소에 감염된 Theileria buffeli 주요 표면 단백질 유전자의 다양성 분석

이영화 전북대학교 대학원 2009 국내박사

Theileria buffeli (former T. sergenti/orientalis)는 주로 한국, 중국, 일본 등의 극동아시아 지역의 소에 감염되는 진드기 매개성 주혈원충이다. T. buffeli는 소에게 식욕 저하, 발육 부진, 빈혈, 발열, 그리고 황달 등의 임상증상을 나타내며, 중증에서는 유산 및 폐사를 일으켜 양축농가에 많은 경제적 손실을 끼치고 있는 병원체이다. Theileria major surface protein (Msp)은 숙주의 면역계에 의하여 인지되는 주요 항원 단백질이다. 그중 33/34 kDa의 Msp는 T. buffeli 내에서 많은 부위를 차지하는 단백질로서 그 항원성과 면역원성이 높은 막표면단백질로 알려져 있다. 하지만 이러한 T. buffeli의 Msp 유전자의 다양성에 대한 분석 결과의 보고는 미비한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 한국의 T. buffeli에 감염된 소의 Msp gene의 다양성을 분석하고, 그 변화상 및 감염 소의 혈액상과 관계를 분석하고자 하였다. 이를 위하여 먼저 한국의 제주에서 사육되고 있는 젖소 57두, 한우 177두에 대한 혈액검사를 실시하였고, Theileria 18S rRNA PCR 검사 및 유전자 염기서열분석을 실시하여 확인하였다. 양성반응을 나타낸 시료에서 젖소의 경우 빈혈을 나타낸 16두, 정상범위의 10두, 총 26두를 선택하였다. 한우의 경우에는 빈혈을 나타낸 16두, 정상범위의 12, 총 28두를 선택하여 각각의 Theileria Msp gene을 PCR 증폭하였고, 그 염기서열 및 항원성을 분석하였다. T. buffeli Msp의 유전자 염기서열에서는 젖소의 경우 Theileria spp.(China; EU584237), T. sergenti(China; DQ078264), Theileria spp.(Thailand; AB081329), Theileria spp.(Okinawa strain, Japan; AB218442), T. buffeli(Fukushima strain, Japan; AB016280) 그리고 Theileria spp.(Okushiri strain, Japan; D87205)와 각각 99.5%, 99.0%, 99.2%, 98.7%, 99.9% 그리고 98.4%의 유사성을 나타내었다. 한우의 경우 Theileria spp.(China; EU584237), T. sergenti(China; DQ078264), Theileria spp.(Thailand; AB081329), Theileria spp.(Okinawa strain, Japan; AB218442), T. sergenti(Fukushima strain, Japan; AB016280)와 각각 99.5%, 100%, 99.2%, 100% 그리고 98.9%의 유사성을 나타내었다. 또한 DNA 염기서열을 amino acid로 전환하여 그 항원성을 분석한 결과, 항원성에 근거한 분류에서는 젖소의 경우 6개 type 즉 type Ⅰ~Ⅵ으로, 한우의 경우 5개 type 즉 type Ⅰ~Ⅴ으로 분류되었다. 그리고 type Ⅳ의 경우 2개의 아-타입으로 분류되었다. 젖소의 경우 분석된 Msp의 수가 총 52건인데 type Ⅰ이 30, type Ⅱ가 2, type Ⅲ이 8, type Ⅳ가 4, type Ⅴ가 7 그리고 type Ⅵ이 1을 차지하였고 한우의 경우 총 56건 중 type Ⅰ이 22, type Ⅱ가 15, type Ⅲ이 9, type Ⅳ가 7 그리고 type Ⅴ가 3을 차지하였다. 추가로, 아미노산 서열을 토대로 한 항원성 분석과 샘플의 PCV 수치와의 관계를 비교 분석하였다. 한우에서 PCV 수치가 낮은 시료들에서 type Ⅱ의 검출율이 높았는데 type Ⅱ는 GenBank database에 등록되어있는 Ikeda type과 유사성을 나타내었다. 이 Ikeda type은 항원성이 높은 것으로 알려져 있다. 반면 젖소에서는 이러한 양상이 보이지 않았고, 전반적으로 type Ⅰ의 검출율이 높았다. 그리고 젖소에서 type Ⅵ가 1건 검출되었다. 이상의 연구에서부터 한국의 소에 감염된 Theileria Msp gene type과 혈액상과의 관계 규명을 최초로 시도한 결과, 그 Msp gene type이 다양하게 존재하고 있음을 확인할 수 있었으며, 젖소와 한우는 각각 감염된 Theileria의 Msp gene type의 분포에서 서로 다른 양상을 보이고 있음을 알 수 있었다. Theileria buffeli (formerly T. sergenti/orientalis) is the major hemo-protozoan distributed in the Far East Asian countries of Korea, China and Japan. T. buffeli is responsible for the clinical symptoms of anorexia, ateliosis, anemia, fever and icterus in cattle. It also causes abortion and sudden death under severe cases, resulting in economic losses for many livestock farms. Theileria major surface protein (Msp) is the major antigenic protein recognized by the immune system of the host. Among the Msp, the 33/34 kDa membrane surface protein that occupies most of the region within T. buffeli has high antigenicity and immunogenicity. However, few studies have analyzed the genetic diversity of the Msp gene in T. buffeli. Thus, the aim of the current study was to analyze the diversity of the Msp gene in T. buffeli infected cattle, and to