸의 억제

Shehzad, Adeeb 경북대학교 대학원 2014 국내박사

The present study was performed to investigate the underlying mechanism of anti-cancer and radiosensitizing effects of curcumin in colorectal carcinoma as well as in B16F10-induced tumor xenograft. Curcumin (a derivative of turmeric), an active constituent of turmeric, is a well-described phytochemical, which has been used since ancient times for the treatment of various diseases. However, the exact molecular mechanism underlying curcumin-induced cell death and radiosensitivity effect for the prevention of colorectal carcinoma cell death remain unknown. Curcumin inhibited HCT-15 cells proliferation and induced apoptosis in a dose- and time-dependent manner. Hoechst 33342 and DCFHDA staining revealed morphological and biochemical features of apoptosis as well as ROS generation in HCT-15 cells treated with 30 and 50 μM curcumin. Western blot analysis revealed that curcumin treatment activated caspase-3 and decreased expression of p53 and Prp4B in a time-dependent manner. Transfection of HCT-15 cells with Prp4B clone perturbed the growth inhibition induced by 30 μM curcumin. Fractionation of cells revealed increased accumulation of Prp4B in the nucleus, following its translocation from the cytoplasm. To further evaluate the underlying mechanism and survival effect of Prp4B, we generated siRNA-Prp4B HCT15 clones. Knockdown of Prp4B with siRNA diminished the protective effects of Prp4B against curcumin-induced apoptosis. Furthermore, Ionizing radiation induced apoptosis through ROS generation, which was further potentiated by curcumin treatment. Flow cytometry revealed a dose-dependent response for radiation-induced cell death, which was remarkably reversed by transfection of cells with Prp4K clone. Over-expression of Prp4K resulted in a significant decrease in ROS production possibly through activation of an anti-oxidant enzyme system. Prp4K knockdown by siRNA ultimately restored radiation-induced ROS generation. Furthermore, B16F10 xenografts in C57BL/6J mice were established in order to investigate the radio-sensitizing effect of curcumin in vivo. Curcumin significantly enhanced the efficacy of radiation therapy and reduced tumor growth as compared to control or radiation alone. We also investigated that pretreatment of HCT-15 cells with PGE2 inhibited curcumin-induced oxidative stress apoptosis. PGE2 activates COX-2 and PKA, which might be require for cAMP-mediated transcriptional activation of CREB. However, treatment of cells with EP2 receptor antagonist AH6809 and PKA inhibitor H89 before exposure to PGE2 or curcumin, abolished the protective effect of PGE2. PGE2 activated Ras/Raf/Erk pathway and pretreatment with PD98059 discarded the protective effect of PGE2. Furthermore, curcumin treatment for 24 h greatly reduced the phosphorylation of CREB, followed by a concomitant reduction in NF-κB subunits, as well as activation of IKBα. PGE2 markedly inhibited the IKBα expression and hence activated NF-κB translocation to the nucleus. Taken together, these results suggest that Prp4 and PGE2 enhance the survival as well as protect the cancer cells death by activating the anti-oxidant enzymes, Ras/Raf/Erk, and NF-κB pathways. We hope that the outcome of this study will be a potential step forward in understanding the role of curcumin for cancer therapy. 본 연구는 결장암세포와 B16F10-유도성 종양에서 curcumin의 항암 및 방사선민감 효과에 대한 기전을 알아보기 위해 수행하였다. Curcumin은 생강과 식물인 강황의 뿌리에서 추출한 노란색 향신료의 일종으로 예전부터 널리 알려져 있으며, 항종양, 항산화, 항염증 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 그러나 결장암 세포의 세포사멸을 유도하는 정확한 분자적 기전에 대하여 알려진 보고는 없다. 따라서 결장암 세포(HCT-15)에 curcumin을 처리하고 암세포 사멸 과정 중 세포 내 변화를 형태적, 생화학적 변화를 살펴 보았다. Curcumin 처리에 의해 농도 및 시간-의존적으로 결장암 세포의 증식을 억제하고 세포사멸을 유도하였다. 또한 Hoechst 33342 및 DCFHDA 형광염색으로 관찰한 결과, curcumin 처리에 의해 세포사멸의 형태적 및 생화학적 변화를 보였을 뿐 아니라 세포 내 활성산소종의 농도도 증가하였다. Western blotting으로 분석해 본 결과에서도 시간-의존적으로 p53, pre-mRNA processing factor 4B (Prp4B)의 발현이 감소하였고, caspase-3의 활성이 증가하는 것으로 나타났다. 그러나 Prp4B 유전자를 도입한 HCT-15 세포에 curcumin(30 을 처리하게 되면 curcumin에 의해 유도된 증식 억제 효과가 나타나지 않았다. 유전자가 도입된 세포에서는 Prp4B단백질은 발현이 증가하고 세포질에서 핵으로 이동하는 것을 확인하였다. 그리고 Prp4B에 의한 세포 생존의 기능을 더 확인해 보기 위해 siRNA-Prp4B HCT-15클론을 만들었다. 그 결과, siRNA에 의한 Prp4B유전자가 결핍된 결장암 세포에서는 curcumin-유도성 세포사멸에 대한 Prp4B의 억제 효과가 사라지는 것으로 나타났다. 암세포에 방사선을 조사하면 세포 내 활성산소종이 증가하여 세포사멸을 유도한다. 방사선 조사와 함께 curcumin을 처리하면 세포사멸 효과가 증폭된다. 유세포분석기로 확인해 본 결과, curcumin에 의해 방사선-유도 세포사멸이 농도-의존적 효과를 보였으며 Prp4B 유전자 도입세포에서는 그 효과가 훨씬 증가하는 것으로 나타났다. 또한 Prp4B가 과발현된 세포에서는 항산화 효소들의 활성화를 통해 활성산소종이 대폭 감소하는 것으로 나타났다. 이 때 siRNA에 의해 Prp4B를 제거하면 방사선-유도 활성산소종 생성이 급격히 회복되는 것으로 나타났다. 그리고 C57BL/6J 생쥐에 B16F10 흑색종을 유도한 후 curcumin의 방사선민감 효과를 확인하였다. 그 결과, 대조군 및 방사선 단독 처리한 경우에 비해 방사선과 함께 curcumin을 처리하면 암세포 증식 및 방사선 치료의 효능을 현저히 증가시키는 것으로 나타났다. 그리고 결장암세포에 curcumin을 처리하여 산화적 스트레스에 의한 세포사멸은 프로스타글란딘 E2(PGE2)에 의해 억제되는 것으로 나타났다. PGE2는 세포 내 cyclooxygenase-2(COX-2)와 단백질 인산화효소 A(PKA)를 활성화하고 그로 인해 cAMP-유도성 전사인자 CREB의 전사 활성을 매개하였다. 그러나 EP2 수용체 길항제인 AH6809 또는 PKA 저해제 H89를 전처리하고 PGE2을 처리하면 curcumin에 대한 억제 효과가 사라지는 것으로 나타났다. 또한 MEK 신호전달 경로의 저해제인 PD98059를 처리하면 PGE2의 억제효과가 저해되는 것으로 보아 PGE2는 Ras/Raf/Erk 신호전달 경로를 유도하는 것으로 확인되었다. 또한 curcumin을 처리하면 CREB의 인산화 및 NFB 소단위들의 감소와 아울러 IB의 활성화를 유도하였다. 그러나 PGE2을 처리하면 IB의 발현이 현저히 감소하고 활성화된 NFB가 세포질에서 핵 내로 이동하는 것으로 나타났다. 이상의 결과들을 종합해 보면, Prp4B와 PGE2는 세포 생존을 향상시키고 암세포 사멸을 억제하는 것을 알 수 있었다. 이러한 효과는 항산화 효소, Ras 및 NFB신호전달 경로를 활성화하여 나타나는 것을 확인하였다. 따라서 본 연구는 암세포에 대한 curcumin의 역할을 좀 더 이해함으로써 항암 치료제 개발에 보다 나은 개선책이 될 것으로 생각된다.

