大腸菌의 구리이온에 유도되는 새로운 two component system 糾明

박선영 成均館大學校 大學院 2002 국내석사

In the course of our study to understand physiological role and action mechanisms of polyamine in Escherichia coli, we recently found that deficiency in polyamine biosynthesis renders hypersensitivity to copper. The copper sensitivity caused by absence of endogenous polyamine was effectively suppressed by exogenous polyamine supplement in the medium, suggesting that a possible role of polyamine in the cellular defense mechanism to the copper ion. As an effort to elucidate the role of polyamine in the defense mechanism to the metal ion, we have conducted this study and results obtained were summarized as below. Copper resistance mechanism is relatively well studied in Psuedomonas syringae, where several genes involved in copper uptake system are consisted of an cop operon. These cop operon is know to be regulated by copRS two component system. We conducted homology search of E. coli chromosome and found that yedVW are homologous to copRS of Psudomonas syringae. The amino acid sequence of yedV shares strong similarity to copS, the sensor of copRS two component system in P. syringae. The yedV contains sequences of transmembrane domaim, histidine kinase domain, and phosphatase domain which are conserved in sensor proteins of two component system in prokaryotic cells. The yedW contains conserved sequence of receiver domain and transcription regulator domain of a regulator protein in two component system, and shares strong sequence homoloy to copR. The sequence analysis of yedVW predicted that these genes encoding a sensor (yedV) and a regulator (yedW) of a hitherto unidentified two component regulatory system involved in copper metabolism in Escherichia coli. The putative sensor (yedV) and regulator (yedW) of the two component were overexpressed and purified for further biochemical characterization. Both YedV and YedW were confirmed to be phosphorylated in vivo. YedV was demonstrated to have ATP-dependent autophosphorylation activity. Putative regulator YedW was specifically phosphorylated by phosphorylated YedV demonstrated by transphosphorylation assay. The phosphorylated YedV was demonstrated to bind specifically to the 260 bp probe containing promoter upstream of copA, encoding copper efflux protein of E. coli. Expression of yedW was demonstrated to be inducible by copper in the growth medium by Western immunoblot assay. This yedVW induction by copper were also demonstrated by yedV::lacZ operon fusion. Taken together, it was concluded that the E. coli homologes of copper responsive P. syringaes copRS, yedVW is a novel two component system functioning in response to copper in the environment. Polyamines, both putrescine and spermidine were found to enhance yedV::lacZ expression and YedW synthesis, suggesting that polyamine may play an important role in copper resistance through the newly identified yedVW two component system in E. coli.

Structural and functional studies of the sensing domains of bacterial two-component system sensor histidine kinases

KIM DINH TRUNG TRUC 성균관대학교 일반대학원 2014 국내박사

박테리아의 두 요소 신호 전달 시스템은 주변 환경의 상황 적응에 이용된다. 자극에 의해 생성된 신호는 단일 방향으로 센서 히스티딘 키나아제에서 반응 조절자를 거쳐 하위 유전자 발현을 통하여 적합한 반응 생성으로 연결된다. 박테리아 두 요소 신호 시스템의 기능은 다양하며, 특히 병원성 세균의 독성과 생존에 중요하다는 점에서 새로운 항균제 개발의 타겟으로 높은 가능성을 보인다. 병원성 그람 양성인 황색포도상구균에서 YycFG 시스템은 생존에 필수요소이며, SrrAB 시스템은 광범위한 병독성의 조절 인자로 여겨진다. 본 학위논문은 히스티틴 센서 키나아제인 YycG와 SrrB 의 세포외 도메인의 구조를 단백질 결정을 통한 X선 회절분석 실험을 이용하여 각각 2.07 Å 와 1.73 Å 해상도로 규명하였다. 이들의 구조를 기반으로 돌연변이를 이용한 기능분석을 통해 센서를 자극하는 외부신호와 함께 활성화 메커니즘을 제시하였다. 두 단백질의 원자 수준의 구조는 항 황색포도상구균 신약 개발의 플렛폼으로 이용 가능할 것이다. Pseudomonas putida 는 화학수용체인 NahY을 통해 나프탈렌을 인식 및 이동하여 분해과정을 거쳐 에너지원으로 사용한다. 본 학위논문은 NahY의 주변세포질에 위치한 인식 도메인의 결정구조를 1.79 Å 해상도에서 밝혔다. 또한 생화학적 및 돌연변이를 통한 리간드 결합 부분을 제시하였으며 이는 NahY가 암모니아 화학수용체로부터 진화되어 발전한 것으로 판단된다. 제시된 단백질의 구조는 이를 변형한 새로운 화학수용체 개발로 생명체 기반의 환경 개선 및 복구의 발판으로 응용될 수 있다. Two-component signal transduction systems are utilized by bacteria to adapt to the oscillations in the surrounding environment. The signals generated by the stimuli are linearly transduced from the sensor histidine kinases via the response regulators to the DNA to create appropriate responses. The biological functions of bacterial two-component systems are diverse. Because of the important roles of bacterial two-component systems in virulence and survivals of pathogenic bacteria, they were considered as the promising targets for novel antimicrobial drug developments. In Staphylococcus aureus, a pathogenic Gram-positive bacteria, YycFG two-component system is essential for the cell survival, while SrrAB two-component system is considered as a global regulator of virulence factors. In this dissertation, the crystal structures of the extracellular domains of sensor histidine kinases YycG and SrrB are reported at 2.07 Å and 1.73 Å resolutions, respectively. From structural information, subsequent mutational and functional analyses suggested the activation mechanisms as well as the signals of sensor histidine kinases YycG and SrrB. The availabilities of these atomic structures will supply the platforms for the development of novel drugs against S. aureus. In naphthalene-degrading Pseudomonas putida, NahY is a chemoreceptor responsible for the movement of bacteria toward naphthalene. In this dissertation, the crystal structure of the periplasmic sensing domain of NahY was determined at 1.79 Å resolution. Subsequent biochemical and mutational analyses suggested the ligand-binding pocket of NahY. Sequence alignment and phylogenetic analyses proposed that NahY might be evolved from an ammonium chemoreceptor. The availabilities of this atomic structure will supply the platforms for the design of novel chemoreceptors applied in bioremediation.