characterize the relationship between the diversification pattern and hemogram of the infected cattle. Towards that goal, we conducted complete blood count (CBC) tests for 57 Holstein cattle (HC) and 177 Korean indigenous cattle (KIC) raised in Korea. We also performed PCR test and sequence analysis for a T. buffeli 18S rRNA gene to confirm a positive reaction in conjunction with the DNA sequences. From the samples that showed a positive reaction, a total of 26 HC were selected, including 16 HC with anemia and 10 HC in the normal range, and a total of 28 KIC were selected, including 16 KIC with anemia and 12 KIC in the normal range. For each of these samples, we performed a PCR amplification of the T. buffeli Msp gene and analyzed the base sequence and antigenicity. The DNA sequence of the T. buffeli Msp gene in HC showed 99.0%, 99.2%, 99.9%, 99.5%, 98.7%, 98.4% and 98.4% homology with T. sergenti (China; DQ078264), Theileria spp. (Thailand; AB081329), T. sergenti (Fukushima strain, Japan; AB016280), Theileria spp. (China; EU584237), Theileria spp. (Okinawa strain, Japan; AB218442) Theileria spp. (Okushiri strain, Japan; D87205) and Theileria spp. (Okushiri strain, Japan; D87205), respectively. The T. buffeli Msp gene in KIC shared 100%, 99.2%, 98.9%, 99.5% 100.0% and 99.6% homology with T. sergenti (China; DQ078264), Theileria spp. (Thailand; AB081329), T. sergenti (Fukushima strain, Japan; AB016280), Theileria spp. (China; EU584237), Theileria spp. (Okinawa strain, Japan; AB218442) and Theileria spp. (Okushiri strain, Japan; D87205), respectively. In addition, we performed an antigenicity analysis after translating the DNA sequence into a protein sequence, which enabled us to identify six types of antigenicity as types I~VI in the HC and five types as type I~V in the KIC. Especially, the type Ⅴ antigenicity could be sub-classified into two types. Among the total 52 analyzed Msp genes in the HC, we observed 2, 8, 7, 30, 4 and 1 cases of type I, type II, type III, type IV, type V and type VI, respectively. However, among the 56 Msp genes in the KIC, we found 15, 9, 3, 22 and 7 cases of type I, type II, type III, type IV and type V, respectively. Additionally, a comparative analysis was performed using the antigenicity analysis and its relationship with the PCV values of each sample based on the amino acid sequence. Among the samples showing low PCV values in KIC, the detection of type Ⅰ was high and the their sequences were similar to the Ikeda type registered in the GenBank Database. The Ikeda type has been shown to have a high antigenicity, but such a pattern was not observed in the HC where there was high detection of the type I antigenic type overall. In addition, type VI was detected in only one HC. Using the results from previous studies, we first attempted to classify the type of the T. buffeli Msp gene that were infecting Korean cattle to determine the hemogram relationship. The results of our study helped confirm the presence of diverse types for T. buffeli Msp gene and demonstrated that the HC and KIC showed different patterns for T. buffeli Msp gene type distribution.