효모의 스트레스에 의해 유도되는 아폽토시스에 대한 보호와 아세트산 이용시 구연산 합성효소의 역할 : Role of citrate synthase on protecting from stress-induced apoptosis and acetate utilization in Saccharomyces cerevisiae

이용주 충남대학교 대학원 2008 국내박사

The yeast Saccharomyces cerevisiae has been shown to contain three isoforms of citrate synthase (CS). The mitochondrial CS, Cit1, catalyzes the first reaction of the TCA cycle, i.e., condensation of acetyl-CoA and oxaloacetate to form citrate. The peroxisomal CS, Cit2, participates in the glyoxylate cycle. The third CS is aminor mitochondrial isofunctional enzyme, Cit3, and related to glycerol metabolism. However, the level of its intracellular activity is low and insufficient for metabolic needs of cells. It has been reported that Δcit1 strain is not able to grow with acetate as a sole carbon source on either rich or minimal medium and that it shows a lag in attaining parental growth rates on nonfermentable carbon sources. Cells of Δcit2, on the other hand, have similar growth phenotype as wild-type on various carbon sources. I studied the relationship between Cit1 and apoptosis in S. cerevisiae. Yeast cells with Δcit1 deletion showed a temperature-sensitive growth phenotype, and displayed a rapid loss in viability associated with typical apoptotic hallmarks, i.e., ROS accumulation, nuclear fragmentation, DNA breakage, and phosphatidylserine translocation, when exposed to heat stress. Upon long-term cultivation, Δcit1 cells showed increased potentials for both aging-induced apoptosis and adaptive regrowth. Activation of the metacaspase Yca1 was detected during heat- or aging-induced apoptosis in Δcit1 cells, and accordingly, deletion of YCA1 suppressed the apoptotic phenotype caused by Δcit1 mutation. Cells with Δcit1 deletion showed higher tendency toward glutathione (GSH) depletion and subsequent ROS accumulation than the wild-type, which was rescued by exogenous GSH, glutamate, or glutathione disulfide (GSSG). Beside Cit1, other enzymes of TCA cycle and glutamate dehydrogenases (GDHs) were found to be involved in stress-induced apoptosis. Deletion of the genes encoding the TCA cycle enzymes and one of the three GDHs, Gdh3, caused increased sensitivity to heat stress. These results led us to conclude that GSH deficiency in Δcit1 cells is caused by an insufficient supply of glutamate necessary for biosynthesis of GSH rather than the depletion of reducing power required for reduction of GSSG to GSH. And also, the biochemical basis of carbon metabolism in the yeast cells with deletion of CIT1 or CIT2 gene has not been clearly addressed yet. In the present study, I focused our efforts on understanding the function of Cit2 in utilizing C2 carbon sources and then found that Δcit1 cells can grow on minimal medium containing C2 carbon sources, such as acetate. I also analyzed that the characteristics of mutant strains defective in each of the genes encoding the enzymes involved in TCA and glyoxylate cycles and membrane carriers for metabolite transport. Our results suggest that citrate produced by peroxisomal CS can be utilized via glyoxylate cycle, and moreover that the glyoxylate cycle by itself functions as a fully competent metabolic pathway for acetate utilization in S. cerevisiae. 효모 Saccharomyces cerevisiae는 세가지 형태의 구연산 합성효소(CS)를 지니고 있다. 첫 번째, Cit1은 미토콘드리온 (mitochondrion) 에 존재하며, 에너지 생산의 중추적인 역할을 담당하는 구연산 회로의 첫 번째 효소로 작용한다. 두 번째, Cit2는 퍼옥시좀 (peroxisome)에 존재하며 글리옥실레이트 (glyoxylate) 회로에 관여한다. 마지막으로, Cit3는 세포내에 적은양으로 존재하며 활성도가 거의 측정되지 않는 효소로써 Cit1의 대체 효소로 존재한다. 지금까지 구연산 효소들의 관한 연구는 탄소원 대사와 관련된 기능이 대부분이며 대표적으로 cit1 돌연변이체가 아세테이트 (acetate)에서 자랄 수 없는 표현형을 나타낸다. 반면에 cit2 돌연변이체는 야생형 균주와 비교하여 별다른 표현형을 나타내지 않는다. 본 연구에서는 Cit1과 S. cerevisiae의 apoptosis와의 상호관계를 연구하였다. cit1 돌연변이체는 열민감성 표현형을 나타냈으며, apoptosis 지표인 ROS축적과 DNA 절단, 핵 분열, phosphatidylserine의 돌출등이 나타났다. 또한 오랜기간 배양하여 세포 노화를 시켰을 경우 야생형 균주에 비해 더 높은 비율로 세포 사멸이 나타났으며, 이 경우에도 위에서 언급한 apoptotic 지표들이 나타났다. cit1 돌연변이체에서 나타나는 열과 세포노화에 의존적인 apoptosis는 Yca1에 의존적이었다. Yca1은 효모 케스페이즈로써, apoptosis과정중에 활성화 되는 대표적인 apoptosis 유발 효소이다. cit1 돌연변이체는 열과 세포노화뿐 아니라, 여러가지 ROS 유발 물질에 의해서도 야생형 균주에 비해 훨씬 높은 민감성을 나타내었다. 이는 cit1 돌연변이체가 ROS 제거 기작에 문제가 있다는 것을 의미하며, 그 원인으로 세포내에 글루타메이트 (glutamate)가 부족하게 되어 ROS제거에 대부분을 차지하는 GSH합성에 문제가 있다는 사실을 알게 되었다. Cit1 뿐만 아니라 글루타메이트 합성과 관련된 또 다른 구연산 회로 효소들, 그리고 글루타메이트 합성 효소들도 ROS 유발 스트레스에 매우 민감한 표현형을 나타내었다. 이러한 결과들을 토대로 cit1 돌연변이체서 나타나는 ROS 유발-apoptosis는 세포내에 글루타메이트 합성 저하에 따른 GSH의 고갈이 그 원인임을 알게 되었다. 효모에서 구연산 회로 효소와 관련된 탄소원 이용관련 연구는 아직까지 밝혀지지 않은 부분들이 많이 남아있다. 따라서 본연구에서는 탄소원, 특히 아세테이트 이용시 Cit2의 역할에 대해 알아보았다. 또한 Cit2와 같이 글리옥실레이트 회로와 관련있는 여러 효소들의 돌연변이체들을 이용하여 세포내에 글리옥실레이트 회로에 관한 보다 정확한 이해를 하고자 하였다. Cit2는 cit1 돌연변이체에서 그 역할이 없다고 알려져 있었지만, 본 연구에서 Cit2 자체만으로 글리옥실레이트 회로에 기여할 수 있으며, 글리옥실레이트 회로가 구연산 회로의 작동 여부와 관계없이 세포내에서 작동할 수 있으며, 세포 대사에 필요한 에너지와 탄소골격등을 제공할 수 있다는 새로운 사실을 알게 되었다.