Multifunctional Roles of GluS-GluR Two-Component Regulatory System in Burkholderia glumae

마룬가 서울대학교 대학원 2021 국내박사

Burkholderia glumae는 다양한 미생물 유기체들이 어떻게 다양한 환경에서 진화, 적응하는지에 대한 통찰력을 제공하는 다양한 생물학적 기능 시스템들을 가지고 있다. 이러한 시스템들에 대한 일부의 복잡성에도 불구하고 본 연구는 일반적인 세균에서의 정보처리 흐름의 기초적 역할을 담당하는 two-component regulatory systems (TCS)의 패러다임을 제시하고자 한다. mini-Tn5를 사용한 B. glumae BGR1의 mini-Tn5 무작위 돌연변이 유도체 중 하나는 Luria–Bertani (LB) 배지에서 필라멘트 모양의 세포형태로 발견되었다. 이 돌연변이 유도체에 대한 분자 및 유전적 분석은 이것이 two-component regulatory systems 반응 조절 유전자인 gluR (BGLU 1G13360)에 mini-Tn5 삽입 돌연변이를 가지고 있음을 밝혔다. 이 gluR 의 전사방향 아래에서 TCS 감지-인산화효소인 gluS (BGLU 1G13350)가 발견되어 B. glumae BGR1의 GluS-GluR TCS 의 기능과 역할을 추적할 수 있게 되었다. gluR 돌연변이는 LB 배지에서 필라멘트 세포를 형성한 gluS 돌연변이와 달리 42C에 민감하며, 세포 분열 및 세포벽 (dcw) 생합성을 담당하는 유전자들의 발현을 wild type에 비해 증가되었기에 GluR을 세포 분열의 필수 조절 인자로 파악하였다. TCS는 감지-인산화효소가 환경 신호를 감지하여 반응 조절기에 전달하여 적절한 세포 반응을 유도하는 체계적인 시스템을 통해 다양한 세균 활동을 조절한다. 이 연구에선 B. glumae에서 GluR이 세포 분열을 시작하는 외부 신호로 감지하는 것을 글루타민과 글루타메이트로 확인했다. 또한, GluR은 담배 잎에서 과민성 반응의 유도와, 숙주인 벼에서의 완전한 독성발현 및 식물의 방어기작인 과산화수소의 해독을 위해 필요했다. 이 모든 것은 B. glumae의 병원성, 생존 및 환경적응의 중요한 요소들에 GluR이 관여하는 것이다. GluR은 III 형 분비 시스템 및 망간 항산화효소 유전자 katM과 직접 상호 작용하여 병원균의 독성 및 병원성을 촉진한다. 이 연구에서는 GluS-GluR이 B. glumae의 β- 락탐 항생제 내성을 조절하는 것에 기능적으로 연결되어 있으나, 서로 구별되는 메커니즘을 통해 항생제 내성이 만들어짐을 추가로 보여주었다. gluS 또는 gluR의 비활성화는 β-lactam 항생제에 대한 내성을 부여한 반면, wild type은 이러한 항생제에 민감하였다. 이러한 표현형은 wild type에 비해 TCS 돌연변이체에서 β-락탐 분해효소 및 페니실린 결합 단백질을 코딩하는 유전자들의 발현이 현저하게 증가된 것에 뒷받침된다. 전반적으로, 본 연구는 TCS가 세균의 정교한 조절 시스템에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 이해를 더하고, 항생제 내성 반응에 대한 새로운 관점을 제공하며, 병원성 세균의 성공적인 제어를 위한 새로운 치료 방법을 제공 할 수 있다. Burkholderia glumae, just like any other microorganism, has a variety of adaptable biological systems that provide insight into how these organisms evolve, adapt, and function in a variety of environments. Despite the complexity of some of these systems, this work sheds light on the two-component regulatory systems (TCSs) paradigm, which serves as the basis for information flow throughout bacteria. Random mutagenesis of B. glumae BGR1 with mini-Tn5 resulted in a cell filamentation in Luria–Bertani (LB) medium in one of the mini-Tn5 derivatives. Molecular and genetic analysis revealed that gluR (BGLU 1G13360), a two-component system response regulator gene, carried the mini-Tn5 insertional mutation. A putative sensor kinase, gluS (BGLU 1G13350), was found downstream of gluR, prompting an exploratory study of the GluS-GluR TCS functional roles in B. glumae BGR1. The gluR mutant, unlike the gluS mutant formed filamentous cells in LB medium, was sensitive to 42C, and the expression of genes responsible for cell division and cell-wall (dcw) biosynthesis were elevated at transcription levels compared to the wild type, classifying GluR as an essential regulatory factor for cell division. TCSs regulate a variety of bacterial activities via an organized system in which the sensor kinase passes environmental cues to the response regulator, which decodes an appropriate cellular response. Accordingly, this study identified glutamine and glutamate as extrinsic cues that initiate cell division in B. glumae via GluR. Notably, GluR, and not GluS was also required for elicitation of the hypersensitive response in tobacco leaves, full virulence in host rice plants, and detoxification of hydrogen peroxide; all of which are important factors in the pathogenicity, survival, and fitness of B. glumae. GluR directly interacts with the type III secretion system and a manganese catalase gene katM to promote virulence and fitness of the pathogen. This study further showed that GluS-GluR is a functional TCS pair regulating β – lactam antibiotic resistance of B. glumae, but through a distinct mechanism. The inactivation of gluS or gluR conferred resistance against β-lactam antibiotics, whereas the wild type was susceptible to those antibiotics. This phenotype was supported by the significantly increased expression of genes encoding metallo-β-lactamases and penicillin-binding proteins in the TCS mutants compared to those in the wild type. Overall, this study adds to our understanding of how TCSs affect bacteria's sophisticated molecular systems, gives a new perspective on antibiotic resistance processes, and may provide a novel therapeutic approach for the successful control of bacterial pathogens.