Studies on Comparative Genome Analysis of Theileria Parasites and Vaccine Developement against T. orientalis : Theileria原蟲の比較ゲノム解析とT. orientalisに對するワクチン開發する關する硏究

김정연 岐阜大學 2004 해외박사

1-5. Summary In the present study, a novel antigenic protein expressed in the piroplasm stage of Theileria orientalis was characterized. A 4,707 by genomic fragment amplified by PCR contained two ORFs. The deduced amino acid sequence of the first ORF showed significantly high similarlity to the ubiquitin carboxy terminal hydrolases/proteases while the second ORF (ToORF2) showed homology to several surface antigens of plasmodia. TbORF2 was expressed to determine whether the protein product is expressed by the parasite. In western blot analysis, bovine antiserum from a T. orientalis-infected calf recognized the recombinant protein containing a C-terminal part of the ORF expressed by baculovirus system. Western blot analysis with the anti-ToORF2 mouse serum recognized a 48 kDa protein in T. orientalis piroplasm lysates. Immunofluorescence antibody test by confocal scanning laser microscopic analysis showed that antisera against the recombinant protein recognized T. orientalis piroplasm in the infected erythrocyte. The results from this study indicate that ToORF2 protein is expressed at the piroplasm stage and is immunogenic. This novel antigenic ToORF2 protein could be exploited for vaccine development against bovine piroplasmosis. 2-5. Summary The product of an open reading frame found in a fragment of Theileria orientalis genomic DNA was characterized. Homology analysis of the predicted product showed that it encodes a 35 kDa polypeptide (P35) that bears stretches ofa-helical regions and is similar to MESA of Plasmodium falciparum. Since the recombinant product expressed by a baculovirus expression system was recognized by antiserum obtained from a T. orientalis-infected calf, it is immunogenic during T. orientalis infection. Western blot analysis revealed that a murine serum raised against the recombinant product detected a 35 kDa protein in T. orientalis piroplasm lysates. Confocal laser scanning microscopy analysis showed that the antiserum mainly recognized piroplasms in erythrocytes that were losing their intact structures. Triton X-100-treated Sf9 cells expressing the recombinant product were detected by the murine antiserum in immunofluorescence antibody test, which indicates that this molecule is associated with the cytoskeleton of insect cells. P35 was also found to bind specifically to the Triton X-100-insoluble membrane fraction of uninfected bovine erythrocytes. These findings suggest that the novel P35 protein of T. orientalis is predominantly expressed in the late stage of intra-erythrocytic development and that it can interact with the erythrocyte membrane skeleton. 3-5. Summary Theileria orientalis infects cattle and causes various disease symptoms, including anemia and icterus. The erythrocytic stages are responsible for these symptoms but the molecular events involved in these stages have not yet been fully elucidated. In this study, a T. orientalis cDNA that encodes a polypeptide related to identity to the microneme-rhoptry protein of T. parva wasidentified. Analysis of microneme-rhoptry protein of T. orientalis (ToMRP) by indirect fluorescent-antibody test revealed that it is specifically expressed at the early erythrocytic stage after invasion. This expression disappears during the intermediate stages of intra-erythrocytic development. Its expression then reappears at the late stages after the parasite has divided by binary fission into diad or tetrad forms and before these forms are released from the host erythrocyte. In vitro erythrocyte binding assays showed that ToMRP associates with the Triton-X insoluble fraction of erythrocytes membrane but not with intact erythrocytes. Cosedimentation and western blot analyses revealed that ToMRP binds to band 3, a membrane component of bovine erythrocytes. These observations suggest that ToMRP may be involved in the parasite's egress from and/or invasion into the host erythrocytes by interacting with a protein in the membrane skeleton of the erythrocyte and thereby modifying the structure and function of the cell. 4-4. Summary Benign Theileria species of cattle are found in most parts of the world. The major piroplasm surface protein (MPSP), a conserved protein in all Theileria species, has been used as a maker for epidemiological and phylogenetical studies of benign Theileria species. Parasites with Ikeda- or Chitose-type MPSP genes are dominant in Japan, but it was reported here mixed infection cases of Theileria_parasites with an additional MPSP type parasite infecting cattle in Abashiri District, Hokkaido. The MPSP gene sequence found in the additional type was closely related to MPSP genes of Theileria_parasites found in Southeast Asian countries, including Thailand (Narathiwat) and Indonesia (Java). Theileria parasites from the blood sample were also distinguishable from the Ikeda or Chitose type parasites by small subunit ribosomal RNA (SSU rRNA) gene sequence analysis, and they are grouped into the SSU rRNA types C/D found in Korea, North America, and Spain. The present finding of mixed infections of cattle with three different types of Theileria makes epidemiological feature of bovine theileriosis in Japan more complex. I have designed a set of primers specific to this MPSP type in order to conduct further epidemiological study.

Molecular Detection and Genotyping of Theileria spp. in Deer (Cervidae) : 사슴에서 범안열원충(Theileria)의 분자생물학적 검출과 유전형 분석