(The) caspase independent apoptosis induced by methanolic extract of Hibiscus sabdariffa L.

소담 서울대학교 대학원 2014 국내석사

Hibiscus sabdariffa L. is a polyphenol rich plant that is native to Africa and extract of hibiscus calyces is known for its health beneficial effects in various area inculding antioxidant, antiobesity and anticancer. It is an edible plant that is actually taken as beverages in daily life. Recent novel findings have shown that multiple polyphenols found in extract of hibiscus possess anticancer effect in various cancer cells. It is however still remained unclear how the extract of hibiscus can orchestrate complecate intertwining pathways to induce selective cell death. In the present study, the anticancer activity of methanolic extract obtained from calyces of hibiscus sabdariffa L. (HME) was demonstrated with bio-assays. The apoptotic cell death was selectively induced only for cancer cells but not in normal cells both in vitro and in vivo. Furthermore, HME induced cell death did not exhibit activation of caspase 3, despite the fact that morphological and biochemical characteristics such as DNA fragmentation and mitochondrial dysfunction showed that cells clearly undergo apoptosis. The mechanisms of which HME mediate apoptosis is through mitochondrial death pathway. Herein, the expression of various pathways were examined in time dependent manner in order to see how HME induced apoptosis is progressed. The activation of both proapoptotic and antiapoptotic proteins in MAP kinases, Akt and Bcl-2 families were evaluated through the course of study. HME induced apoptosis via dual regulation of accumulating proapoptotic proteins such as JNK, p38MAPK, Bim while attenuating antiapoptotic ones. Subsequently, these cascade of signaling activation induced the release of cytochrome c from mitochondria accompanied by mitochondrial dysfunction, which in turn upregulated translocaton of apoptosis inducing factor (AIF) into nucleus. Taken together, these findings indicated that signaling cascades induced from MAPK and Akt pathways altered mitochondrial membrane potential via mediating Bcl-2 family protein activation and releasing cytochrome c. As a consequence, the translocation of AIF played crucial role in HME-induced caspase independent apoptosis in human leukemic U937 cell.

Allergen-removed Rhus verniciflua stokes extract differently induces apoptosis in lung and ovarian cancer : 알러젠 제거 옻나무 추출물의 폐암과 난소암 세포에서의 서로 다른 apoptosis 유도

박재우 대전대학교 대학원 2013 국내박사

Rhus verniciflua Stokes has been known to treat gastric cancer as a traditional medicine but the direct use has been limited because of an allergenic toxin, urushiol. Thus, we removed the allergen and investigated the anti-cancer activities of allergen-removed Rhus verniciflua Stokes (aRVS) in the various kinds of cancer cell lines. Among them, A549 (lung cancer) and SKOV-3 (ovarian cancer) were most specifically suppressed by aRVS. The administration of aRVS at 0.5 mg/ml of IC50 induced apoptosis of A549 and SKOV-3 cells. By flow cytometric analysis and Western blot analysis, SKOV-3 cells appeared to be more sensitive to aRVS than A549 cells. NF-ĸB mediated apoptosis by aRVS in A549 and SKOV-3 cells were convinced by the serial activation of caspases. The medical application of aRVS can be possible as a therapeutic agent for ovarian and lung cancer. Keywords: allergen-removed Rhus verniciflua Stokes, A549 lung cancer, SKOV-3 human ovarian cancer, apoptosis 전통의학에서 위암치료에 활용되어온 옻나무에서 알러젠을 일으키는 urushiol을 제거한 알러젠 제거 옻나무추출물 (aRVS) 이 다양한 암세포에 서 항암활동을 가지고, 그 기전에 대한 실험 연구한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다. A549 (폐암 세포), SKOV-3 (난소암 세포), MCF7 (유방암 세포), DU145 (전립선암 세포), U2OS (골육종 세포) 등의 암세포 중에서 A549 (폐암 세포)와 SKOV-3 (난소암 세포)에서 항암효과가 가장 우수하였는데, 특히 aRVS의 농도가 0.5mg/ml 일때 가장 효과적이었다. IC50의 농도에서 A549와 SKOV-3 세포에서 apoptosis가 유도되었는데 flow cytometric 분석과 Western blot 분석을 통해서 SKOV-3 세포는 late apoptosis가 A549 세포에선 early apoptosis의 기전이 확인되었고, A549 세포와 SKOV-3 세포에 투입된 aRVS에 의해 NF-ĸB와 caspase의 일련의 활성화도 확인되었다. 이상의 결과로 의학적인 aRVS의 처방이 폐암 및 난소암 치료에 효과적일 것이라 사료되며, 향후 지속적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.