Crosstalk of the MprBA Two-Component System with the KdpDE Two-Component System in Regulating the SigE-SigB Signaling Pathway in Mycobacterium smegmatis

Kim, Yun Kyung 부산대학교 대학원 2026 국내석사

Mycobacterium smegmatis에서 MprB histidine kinase (HK)와 MprA response regulator (RR)로 구성된 MprBA two-component system (TCS)은 MprBA-SigESigB 경로를 통해 스트레스 반응에서 중심적인 역할을 수행한다. 이전 연구에서는 MprBA TCS가 저산소, 높은 이온 강도, 말단 산화효소 억제와 같은 호흡 억제 조건 및 산성 조건에서 활성화됨이 보고되었다. 본 연구에서는 MprBA TCS와 KdpDE TCS 간에 crosstalk이 발생함을 확인하였다. 우리는 ΔmprB mutant에서 MprA 인산화의 결과로 sigE 발현이 증가함을 발견하였다. 이 결과는 MprB 이외의 HK가 MprA를 인 산화할 수 있으며, MprB는 주로 MprA를 탈인산화하는 인산분해효소로 기능함을 시사 한다. 주목할 만하게, ΔmprB single mutant에 비해 ΔmprBΔkdpD double mutant에서 sigE 발현이 현저히 감소하여, KdpDE TCS의 HK인 KdpD가 MprA의 대체 HK로 작 용할 가능성이 있음이 제시되었다. 종합하면, 본 연구는 MprBA TCS의 스트레스 반응 활성화에 대한 새로운 통찰을 제공하며, MprBA와 KdpDE TCS 간의 잠재적 crosstalk 을 제시한다. The MprBA two-component system (TCS), composed of the histidine kinase MprB and the response regulator MprA, plays a central role in stress responses via the MprBA-SigE-SigB pathway in Mycobacterium smegmatis. A previous study has shown that the MprBA TCS is activated under conditions that inhibit respiration (hypoxia, high ionic strength, and inhibition of terminal oxidases) and acidic conditions. In this study, I found that the MprBA TCS exhibits crosstalk with the KdpDE TCS in M. smegmatis. I found that sigE expression was elevated in the ΔmprB mutant as a consequence of MprA phosphorylation. This result suggests that a histidine kinase other than MprB is present to phosphorylate MprA, and that MprB appears to serve predominantly as a phosphatase for MprA. Notably, sigE expression was abolished in the ΔmprBΔkdpD double mutant compared with the ΔmprB single mutant, suggesting that KdpD, the histidine kinase of the KdpDE TCS, may function as an alternative kinase for MprA. Altogether, this study provides new insight into the stress- responsive activation of the MprBA TCS and suggests potential crosstalk between the MprBA and KdpDE TCSs.

Mycobacteria내의 two-component system을 구성하는 histidine kinase와 response regulator 간의 단백질 상호작용

이하나 부산대학교 2012 국내석사

The two-component system (TCS) consists of a histidine kinase (HK) and a response regulator (RR). Commonly, they demand specific interactions between the two components for signaling. Cross-interactions between some non-cognate partners have been founded as well. Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have the DosS/T/R and DevS/R systems as homologous TCSs, respectively. We constructed the map of the protein-protein interactions between the components of the TCSs in M. tuberculosis using the yeast two-hybrid assay. Interestingly, DosS and DosT HKs differ in their abilities to recognize the non-cognate RR, NarL although they have high similarity in their primary structures and share a common RR, DosR. In this study, we demonstrated that the dimerization and histidine phosphotransfer (DHp) domains of DosS and DosT were sufficient to confer their specificity. To ascertain where these differences of the cross-interactions result from, the subdomain-swapping test with DHp domains of DosS and DosT was performed. The results showed that the different cross-interaction capabilities of DosS and DosT were determined by the α2-helix portion of the DHp domains. Moreover, we observed that DevS-DevR interactions were affected by the mutations at Asp-54 and Lys-104 of the DevR RR, indicating that the two amino acids involving phosphorylation of a RR, contribute to protein interactions between DevS and DevR.