Hep3B와 HT-29세포에서 berberine과 5-azacytidine(5-aza)의 세포사 유도 기전에 관한 연구

김대연 강원대학교 대학원 2021 국내석사

The mechanism that induces apoptosis is still unclear. DNA methylation affects protein expression and is known to be one of the induction of apoptosis. p53 is a tumor suppressor gene and inactivation of this gene is associated with the expression of DNA methyltransferases(DNMTs). In Chapter 1 of this study, it was observed whether apoptosis was induced by treatment with berberine in Hep3B cells in which p53 expression was suppressed. In addition, the correlation between apoptosis, p53 expression and DNMT expression was investigated. As a result of the experiment, apoptosis of Hep3B cell increased as berberine concentration and treatment time increased. At this time, DNMT activity decreased, DNMT3b mRNA and protein expression were also decreased. In contrast to the decrease in DNMT3b expression, the expression of p53 was increased. In this study, berberine stimulation in Hep3B cells inhibited DNMT activity and DNMT3b expression. And it is thought that the expression of p53 is increased, leading to apoptosis. In order for cancer cells to grow, cancer cells must inhibit the production of reactive oxygen species(ROS) and consume glucose. Uncoupling protein 2(UCP2) is expressed in the inner membrane of the mitochondrion and is known to help cancer cells grow by inhibiting the production of ROS. On the contrary, it was also reported that the increased UCP2 expression inhibited the growth of cancer cells. As such, the role of UCP2 in cancer cells is still unclear. In Chapter 2 of this study, the correlation between UCP2 expression and apoptosis was studied. For this, liver cancer cells Hep3B and colon cancer cells HT-29 were used. UCP2 expression is suppressed in Hep3B cells and is expressed in HT-29 cells. These cells were treated with 5-azacytidine(5-aza) inducing DNA hypomethylation to observe changes in UCP2 expression and apoptosis. As a result of the experiment, the basal promoter activity of UCP2 was rather lower in HT-29 cells expressing UCP2 than in Hep3B cells. Treatment with 5-aza on both cancer cells increased apoptosis in both cells. At this time, UCP2 expression was found to increase in Hep3B and HT-29 cells. However, DNMT activity decreased, and DNMT1, 3a mRNA and protein expression were also decreased. Through methylation specific PCR(MSP) and bisulfite sequencing results, it was observed that certain regions of UCP2 promoter in Hep3B and HT-29 cells were methylated. The methylation in this region was investigated in 3 locations in Hep3B cells and 1 in HT-29 cells. In this study, inhibition of UCP2 expression in Hep3B cells is thought to be caused by multiple methylation of the promoter region. Stimulating Hep3B and HT-29 cells with 5-aza inhibits the DNMT activity and the expression of DNMT 1 and 3a, and UCP2 expression is thought to increase, inducing apoptosis. Studying the mechanisms of apoptosis in cancer cells plays an important role in cancer treatment. The results of this study proved that treatment of berberine on Hep3B cell can induce apoptosis by increasing the expression of p53. In addition, the treatment of 5-aza in Hep3B cells and HT-29 cells can increase the expression of UCP2 to induce apoptosis, which has been proven to be related to DNA demethylation in the UCP2 promoter region. In the future, further studies on the correlation between the expression of p53 and UCP2 genes with substances such as berberine and 5-aza and the induction of apoptosis in cancer cells are needed. I think the results of this study will provide important information in cancer treatment. DNA methylation은 단백질 발현에 영향을 주며 세포사를 유도하는 원인 중 하나로 알려져 있다. p53은 종양 억제 유전자로서 이 유전자의 불활성화는 DNA methyltransferases(DNMTs)의 발현과 관련이 있다. 본 연구 제 1장에서는 p53의 발현이 억제되어 있는 인간 간암 유래 세포인 Hep3B 세포에 berberine를 처리하여 세포사가 유도되는지 관찰하였다. 또한 세포사와 p53 발현, 그리고 DNMT 발현과의 상관성을 조사하였다. Berberine의 농도와 처리 시간이 증가함에 따라 Hep3B의 세포사도 증가하였다. 이때 DNMT activity는 감소하였고 DNMT3b mRNA와 단백질 발현도 감소되었다. DNMT3b 발현 감소와는 반대로 종양 억제 유전자인 p53의 발현은 증가하였다. 따라서 Hep3B 세포를 berberine으로 자극 시 DNMT의 활성과 DNMT3b의 발현이 억제되고 p53의 발현은 증가되어 세포사가 유도되는 것으로 여겨진다. 암세포가 성장하기 위해서는 reactive oxygen species(ROS)의 생성을 억제시키고 glucose를 소비해야 하는 것으로 알려져 있다. Uncoupling protein 2(UCP2)는 미토콘드리아 내막에 존재하는 단백질로 ROS의 생성을 억제시켜 암세포의 성장을 도와주는 것으로 알려져 있다. 그러나 이와는 반대로 UCP2의 발현 증가는 암세포의 성장을 억제한다는 결과들도 보고되고 있다. 이렇듯 암세포에서 UCP2의 역할에 관해서는 아직 불명확한 점들이 많다. 따라서 제 2장에서는 UCP2 유전자의 발현과 세포사 간의 상관관계를 조사하였다. 이를 위해서 인간 간암 세포 Hep3B와 대장암 세포 HT-29를 사용하였다. Hep3B세포에서 UCP2의 발현은 억제되어 있고 HT-29 세포에서 UCP2는 낮게 발현되고 있다. 이들 세포에 DNA hypomethylation을 유도하는 5-azacytidine(5-aza)을 처리하여 UCP2 발현과 세포사의 변화를 관찰한 바 UCP2의 basal promoter activity는 Hep3B 세포보다 UCP2가 더 많이 발현되는 HT-29 세포에서 오히려 낮게 나타났다. 두 암세포에 5-aza를 처리한 결과 두 세포의 세포사는 증가하였다. 이 때 Hep3B와 HT-29 세포에서 UCP2 발현은 증가하는 것으로 나타났다. 그러나 DNMT activity는 감소하였고 DNMT1, 3a mRNA와 단백질 발현도 감소하였다. Methylation specific PCR(MSP)와 bisulfite sequencing 결과를 통해 Hep3B와 HT-29 세포 내 UCP2 promoter의 일정 영역이 methylation 되어 있음이 관찰되었다. 이 영역에서 methylation정도는 Hep3B세포의 경우에서는 3곳, HT-29세포에서는 1곳으로 나타났다. 본 연구를 통해 Hep3B 세포에서 UCP2 발현의 억제는 promoter 영역의 다중 methylation에 의한 것으로 여겨지며 Hep3B와 HT-29세포를 5-aza으로 자극하면 DNMT의 활성과 DNMT 1, 3a의 발현이 억제되어 UCP2 발현이 증가되므로 세포 사멸이 유도되는 것으로 생각된다. 본 연구 결과를 통해 인간 간암 유래 세포인 Hep3B에 bererine의 처리는 종양 억제 유전자인 p53의 발현을 증가시켜 세포사를 유도할 수 있음이 증명되었다. 또한 Hep3B 세포와 인간 대장암 유래 세포인 HT-29에 5-aza의 처리는 UCP2의 발현을 증가시켜 세포사를 유도할 수 있고 이것은 UCP2 promoter 영역의 DNA demethylation과 관계가 있음이 증명되었다. 앞으로 암세포에서 berberine과 5-aza 등의 물질과 p53 및 UCP2 유전자의 발현과의 상호관계 그리고 세포사 유도에 대한 연구는 더 필요하다. 본 연구 결과는 암 치료에 있어 중요한 정보를 제공하는 계기가 되리라 생각한다.

TNF-α에 의한 HaCaT 세포의 Apoptosis에서 NF-κB의 역할

김소형 울산대학교 대학원 2000 국내석사

Apoptosis가 세포생물학의 주요주제로 떠오르면서 최근 TNF-α와 apoptosis와의 관계에 대한 많은 연구가 이루어지고 있다. 연구자는 변형된 각질형성세포인 HaCaT 세포를 대상으로 TNF-α 단독 투여만으로도 apoptosis가 일어나는가를 살펴보고 TNF-α에 의해 세포내에서 활성화되면서 apoptosis에 어떤 영향을 미친다고 알려진 NF-κB가 TNF-α에 의한 HaCaT 세포의 apoptosis에 있어 어떤 작용을 하는지를 밝히기 위해 실험을 실시하였다. 이를 위해 HaCaT 세포를 대상으로 TNF-α 단독 또는 전사억제물질인 cycloheximide를 함께 투여한 후 PI를 이용하며 apoptosis를 증명하였고 아울러 trypan blue를 이용한 세포수의 측정, LDH를 이용한 세포독성 검사를 실시하였다. TNF-α에 의한 NF-κB의 핵으로의 전위정도를 밝히기 위해 FACS를 실시하였으며 TNF-α와 함께 NF-κB 활성화 억제 물질인 PDTC와 Leu-Nor를 투여한 후 PI법과 LDH법을 실시하여 apoptosis와 세포독성 반응에 미치는 NF-κB의 영향을 살펴보았다. 연구결과는 다음과 같다. ① TNF-α를 4일까지 자극한 결과 HaCaT 세포의 세포독성 반응과 apoptosis가 나타났다. ② TNF-α와 함께 cycloheximide를 투여하였을 경우 24시간 배양시 apoptosis가 12배 이상 증가하였다. ③ TNF-α에 의해 24시간 후 1.61배 NF-κB의 핵으로의 전위가 증가하였다. ④ NF-κB를 억제하면 24시간째에 TNF-α에 의한 apoptosis 및 세포 독성 반응이 일부 억제되었다. 따라서 TNF-α는 HaCaT 세포에 작용하여 apoptosis를 포함한 세포 독성 반응을 일으키는데 이때 함께 활성화되는 NF-κB는 apoptosis 유발물질로 작용하는 것으로 생각된다. Recently, many researches about the relationship between TNF-α and apoptosis have been done. But there are only several reports about the effects of TNF-α on apoptosis and NF-κB, and their relationship with conflicting results. The goal of this experiment was whether TNF-α only caused apoptosis in HaCaT cells, a naturally transformed human keratinocytes and evoked nuclear translocation of NF-κB. And then, I tried to verify the relationship between apoptosis and NF-κB. In HaCaT cell line treated with TNF-α with/without cycloheximide, I performed propidium iodide FACS for the detection of apoptotic cells, cell number check using trypan blue, and LDH cytotoxicity assay. After doing FACS for nuclear translocation of NF-κB, Same experiment was done after the addition of PDTC and Leu-Nor, the inhibitors of NF-κB activation with TNF-α. The results are as follows; 1) TNF-α evoked apoptosis and cytotoxicity in HaCaT cells without any help. 2) The addition of cycloheximide markedly increased the percentage of apoptotic cells. 3) TNF-α caused nuclear translocation of NF-κB. 4) 24 hours after the inhibition of NF-κB with PDTC and Leu-Nor, apoptosis and cytotoxicity were partially inhibited. These results suggest that in HaCaT cells, TNF-α can induce cytotoxicity including apoptosis with no help and cause nuclear translocation of NF-κB which acts as a proapoptotic agent.

Induction of Apoptosis by Protein Kinase Inhibitors in the Prostate and Breast Cancer Cell Lines : 전립선암과 유방암세포주에서 protein kinase 억제제에 의한 apoptosis의 유도

박정순 부산대학교 대학원 1998 국내박사

Apoptosis는 배발생과 성장, 분화과정에서 주된 조절적 기작으로서 제공되는 생리학적 세포사의 기작중의 하나이다. 전통적인 PKC의 활성은 세포의 성장, 분화 그리고 유전자 발현과 같은 세포의 다양한 기능을 이끌어내는 신호전달 과정의 단계적 반응에서 가장 초기 과정중의 하나이다. 그리고 apoptosis는 항암화학치료와 방사선 치료시 나타나는 암세포사의 하나이다. 그러므로 우리는 항종양성인자에 속하는 RA와 protein kinase 억제제로 사용되는 H-7과 HA1004를 전립선 암세포와 유방암세포에 처리하였을 때 apoptosis를 유발할 수 있는지를 조사하였다. 전립선암과 유방암세포에서 PKC신호 전달과정의 개요는 억제제인 H-7와 PKC의 활성제인 TPA에 의해 조사되었다. 그리고 PKC 동위효소에 의한 특징은 western blot에 의해 확인되었다. 배양된 전립선암 세포와 유방암 세포에서는 H-7, HA1004, 그리고 RA의 처리에 의해 dose에 의존적인 방법으로 apoptosis를 일으켰다. 그러나, PMA는 전립선암세포에서는 H-7에 의해 유도된 apoptosis와 RA에 의해 유도된 apoptosis가 부분적으로나 일시적으로 억제되었으나, 유방암세포에서는 RA에 의해 유도된 apoptosis에는 억제하지 않았다. 그러므로 우리는 RA가 처리되었을 때 apoptosis는 간접적으로 전립선암세포에서 PKC와의 어떤 연관성을 제안할 수 있었다. PKC의 억제제와 활성제 각각에 대한 다른 반응들은 많은 다른 PKC의 isozyme와 연관되어 있다. 그러므로 우리는 이들의 isozyme들이 이전에 apoptosis를 유발한 농도로 처리했을 때 어떻게 변화 되어지는지를 관찰하여 apoptosis와 PKC signaling 과정에서 중요한 isozyme의 관련성을 알아보고자 하였다. 그 결과 PKCα는 고려할만한 발현의 변화를 나타내었지만 같은 classic PKC isozyme에 속하는 PKCβ와 γ는 그 발현을 찾아 볼 수 조차 없었다. 그런데 반해 다른 PKC의 그룹에 속하는 PKC δ, ε, ζ, λ와 μ는 많은 발현의 변화를 보여 주었으며 특히 많은 문헌에서 apoptosis에 관여 하는 것으로 알려진 PKCδ와 ε에서 많은 변화를 보여주었다. 이상의 결과로서, 우리는 H-7, HA1004, 그리고 RA가 사람의 전립선 암세포와 유방암 세포주에서 적절한 농도에서 apoptosis를 유발하며, 이렇게 유발된 apoptosis는 PKC의 isozyme에 의해 직접 또는 간접으로 조절되어진다는 것을 알 수 있었다. 특히 이들 isozyme 들중에서도 calcium에 독립적으로 조절되는 것들과 atypical isozymes이 더 많이 작용할 것으로 사료된다. Apoptosis is one of the key mechanisms of physiological cell death as a major controlling mechanisms in the embryo developments, growth, and differentiation. Apoptosis is accompanied by the formation of apoptotic bodies and DNA ladder. The activation of protein kinase C (PKC) is one of the earliest event in the cascades of signal transduction pathway inducing a various cellular functions such as cell growth, differentiation, and gene expression. Apoptosis is induced by chemotherapy and inonizing radiation therapy of cancer cell. In this study, it was examined whether human prostate cell (PC-3 and DU145), and human breast cancer cell (MCF-7, MDA-MB-231, MCF/DOX), undergo apoptosis by treatment with the protein kinase inhibitors, H-7 and HA1004, and antineoplastic reagent, RA, and a tumor promoting factor, PMA. Apoptosis of these cells were dose-dependently induced by treatment with H-7, HA1004, or RA. PMA inhibited apoptosis of cells treated with H-7 or HA1004, whereas it didn't inhibit apoptosis of cells treated with RA. It has been known that the various responses of inhibitor and activator of PKC were related with a diverse isozymes of PKC. Therefore, PKC isozymes during the apoptosis of these cells in the presence of PKC activator and inhibitor were examined by using Western blot. The amount of PKCβ and γ, classic PKC isozyme family, couldn't be detected. The amount of PKCα appeared a little altered. On the other hand, PKCδ, ε, ζ, λ(ι), and μ, calcium-independent PKC family, appeared changed in their amounts. Pattern of PKCδ, ε, and ζwere consistent with the results reported previously elsewhere. In sum, the apoptosis of human prostate cancer cell and breast cancer cell lines was induced when treated with appropriate concentration of H-7, HA1004, and RA. These results suggest that the induction of apoptosis may be directly and/or indirectly regulated by PKC isozymes. It appears that the apoptosis in prostate and breast cell lines is related especially with calcium-independent isozymes and atypical isozymes rather than other PKC isozymes.