Mycobacterium smegmatis DevS의 redox 인지 기전에서 GAF domain과 cysteine 잔기의 역할에 관한 연구

박광진 부산대학교 2009 국내석사

DevS is a sensor histidine kinase that mediates the genetic response of Mycobacterium tuberculosis (MTB) and M. smegmatis to oxygen limitation and NO exposure. The response regulator DevR activates transcription of its regulon under hypoxia conditions as well as on exposure to NO. In this study, we constructed a ΔdevS and ΔdevR mutant by allelic exchange. Complementation of these mutations were assessed by real time and reverse transcription PCR. The ΔdevS mutant strain lost its regulatory activity with regard to O₂ sensing and this change was reversed on complementation with devS from M. smegmatis, dosT from MTB, but not dosS from MTB. The N-terminal domain of the DevS contatins two GAF domains (GAF-A, GAF-B), and the histidine residue at position 150 in GAF-A domain serves as an axial ligand for heme b. Phylogenetic analysis of GAF-A domains of mycobacterial DevS homologs showed that primary structure of the GAF-A domian of M. smegmatis DevS was closely related with that of MTB DosT rather than DosS of MTB, consistent with the results of the complementation test. The C-terminal catalytic domain includes two cysteine residues at positions 422 and 547. C422A and C547A mutations in DevS leads to the complete and partial loss of its O₂-sensory function, respectively. 본 연구에서는 저산소 스트레스와 NO를 인지하는 DevSR two-component system의 DevS의 신호인지 기전에 대한 연구를 하기 위하여 devS와 devR의 돌연변이를 수행하였으며, 보상실험을 통하여 세포 내에서 이들의 역할을 알아보고자 하였으며 DevS의 kinase domain에 존재하는 두 개의 cysteine 잔기의 역할에 대하여 조사하였다. 그리고 MTB의 DevSR two-component system의 histidine kinase인 DevS (DosS)와 DosT의 신호인지 기작의 차이를 규명하기 위한 실험을 하였다. 선행연구의 결과에서 Cys-422가 아닌 Cys-547에 의해 DevS가 disulfide bond를 형성 할 것이라고 예측되었다. 하지만 in vivo에서 C422A는 신호전달을 하지 못했고 C547A는 신호전달에 손상을 입은 것을 확인하였다. 그리고 Western blotting의 결과로 DevS가 세포 내에서 monomer 형태인 것을 확인하였다. 세포의 cytoplasm 내부는 매우 환원된 상태이기 때문에 일반적으로 단백질의 cysteine 잔기는 reduced thiol (-SH)상태로 존재한다. 그리고 살아있는 세포는 다양한 환원적인 효소 경로를 통해 cytoplasm 내의 disufide bonds를 제거한다. Disulfide bond의 형성에 의해 활성이 조절되는 것은 아마도 감염경로에서 MTB가 대식세포 내로 들어간 후 대식세포가 병원균을 공격하기 위해 ROS 같은 oxidative stress를 주어 원하지 않았던 disulfide bond가 형성되는 'disulfide stress'를 받는 것으로 예상된다. E. coli의 K^(+) - limitation과 high osmolarity에 관여하는 KdpDE two-component system의 histidine kinase인 KdpD에서 cysteine 잔기의 치환에 의해 활성이 변하는 것이 관찰되었다. KdpD에는 6개의 cysteine이 존재하는데 그 중 transmembrane domain에 존재하는 Cys-409와 C-terminal cytoplasmic domain에 존재하는 Cys-852, Cys-874의 치환이 단백질의 활성에 영향을 미쳤다. 특히 Cys-852와 Cys-874는 G1, F, G2 motif와 가까우며 sensor kinase ATP binding site 영향을 미친다고 생각되며 이들을 다른 아미노산으로 치환할 경우 인산화활성이 매우 감소하는 것이 in vitro에서 관찰되었다. 일반적으로 GAF domain은 cGMP나 cAMP와 같은 cyclic nucleotide의 결합부위로 작용한다고 알려져 있다. 