Studies on the molecular mechanism of radiation-mediated RhoB induction leading apoptosis in human T lymphocytic leukemia cells

Jiwon Ahn 충남대학교 대학원 2012 국내박사

Apoptosis or programmed cell death is a regulatory mechanism in eliminating unwanted cells during embryogenesis, growth, differentiation, and normal tissue homeostasis. Radiation induces DNA damage in various cell types and radiation-induced DNA damage could trigger apoptosis. The Ras-related small GTP-binding protein RhoB is known to be a pro-apoptotic protein and immediate-early induced in genotoxic stresses such as radiations. In addition, MAP kinases are known to function in radiation-induced apoptosis. However, it is unclear which pathway is related in gamma-radiation or UV radiation-mediated RhoB induction. Here I verified the relationship between MAPK pathway activation and RhoB induction leading apoptosis in irradiated human T lymphocytic leukemia cells (Jurkat T cells). I show that RhoB expression by gamma-radiation increased at the transcriptional and translational level. In gamma-irradiated Jurkat T cells, RhoB expression increased and the gamma-radiation-induced RhoB expression was markedly attenuated by pretreatment with a JNK-specific inhibitor, SP600125, but not by a p38 MAPK inhibitor, SB203580. Inhibition of JNK activity decreased early apoptotic cell death that was correlated with RhoB expression. However, PI3K inhibition had no significant effects, which was also not involved in AKT signaling pathway. The knockdown of JNK using siRNA decreased RhoB expression and the knockdown of RhoB using siRNA restored cell growth, even in the gamma-irradiated Jurkat T cells. These results suggest that the transcriptional and translational level of RhoB are regulated via JNK pathway and contributes to the early apoptotic response of Jurkat T cells to gamma-radiation. In UV-irradiated Jurkat T cells, RhoB expression was also rapidly induced and was regulated by p38 MAPK pathway unlike gamma-radiation. In addition, UV-induced RhoB expression and apoptosis were markedly attenuated apoptosis by pretreatment with the p38 MAPK inhibitor. The gene silences of RhoB, ATF2 and c-Jun using siRNA resulted in decreased RhoB expression and eventually restored the cell growth in UV-irradiated Jurkat T cells. The RhoB promoter assays suggest that inhibition of RhoB promoter activity by the p38 inhibitor and knockdown of c-Jun using siRNA occurred through the distal CCAAT box. Immunoprecipitation and DNA affinity protein binding assays with nuclear fraction of the UV-irradiated or not Jurkat T cells revealed that UV-induced RhoB expression results from the binding of activating transcription factor 2 (ATF2), c-Jun, and p300 via NF-Y to the CCAAT boxes of the RhoB promoter. And the histone deacetylase 1 (HDAC1) was dissociated via c-Jun recruitment to the CCAAT. These results suggest that p38 MAPK pathway involves in UV-induced RhoB expression and the RhoB expression is regulated by recruiting the c-Jun and p300 proteins to the distal CCAAT box of the RhoB promoter in Jurkat T cells. 세포사멸이란 발생, 성장, 분화 및 정상조직의 항상성 유지를 위해 손상을 입어 생존에 부적합해진 세포를 제거하는 생체 내 조절 기작 중 하나이다. 이러한 세포사멸을 일으키는 원인 중 하나가 방사선이다. 방사선에 의해 DNA가 손상되고, 그 손상이 회복되지 않을 때 세포는 세포사멸 과정을 거치게 된다. 상사선 유래 세포사멸기전에 대해 다양한 기전이 밝혀져 있고, 특히 MAP kinase과의 상관성이 잘 알려져 있다. 본 논문에서는 방사선 처리시 변화를 보이는 새로운 유전자를 탐색하기 위하여 먼저 인간의 혈액으로부터 정상 림프구를 분리하여 방사선을 조사하고 유전자 변이를 마이크로어레이를 통하여 분석하였다. 방사선 처리에 의해 증감을 보이는, 선별된 유전자 중 세포사멸과 밀접한 관련성이 있으나 방사선 유래 세포사멸과의 상관성이나 명확한 기전이 알려져 있지 않은 RhoB 유전자를 우선 선별하여 그 상관성과 기전을 연구하였다. 후속 기전연구는 방사선 치료시 문제가 발생할 수 있는 대표적인 세포인 인간의 T 림프성 백혈병 세포 (Jurkat T cell)를 이용하였고, 방사선 종류로는 감마선과 자외선을 사용하여 기전을 비교 분석하였다. Jurkat T 세포에서 RhoB의 mRNA 및 단백질발현의 증가는 감마선과 자외선에서 동일하게 나타났으나 약리학적 신호전달 저해제 연구를 통하여 감마선의 경우, JNK 저해제인 SP600125를 처리하였을 때 RhoB 유전자 발현과 세포사멸이 감소하였고, p38 MAPK 저해제인 SB203580은 영향을 주지 않은 반면, 자외선의 경우, p38 MAPK 경로가 세포사멸과 RhoB 발현에 유의성 있는 영향을 보이지만 JNK는 오히려 세포의 사멸과 RhoB 발현을 더 악화시키는 것으로 관찰하였다. 그러나 PI3K의 억제는 RhoB의 발현에 영향을 주지 않았으며, 이는 방사선에 의한 RhoB의 발현 및 세포사멸이 Akt 신호전달과는 관련 없다는 것을 의미한다. siRNA를 이용한 JNK knockdown은 감마선 조사에 의해 증가되는 RhoB 발현을 저해하여 세포사멸을 억제하였고, RhoB의 직접적인 knockdown 실험에서도 감마선에 의한 세포사멸이 억제됨을 확인할 수 있었다. 이 결과는 감마선에 조사된 Jurkat T 세포에서 감마선에 의해 유도되는 RhoB의 발현증가가 JNK 경로에 의해 조절된다는 것을 의미한다. 자외선에 의한 RhoB 발현증가 경로를 조사하기 위하여 마찬가지로 RhoB와 p38 MAPK의 표적전사인자인 ATF2, c-Jun을 siRNA를 이용하여 knockdown하였다. 자외선에 의한 세포사멸이 ATF2, c-Jun 전사인자를 통한 RhoB 발현증가로 이루어지리라 추정할 수 있었다. 이 결과는 RhoB 프로모터 리포터 실험을 통하여 재증명하였다. 그 프로모터에 존재하는 CCAAT box가 자외선에 의한 RhoB 증가에 관여함을 확인하였고, 그 자외선에 의해 유도되는 프로모터의 활성이 p38 저해제와 c-Jun knockdown에 의해 감소함을 볼 때 자외선에 의한 RhoB 발현은 p38-ATF2/c-Jun-RhoB로 연결되는 경로에 의해 유도된다는 것을 확인할 수 있었다. 마지막으로 이 들 전사인자들이 RhoB 프로모터상에 결합하는지를 조사하기 위해 자외선으로 조사되었거나 조사되지 않은 Jurkat T 세포의 핵단백질을 이용하여 면역침강과 DNA 친화 단백질 결합 반응을 수행하였다. 그 결과, 자외선에 의한 RohB의 발현은 전사인자인 ATF2와 c-Jun, 그리고 cofactor인 p300이 RhoB 프로모터의 CCAAT box에 결합함으로 조절된다는 것을 증명하였다. 또한 histone deacetylase 1 (HDAC1) 단백질이 c-Jun와 경쟁적으로 RhoB 프로머터에 결합하고, 자외선 조사 시 c-Jun이 결합함으로써 HDAC1이 떨어져 나간다는 사실을 확인하였다. 결론적으로, Jurkat T 세포에서, 방사선에 의한 RhoB의 발현은 JNK 또는 p38 MAPK에 의해 조절되며, 구체적으로는 그 표적전사인자인 ATF2와 c-Jun이 RhoB 프로모터의 CCAAT box에 결합되어 있는 HDAC1을 해리시키고 경쟁적으로 결합함으로써 RhoB 발현을 유도하여 이 과정이 histone acetyltransferases (HAT) 활성을 가지는 cofactor p300이 관여한다는 것을 확인하였다.

젖소 난소의 체외배양에 의한 APOPTOSIS의 관찰

황석주 강원대학교 2008 국내석사

도축된 젖소 난소의 체외배양 후 난소 내 세포들의 기능 유지 시간과 기능 연장 가능성을 찾아보고자 젖소 난소를 5% CO₂incubator 단독 혹은 5% O₂incubator와 혼합 공급, 체외배양 온도조절(25℃, 39℃), 체외배양 시간(3, 6, 10, 30 시간), 배양액의 선택(TCM-199 혹은 HAMS F-12)에 의한 난소 체외 배양법의 조직학 분석을 위해 H & E (핵과 세포질 염색), TUNEL 염색(세포의 생사 판정)법으로 Apoptosis와 Necrosis 현상을 비교, 관찰하였다. 미배양 젖소 난소 Apoptosis (76%), Necrosis (10%) 수준으로 난소 내의 세포가 구성되어 있다. 실험 1의 배양 1 방법으로 난소를 체외 배양 한 바, 배양 30시간과 마찬가지로 Apoptosis 현상보다는 Necrosis 실험 1의 (배양 1: 82%, 배양 2: 88% ) 현상이 매우 빠르게 진행되었다. 실험 2의 배양 1 방법의 세포상태는 Apoptosis 71%로 미배양 난소 Apoptosis 수준과 통계적 유의차(P<0.05)가 거의 없는 수준으로 세포의 상태가 관찰되었다. 본 배양조건에서는 산소와 이산화탄소가 각각 5% 수준으로 혼합 공급, 배양하면서 배양시간이 3시간으로 단축된 경우가 세포의 기능유지 관찰에서 미배양 난소(X1,000, TUNEL)와 비슷한 경향을 보였다. 대조적으로 같은 배양 조건이지만 배양시간이 6시간으로 길어진 실험 2의 배양 2 의 경우는 Necrosis 상태라고 판단할 수 있는 비율이 83% 수준으로 세포 기능유지에는 불리한 결과를 보였다. 실험 3의 배양 1과 2 방법은 배양온도를 25℃ 조절하고 O₂ 5% + CO₂ 5% 혼합가스 공급 incubator에서 HAMS F-12로 난소 내 순환 3시간 및 6시간 배양액을 순환한 결과 세포상태의 변화에서는 실험3의 배양 1 방법에서는 Apoptosis : 81%, 실험 3의 배양 2에서는 Apoptosis : 80%로 미배양 난소 수준과 통계적 유의차 (P<0.05)가 거의 없는 수준으로 세포의 상태가 유지되는 것으로 관찰되었다. Programmed cell death and proliferation are evolutionary conserved processes that play a major role during normal development and homeostasis. In the ovary, during the a estrous cycle, they might determine oocyte size and fertility potential. In the present study, the number of ovary's internal cells in Apoptosis and Necrosis in follicular stage ovaries in milk cow were measured. Ovaries were collected at slaughter-house. They were selected a middle follicular stage ovaries(n = 88). Apoptosis was detected in 4 μm tissue sections using a modified terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end - labeling assay(TUNEL) and Hematoxylin and Eosin stain method. Evaluation of apoptosis was confirmed by estimation of number by stained cell colour. Percent (±SD) of apoptosis cell numbers were 76.0 ± 10.0, 4.0 ± 2.0, 1.0 ± 2.0, 71.0 ± 9.0, 8.0 ± 9.0, 81.0 ± 9.0 and 80.0 ± 6.0 in Control(no-culture ovary), experiment 1, (culture 1 and culture 2), experiment 2(culture 1 and culture 2), experiment 3 (culture 1 and culture 2), respectively. The number of apoptosis cells of experiment 1 (culture 1 and culture 2) and experiment 2 (culture 2) were a significantly different between different culture method and no-culture ovary (P<0.05). apoptosis cells of experiment 2 (culture 1), experiment 3 (culture 1 and culture 2) were similar between different culture method and no-culture ovary (P<0.05). It is concluded that, in normal ovary, there is a vigorous growth of the ovary cells during the estrous cycle period during normal condition of reproduction cows.