하지만 DevS가 가진 GAF domain은 Sinorhizobium meliloti의 FixL의 PAS domain 과 유사하게 heme을 가지며, heme이 결합하는 histidine이 잘 보존되어 있다. DevS 단백질이 가지는 두 개의 GAF domain 중에서 GAF-A domain이 heme에 결합하고, 여러 mycobacteria 종에 보존적인 GAF-A domain의 His-149가 heme에 직접 결합하는 부분이다. DevS의 GAF-B domain에는 histidine 잔기가 존재하지 않는다. Heme의 상태에 따라 활성이 조절되는 heme-based sensor로 잘 알려진 S. meliloti의 FixLJ는 주위 환경에 따라 질소고정 유전자들의 발현을 조절하는 two-component system으로 sensor kinase FixL과 response regulator FixJ로 구성되어 있다. FixL의 경우 PAS domain 내에 존재하는 heme의 상태에 따라 활성이 조절되는데 저산소 조건에서는 heme이 high-spin state로 FixL이 자가인산화 활성을 가지는 반면 호기적 조건에서는 low-spin state로 철이온의 위치가 변하게 되고 이로 인해 FixL의 구조가 변하게 되어 자가인산화 활성이 억제된다. MTB의 다른 two-component system인 SenX3-RegX3의 sensor kinase인 SenX3도 PAS domain에 의해 신호를 인지한다. SenX3-RegX3 two-component system은 oxidative stress에 저항해 세포를 보호하는 역할을 하는 것으로 생각된다. 쥐에 senX3와 regX3의 결손 변이균주를 감염시켰을 경우 병원성이 대폭 줄어들고 잠복상태로만 5개월 이상이 유지된다는 것으로 보아 이들은 attenuated vaccine으로의 이용이 가능할 것으로 보인다. DevS와 DosT는 N-말단의 GAF-A domain에 결합한 heme에 의해 O₂, NO, CO를 인지하는데 일반적인 호기적 상태에서 DevS heme의 철 이온은 ferric form (Fe^(3+)) 으로 존재하며, DosT heme의 철 이온은 oxy-ferrous form (Fe^(2+)-O₂)으로 존재한다. O₂는 DevS의 철 이온을 즉시 산화시켜 ferric form을 만들며, 저산소 조건에서 철 이온이 산화되어 ferrous form (Fe^(2+))이 되면 NO와 CO가 결합한다. 이는 DevS가 산화-환원 상태를 인지한다는 것을 말해준다. DosT의 철이온은 O₂와 직접 결합한다. Oxy-ferrous form DosT는 활성이 없는 상태이며, deoxy-ferrous form DosT는 자가인산화 활성이 나타나는 것으로 보아 DosT는 산소를 직접 인지한다는 것을 알 수 있다. NO와 CO가 결합된 DevS, DosT는 ferrous form DevS, deoxy-ferrous form DosT와 활성의 차이가 거의 없는 것으로 보아 NO와 CO가 활성에 꼭 필요한 분자가 아니라 활성상태를 안정하게 유지시켜주는 역할을 한다고 보여진다. DevS와 DosT의 신호인지 기작에 관한 차이는 GAF-A domain의 구조차이 에 의한 것이라 생각된다. 최근 구조가 밝혀진 DevS의 GAF-A domain은 heme 과 결합하는 His-149 주위로 Tyr-171과 Glu-87, His-89가 수소결합 네트워크를 형성하고 있다. 그리고 heme에 존재하는 철 이온의 distal position에 물 분자가 결합하고 있으며 철 이온으로 통하는 통로를 Glu-87이 막고 있고 이로 인해 O₂가 직접 결합하지 못한다. DosT의 경우 Glu-87이 glycine으로 치환되어 있다. 여러 mycobacteria 종에서 발견되는 DevS와 DosT의 GAF-A domain을 phylogenetic analysis를 해본 결과 DosT와 DevS 두 그룹으로 확연히 나누어지는 것이 관찰되며, 이들의 multiple alignment 결과에서 현저한 차이를 보이는 아미노산이 발견된다. MTB DevS와 DosT의 GAF-A domain은 69 %의 유사성을 가진다. M. smegmatis DevS GAF-A domain은 MTB DevS의 GAF-A domain과 68%의 유사성을 보이고 MTB DosT와는 81%의 유사성을 보인다. 그리고 M. smegmatis devS mutant에 MTB dosT를 형질전환 시켰을 때 저산소 신호 인지 활성이 회복되는 것으로 보아 M. smegmatis의 DevS는 DosT와 같이 O₂와 NO의 직접적인 결합에 의해 자가인산화 활성이 조절된다고 생각된다. MTB의 DevS와 DosT에 의해 M. smegmatis의 DevR인 인산화 되는 것은 MTB와 M. smegmatis의 DevR이 매우 보존적이라는 것을 보여준다. Multiple alignment를 결과에서 MTB와 M. smegmatis의 DevR은 84%의 유사성을 나타내었고 다른 종들에서도 매우 보존적이다. 앞으로의 연구에서 산화된 조건과 환원된 조건에서 DevS C422A, DevS C547A, MTB DosS, MTB DosT가 DevR의 인산화에 미치는 영향을 확인할 것이다. 인산화된 DevR을 이용하여 이들의 phosphatase 활성을 조사할 것이며 DosS와 DosT 두 단백질 사이에 차이를 보이는 GAF-A domain에 존재하는 아미노산들을 치환하여 이들의 산소인지 기작의 차이를 좀 더 명확하게 연구할 예정이다.