Identification of deubiquitinase involved in the regulation of apoptosis through DUB siRNA library screening

김진수 성균관대학교 일반대학원 2021 국내석사

Apoptosis, one of 3 prevalent cell death mechanisms including ‘apoptosis’, ‘autophagic cell death’, and ’necroptosis’, is an essential self-killing method for a multicellular organism to maintain homeostasis during development and aging. However, defects in the mechanism often result in abnormal cell survival and might induce cancer cell malignancy. This indicates that researching Apoptosis has been regarded to have huge clinical potential. Although some deubiquitinases have been suggested to be an important factor regulating Apoptosis, not every deubiquitinase have been researched in terms of apoptosis. Throughout human deubiquitinase siRNA library screening, this study identified that under TRAIL/Apo2L stimulation, silencing UBL5 led to a decrease of cell viability and an increase of death marker protein expression (e.g. cleaved caspase –3/ -8, and cleaved PARP-1). In contrast, silencing USP26, and USP46 each induced an increase of cell viability and a decrease of the death marker protein expression. This shows UBL5 is an anti-apoptotic deubiquitinase, while USP26 and USP46 are pro-apoptotic deubiquitinases regulating extrinsic apoptosis. On the other hand, I couldn’t find any noble deubiquitinases regulating intrinsic apoptosis. Since UBL5, USP26, and USP46 have never been studied in terms of regulating extrinsic apoptosis, this finding gives us an insight into noble deubiquitinases regulating apoptosis. '세포 자살(Apotosis)'는 유도 경로에 따라 '외인적 세포 자살'과 '내인적 세포 자살'로 구분된다. '외인적 세포 자살'은 세포 사멸 단백질 리간드 (FasL, TRAIL, TNF alpha 등)와 결합한 세포 사멸 수용체(Fas/CD95, TRAIL-R, TNFR1/2)에 Adaptor 단백질(FADD, TRADD) 과 Procaspase - 8 이 순차적으로 결합한 형태인 DISC (Death-Inducing Signaling Complex) 복합체를 통해 시작된다. Procaspase - 8 은 '자가 단백질 분해 효소 활성'을 가져 스스로를 절단하며 활성화된다. 그 활성으로 Procaspase - 3와 Caspase 기질 단백질인 PARP-1이 차례로 절단 및 활성화되며 세포 내 유전적 불안정성을 높여 궁극적으로 세포 자살이 일어난다. 한편, '내인적 세포 자살'은 자외선, ER Stress 등을 통한 DNA 손상에 의해 일어난다. 이는 '세포 자살 촉진 인자' 인 Bcl-2 계열 단백질 (BAX, BAK 등)의 미토콘드리아 외막 주변 분포를 유도해 '미토콘드리아 외막 투과성 (MOMP)'을 증가시킨다. 이로인해, 미토콘드리아 내막에 존재하던 Cytochrome C가 세포질로 반출되어 APAF1, dATP와 결합해 Apoptosome을 형성한다. Apoptosome은 단백질 분해 효소 활성을 가져 Procaspase - 9을 절단 및 활성화시킨다. Cleaved Caspase -9 은 Caspase -8과 마찬가지로 Procaspase -3와 그 기질 단백질인 PARP-1의 연쇄적 절단 및 활성화를 유도해 세포 사멸을 만든다. 현재까지, '세포 자살'에 관여하는 탈유비퀴틴화 효소에 관한 연구가 다수 진행되었지만, 여전히 이에 관해 전혀 밝혀진 바 없는 탈유비퀴틴화 효소가 다수 존재한다. 따라서 본 연구는 '세포 자살'에 관여하는 새로운 탈유비퀴틴화 효소의 동정 및 기능 탐구를 위해 인간 세포에 존재하는 것으로 알려진 99 개의 탈유비퀴틴화 효소에 대한 siRNA library 스크리닝을 진행했다. Immunoblotting 과 Cell Viability Test 등을 이용한 3번의 독립적인 스크리닝 실험과 세포 자살 및 탈유비퀴틴화 효소에 관한 현재까지의 보고를 종합적으로 검토한 결과, 세포 자살과의 관계성이 전혀 밝혀지지 않은 3종의 탈유비퀴틴화효소 UBL5, USP26, 그리고 USP46를 동정해냈다. UBL5 를 Knockdown 시킨 뒤, TRAIL/Apo2L 을 250ng/ml의 농도로 1시간 처리해 '외인적 세포 자실'을 유도한 경우, 세포 생존도가 control siRNA 보다 감소했다. 또, Cleaved Caspase -3 / -8, Cleabved PARP -1 단백질의 발현이 증가했다. 반면, USP26 과 USP46을 각각 Knockdown한 경우, UBL5와는 정반대의 결과를 얻음으로 UBL5는 세포 자살을 억제하는 탈유비퀴틴화 효소이며, USP26 과 USP 46 은 세포 자살 촉진 탈유비퀴틴화 효소임을 알 수 있었다. 3개의 서로 다른 탈유비퀴틴화 효소가 Apoptosis에 관여하는 유전자 발현에 영향을 미치는지를 알아보기 위해 UBL5, USP26, 그리고 USP46을 각각 Knockdown 한 뒤, TRAIL/Apo2L을 250ng/ml의 농도로 1시간 처리해 '외인적 세포 자살'을 유도했다. 세포 자살 관여 단백질 (e.g. 세포 자살 촉진 인자 -BCL2A1, BAX, BIM, 세포 자살 억제 단백질 - Bcl-2, Bcl-xL)의 발현을 확인하였지만, 각각의 Deubiquitinase가 Knockdown된 상황에서 그 발현에 큰 차이는 보이지 않았다. 나아가서, 각각의 탈유비퀴틴화효소가 DISC 복합체 구성 단백질에 어떤 영향을 미치는지 확인해 보았다. 그 결과, USP26 과 USP46을 각각 Knockdown 시켰을 때, DR5의 단백질 안정성이 감소함을 확인할 수 있었다. 이로서, 본 연구는 UBL5, USP26, 그리고 USP46이 외인적 세포 자살에 관여하는 새로운 탈유비퀴틴화 효소라는 사실을 밝힌다.