Genomic and Functional Analyses of EnvZ/OmpR Two-Component System Modulating Virulence and Antibiotic Resistance of Salmonella enterica Serovar Enteritidis

고두현 서울대학교 대학원 2022 국내박사

병원성 박테리아는 감염 주기 동안 다양한 환경 조건을 경험한다. 특정 환경에서 자연적으로 발생하는 유전적 돌연변이는 종종 박테리아의 생존 및 병원성을 향상시킨다. 본 연구는 식중독균인 살모넬라 엔테리티디스균이 갖고 있는EnvZ/OmpR two-component system의 감지단백질을 암호화하는 envZ 유전자에 발생한 특이적인 돌연변이의 기능을 밝혔다. 살모넬라 엔테리티디스균의 계통발생학적 분석을 통해 국내에서 분리된 FORC_075와 FORC_078을 포함하여 8개의 균주들의 유전체 서열이 거의 동일하다는 것을 확인하였다. 하지만, FORC_075의 생물막 및 적색의 건조하고 거친 (RDAR) 콜로니 형성 능력은 매우 손상되어, 8개 균주 간에 표현형 차이가 발생하였다. 비교 유전체 분석을 통해 FORC_075에만 발생한 SNP 중 하나가 envZ 유전자에 발생했다는 것을 확인하였다. 이 SNP는 FORC_078을 포함한 다른 균주가 갖고 있는 EnvZ의 Pro248을 FORC_075가 갖고 있는 EnvZ의 Leu248로 치환시켰다. FORC_075와 FORC_078 균주 사이의 envZ 유전자를 교환하여, envZ 유전자에 발생한 SNP가 살모넬라 엔테리티디스균의 생물막 및 RDAR 콜로니 형성 능력에 중요한 역할을 한다는 것을 밝혔다. 생화학적 분석을 통해, envZ 유전자의 SNP는 살모넬라 엔테리티디스균 내의 OmpR 인산화 수준을 증가시키며, OmpR의 하위 유전자들의 발현 또한 변화시킨다는 것을 확인하였다. 표현형 분석을 통해 envZ 유전자의 SNP는 살모넬라 엔테리티디스균의 운동성은 감소시키지만 인간 상피 세포와 쥐 대식 세포에 대한 부착과 침투 능력을 증가시키고 산 스트레스에 대한 생존력 또한 향상시킨다는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 envZ 유전자에 자발적으로 발생한 SNP가 살모넬라 엔테리티디스균의 표현형적 다양성에 기여하며 잠재적으로 생존 및 병원성을 향상시킬 수 있음을 시사한다. 한편, EnvZ/OmpR은 작은 친수성 항생제의 주요 경로인 외막포린(OMP)인 OmpC와 OmpF의 발현을 조절한다는 것 외에는 항생제 내성에 대한 역할이 거의 알려져 있지 않다. 항생제 내성에 대한 EnvZ/OmpR의 기능을 확인하기 위하여, 서로 다른 OmpR 인산화 수준을 보이는 두 개의 돌연변이 균주를 개발하였다. 높은 인산화 수준을 보이는 균주는 활성화된 EnvZ/OmpR 상태이며, 낮은 인산화 수준을 보이는 균주는 비활성화된 EnvZ/OmpR 상태를 의미한다. 흥미롭게도, 활성화된 EnvZ/OmpR은 살모넬라 엔테리티디스균의 항생제 내성, 특히 베타-락탐계열 항생제에 대한 내성을 증가시켰다. 전사체 분석을 통해, 활성화된 EnvZ/OmpR은 ompC 와 ompF 외에 SEN1522, SEN2875, ompD, ompW와 같은 다양한 OMP 유전자들의 발현을 조절한다는 것을 새롭게 밝혔다. 생화학적 분석을 통해 OmpR은 각 유전자의 상부에 직접 결합하여 SEN1522와 SEN2875의 발현을 활성화시키고 ompD와 ompW의 발현은 억제하여 OMP 조성을 조절한다는 것을 밝혔다. 특이적으로, 활성화된 EnvZ/OmpR에 의해 세포 내 OmpR수준이 증가하였을 때에만 4개의 OMP 유전자들의 발현이 조절되었고, ompD와 ompW의 발현 억제는 OmpR의 인산화 여부에 의존하지 않았다. 표현형 분석을 통해 OMP 유전자들 중 ompD와 ompF의 발현 감소가 EnvZ/OmpR에 의해 매개되는 베타-락탐계열 항생제에 대한 내성을 결정한다는 것을 확인하였다. 놀랍게도 EnvZ/OmpR은 외부 환경의 베타-락탐계열 항생제에 특이적으로 반응하여 살모넬라 엔테리티디스균의 생존을 향상시켰다. 이러한 결과는 EnvZ/OmpR이 베타-락탐계열 항생제에 반응하여 OMP 조성을 조절하고 살모넬라 엔테리티디스균의 항생제 내성에 기여한다는 것을 시사한다. 결론적으로, 본 연구는 살모넬라 엔테리티디스균의 표현형적 다양성을 부여하는 envZ 유전자에 발생한 특이적인 유전적 변이와 활성화된 EnvZ/OmpR이 항생제 내성에 기여하는 기작을 밝혔다. Pathogenic bacteria encounter various environmental conditions during their infection cycle. Under certain environments, genetic mutations occur naturally and often enhance bacterial survival and virulence. In the present study, the function of specific genetic mutation in the envZ gene, which encodes a sensor kinase of EnvZ/OmpR two-component system, has been identified in a food-borne pathogen Salmonella enterica serovar Enteritidis. A phylogenetic analysis of the S. Enteritidis strains showed that 8 strains of S. Enteritidis isolated in South Korea, including FORC_075 and FORC_078, have almost identical genome sequences. Interestingly, however, the abilities of FORC_075 to form biofilms and red, dry, and rough (RDAR) colonies were significantly impaired, resulting in phenotypic differences among the 8 strains. Comparative genomic analyses revealed that one of the non-synonymous single nucleotide polymorphisms (SNPs) unique to FORC_075 has occurred in envZ. The SNP in envZ leads to an amino acid change from Pro248 (CCG) in other strains including FORC_078 to Leu248 (CTG) in FORC_075. Allelic exchange of envZ between FORC_075 and FORC_078 identified that the SNP in envZ is responsible for the impaired biofilm- and RDAR colony-forming abilities of S. Enteritidis. Biochemical analyses demonstrated that the SNP in envZ significantly increases the phosphorylated status of OmpR in S. Enteritidis and alters the expression of the OmpR regulon. Phenotypic analyses further identified that the SNP in envZ decreases motility of S. Enteritidis but increases its adhesion and invasion to both human epithelial cells and murine macrophage cells. In addition, survival under acid stress is also elevated by the SNP in envZ. Altogether, these results suggest that the natural occurrence of the SNP in envZ could contribute to phenotypic diversity of S. Enteritidis, possibly improving its fitness and pathogenesis. Meanwhile, little is known about the role of EnvZ/OmpR in antibiotic resistance, except that it regulates the expression of OmpC and OmpF, two outer membrane porins (OMPs) permeable to small hydrophilic antibiotics. To determine the role of EnvZ/OmpR in antibiotic resistance, two mutant strains of S. Enteritidis expressing different phosphorylated status of OmpR were first generated. The mutant strains showing high and low cellular level of phosphorylated OmpR (OmpR-P) represent active and inactive states of EnvZ/OmpR, respectively. Interestingly, it was found that resistance to various antibiotics, especially β-lactams, in S. Enteritidis is elevated by the active state of EnvZ/OmpR. Transcriptome analysis newly discovered that the active state of EnvZ/OmpR induces a differential expression of multiple OMP genes besides ompC and ompF, including SEN1522, SEN2875, ompD, and ompW. Biochemical analyses demonstrated that OmpR alters the OMP composition in S. Enteritidis by directly activating SEN1522 and SEN2875 but repressing ompD and ompW. Non-canonically, a high cellular level of OmpR caused by the active state of EnvZ/OmpR is required for the regulation of the four OMP genes. In particular, phosphorylation of OmpR is not necessary for the repression of ompD and ompW. Phenotypic analysis revealed that among the four OMP genes, the decreased expression of ompD, in addition to ompF, is responsible for the EnvZ/OmpR-mediated resistance to β-lactams in S. Enteritidis. Notably, EnvZ/OmpR specifically responds to β-lactams and provides S. Enteritidis with benefits for survival upon exposure to the antibiotics. Taken to together, these results suggest that EnvZ/OmpR remodels the OMP composition in response to β-lactams and thereby contributes to the enhanced resistance in S. Enteritidis to the antibiotics. In conclusion, this study demonstrated the phenotypic diversity of S. Enteritidis attributed to specific genetic mutation in envZ and the mechanism by which the active state of EnvZ/OmpR improves antibiotic resistance in S. Enteritidis.

Activation of the MprBA Two-Component System in Mycobacterium smegmatis under Low pH and Respiration-Inhibitory Conditions

이예진 부산대학교 대학원 2024 국내석사

Mycobacterium tuberculosis is exposed to various stressful environments, such as hypoxic and acidic conditions, during infection and establishes persistent infection to survive in stressful environments. The MprBA two-component system (TCS) is known to play a key role in establishing and maintaining persistent infection. This study suggests the activation of the MprBA TCS under several conditions that lead to the inhibition of the respiratory electron transport chain (ETC). Using the Δaa3 mutant of Mycobacterium smegmatis lacking the aa3 cytochrome c oxidase, the major terminal oxidase of the respiratory ETC, we confirmed that inhibition of the respiratory ETC leads to an increase in the expression of sigE and sigB in a MprBA-dependent way. Activation of the MprBA TCS was also demonstrated under hypoxic conditions as judged by the upregulation of sigE. Using the Δbd mutant lacking the bd quinol oxidase of the respiratory ETC and KCN (the aa3 cytochrome c oxidase inhibitor), we revealed that the activation of the MprBA TCS is proportional to the extent of inhibition of the respiratory ETC. Furthermore, we found that MprBA-dependent sigE expression is strongly upregulated under low pH conditions (pH 5) which are expected to inhibit the respiratory ETC. In line with this observation, the ΔmprA mutant of M. smegmatis showed impaired growth relative to the wild-type strain under acidic conditions probably due to the impaired expression of sigB. This study demonstrated that the MprBA TCS is activated in M. smegmatis under respiration-inhibitory and low pH conditions.

Investigations on Mechanisms of Antibiotic Resistance and Persistence Using Burkholderia as a Model

Dongju Lee 고려대학교 대학원 2025 국내박사

세균의 항생제 내성과 확산은 전 세계적으로 중요한 건강 문제로, 치료 효과를 저하시킬 뿐만 아니라 감염 관리에도 복잡성을 더하고 있습니다. 내성 메커니즘을 분자 수준에서 이해하는 것은 효과적인 대응 방안을 마련하는 데 필수적입니다. 본 연구는 항생제 압력 하에서 발생하는 자발적인 유전적 돌연변이가 Burkholderia 종의 생존을 가능하게 하는 메커니즘을 조사하였으며, 두 가지 모델 생물인 Burkholderia cenocepacia와 Burkholderia thailandensis를 중심으로 연구를 진행하였습니다. B. cenocepacia는 면역저하 환자에게 심각한 폐렴을 유발하는 Burkholderia cepacia 복합체에 속하며, B. thailandensis는 높은 병원성을 가진 Burkholderia pseudomallei와 Burkholderia mallei와 밀접한 관계를 가진 비병원성 균주입니다. B. cenocepacia에서, 비타민 B₁₂ 생합성에 필수적인 BCAL2923 유전자에 돌연변이가 발생한 토브라마이신 내성 균주가 확인되었습니다. 이러한 돌연변이는 메틸말로닐-CoA 뮤테이스를 통한 숙시닐-CoA 생산을 방해하고, TCA 회로를 손상시키며, 토브라마이신 노출 시 활성 산소종(ROS) 생성을 감소시킬 수 있습니다. ROS 생성 감소는 살균 항생제의 활성을 약화시켜 내성을 증가시킵니다. 이 연구는 ROS를 매개로 한 살균 메커니즘의 중요성을 강조하며, 대사 경로를 잠재적 치료 타겟으로 제안합니다. B. thailandensis에서는 세포 외피 스트레스에 반응하여 β-락타메이스 유전자 penL의 발현을 조절하는 새로운 이성분 시스템(TCS) BesRS가 발견되었습니다. BesR 돌연변이는 β-락탐계 항생제 내성을 증가시키며, BesRS는 스트레스 반응 및 β-락탐 분해 대사에 관여하는 유전자를 공동으로 조절하여 항생제 환경에서 생존을 촉진합니다. BesRS를 타겟으로 하는 치료 전략은 Burkholderia 감염 치료에서 β-락탐 항생제의 효능을 향상시킬 가능성을 제시합니다. 또한 B. thailandensis에서 tRNAAsp의 안티코돈 루프의 32 또는 38 위치에서 발생한 돌연변이에 의해 유발된 새로운 지속성 메커니즘이 밝혀졌습니다. 이러한 돌연변이는 tRNA의 비아미노아실화(uncharged) 축적을 초래하고, RelA-의존적 엄격 반응을 활성화하여 다수의 항생제에 대한 지속성을 증가시킵니다. 이 메커니즘은 가역적임이 확인되었으며, 항생제 압력이 제거되었을 때 돌연변이 tRNA 대립유전자의 손실로 인해 정상 생리 상태로 복구됩니다. 이러한 발견은 세균의 지속성에서 tRNA 변형의 적응적 역할을 강조하며, 만성 및 재발성 Burkholderia 감염을 해결하기 위한 새로운 전략을 제안합니다. 본 연구는 Burkholderia 종의 항생제 내성과 지속성을 유도하는 유전적 및 생화학적 메커니즘에 대한 이해를 심화하며, 세균의 적응 전략에 대한 귀중한 통찰을 제공합니다. 또한, 다제내성 병원균을 퇴치하기 위한 표적 치료법 개발에 기여할 것입니다. The emergence and proliferation of bacterial strategies to evade antibiotics pose critical challenges to global health, threatening treatment efficacy and complicating infection management. Understanding the molecular mechanisms driving bacterial adaptation is essential for devising effective countermeasures. This study investigates how spontaneous genetic mutations that arise under antibiotic pressure enable Burkholderia species to survive, focusing on two model organisms: Burkholderia cenocepacia, a member of the Burkholderia cepacia complex causing severe pneumonia in immunocompromised individuals, and Burkholderia thailandensis, a non-pathogenic relative of the highly virulent pathogens Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei. In B. cenocepacia, three mutations in the BCAL2923 gene, essential for cobalamin (Vitamin B12) biosynthesis, were identified in mutants with reduced susceptibility to tobramycin. These mutations may disrupt succinyl-CoA production via methylmalonyl-CoA mutase, impairing the tricarboxylic acid (TCA) cycle and reducing reactive oxygen species (ROS) generation, which weakens the activity of bactericidal antibiotics. This highlights the critical role of ROS-mediated killing in effective treatments and identifies metabolic pathways as potential therapeutic targets. In B. thailandensis, a novel two-component system (TCS) named BesRS was identified, regulating the expression of the β-lactamase gene penL in response to cell envelope stress. Mutations in BesR increase resistance to β-lactams, while BesRS co-regulates genes involved in stress responses and β-lactam catabolism, enhancing bacterial survival in antibiotic-rich environments. Targeting BesRS could improve the efficacy of β-lactam antibiotics in Burkholderia infections. A novel persistence mechanism was also identified in B. thailandensis, triggered by mutations at positions 32 or 38 in the anticodon loop of tRNAAsp. These mutations cause uncharged tRNA accumulation, activating a RelA-dependent stringent response that enhances persistence against multiple antibiotics. The mechanism was shown to be reversible, as the loss of the mutant tRNA allele restored wild-type physiology after antibiotic pressure was removed. This highlights the adaptive role of tRNA modifications in bacterial persistence and suggests new strategies for combating chronic and relapsing Burkholderia infections. These findings deepen understanding of the genetic and biochemical mechanisms underlying antibiotic resistance and persistence in Burkholderia species. They provide valuable insights into bacterial adaptation and inform the development of targeted therapies to combat infections caused by bacteria with multidrug survival strategies.

Purification and characterization of the DevSR two-component system involved in hypoxia-induced latency of mycobacteria

오지현 부산대학교 일반대학원 2005 국내석사

Two-component systems play a central role in the adaptation of pathogenic bacteria to the environment prevailing within host tissues. The DevSR two-component system in Mycobacterium smegmatis which is composed of the DevS histidine kinase and the DevR response regulator, controls the expression of hypoxia-responsive genes. The devR, full-length devS and truncated devS were cloned and the protein products were overexpressed and purified from Escherichia coli. In vitro phosphorylation assays were performed using purified DevS, DevR and C-DevS. Truncated DevS lacking the transmembrane domain has a significantly greater ability to dephosphorylation DevR than does full-length DevS. The kinase activity of DevS was reactivated by reducing agent such as DTT and inhibited by the cAMP, but C-DevS has no response. This finding provides the evidence that the sensing domain (transmembrane domain) and GAF domain of DevS plays an important role in redox sensing. Terminal oxidase inhibitors enhanced the expression of hspX gene in M. smegmatis grown under aerobic conditions. These data suggest that DevS recognizes redox condition of the respiratory pathway as a secondary signal or that a terminal oxidase serves as a redox sensor which regulates DevS activity in response to changes in oxygen tension.