정창욱 경북대학교 대학원 2023 국내석사

Theileria는 가축과 야생 반추동물을 감염시키는 진드기 매개 병원체이다. 숙주동물에서 림프구에서 증식한 다음 적혈구를 침입하여 병원성을 나타내며 참진드기가 Theileria의 감염을 매개한다. 주요 증상은 발열, 빈혈, 식욕부진, 황달 및 생산성 감소 등이다. 이러한 이유로 Theileria는 축산농가에 위협적인 존재로 인식된다. 국내에서는 Theileria를 비롯한 진드기 매개 병원체에 대한 다양한 연구가 진행되고 있지만, 고라니를 비롯한 사슴의 Theileria 감염에 대한 연구는 거의 없다. 이 연구에서, 총 160마리의 사슴 혈액을 채취했으며 DNA를 추출하였다. 유전자 증폭을 위해 추출된 DNA 샘플은 PCR을 진행하였다. 우선, 시료에서 주혈원충 감염을 확인하기 위해 주혈원충 공통 프라이머를 이용하였으며 다음 단계로 범안열원충 특이 유전자 부위를 증폭하였다. PCR 양성 시료는 염기서열을 분석하여 계통수를 작성하였다. 전체 감염률은 8.1%(13/160)로 확인되었다. 지역별로는 북부와 남부가 모두 100%로 가장 높은 감염률을 보였지만 시료수가 각각 5와 1로 적었다는 한계가 존재하였다. 중부 지역은 2.9%(4/140)로 가장 낮은 감염률을 나타내었다. 계절별로는 봄철 감염률이 18.4%(9/49)로 가장 높았다. 그 다음으로 여름이 8.9% (4/45)의 감염률을 보였다. 가을과 겨울의 시료는 확보되지 않았다. 지역과 계절, 두 가지 요인이 통계학적 유의성을 나타내었다. 계통수를 이용한 계통발생학적 분석은 염소나 양과 같은 반추동물을 감염시키는 종인 Theileria luwensuni로 동정되었다. 기후변화로 인한 진드기 분포가 확대되고 있는 상황에서 범안열원충의 중요성은 과거보다 증가하고 있다. 향후 더 많은 시료를 확보하여 범안열원충의 전국적인 분포 현황을 조사할 필요가 있어 보인다. 핵심어: 범안열원충, 진드기, 유전형, 고라니, 계통분석, 감염률 Theileria is an opportunistic pathogen that infects livestock and wild ruminants. It proliferates in lymphocytes and penetrates red blood cells. The hard tick mediates Theileria infection. Major signs and symptoms of Theileria infection include fever, anemia, anorexia, jaundice, and decreased milk production. Due to these symptoms, Theileria is considered a major threat to livestock farming. Various studies have been conducted on tick-borne pathogens including Theileria in Korea, but only few studies have focused on Theileria infection in deer, including the Korean water deer. In this study, we collected 160 deer blood samples. These samples were then processed to extract DNA, and polymerase chain reaction (PCR) was performed for DNA amplification. The first PCR was performed to locate piroplasms in samples. The second PCR was performed to detect Theileria. Next, PCR positive samples were analyzed through the construction of a phylogenetic tree. Data regarding species, region, and season were recorded as possible. Our results showed that overall infection rate of Theileria was 8.1% (13/160). Infection rates of 100% were observed in the northern and southern regions. However, a limitation of this analysis was the small sample size, where we analyzed 5 and 1 sample from the northern and southern regions, respectively. The central region exhibited the lowest infection rate of 2.9% (4/140). Infection rates also differed based on seasons. The infection rate was the highest, (18.4%, 9/49) in spring, followed by that in summer (8.9%, 4/45). However, 0% infection rates were seen during autumn and winter seasons. Phylogenetic analysis indicated that PCR-positive samples were identical to Theileria luwenshuni which usually infects small ruminants such as goat and sheep. Owing to the enormous economic losses caused by Theileria in livestock farming, it is becoming increasingly important. Consequently, additional investigations should be conducted on various species in a wider area. Keywords: Theileria, tick, genotyping, Korean water deer, phylogeny, incidence

Antigenic diversity of theileria major piroplasm surface protein gene on Korean native Black cattle in Jeju : 제주 흑한우의 theileria major piroplasm surface protein gene 항원형의 다양성

고명순 Graduate School Cheju National University 2004 국내박사

Piroplasm은 진드기가 매개하는 주혈원충으로, 허약, 발열, 빈혈 및 황달을 일으킨다. 한국과 일본에 분포하는 것은 Theileria sergenti와 Babesia ovata로, 방목중인 소의 증체률 저하로 인한 경제적 손실이 큰 것으로 알려져 있다. 본 연구는 제주농업시험장에서 생산, 방목 사육중인 제주 흑한우 35마리를 대상으로, RLB-F2/R2 pirmer set를 이용한 PCR과 KpnⅠ를 이용한 PCR-RFLP을 실시하여 Theileria와 Babesia sp의 혼합감염와 Allele-specific PCR를 하여 Theileria의 MPSP gene 항원형의 다양성에 대한 조사하였다. 35마리의 혈액학적 검사 결과는 정상범위에 속하였으며, Giemsa염색한 혈액도말표본에서는 35마리 중 9마리에서 충체를 발견하였으나, 그 빈도는 매우 낮았다. PCR결과 35마리 모두 Theileria에 감염되어있었으며, 그 중 20마리(57.1%)가 Theileria와 Babesia sp.의 혼합감염이었다. Theileria의 MPSP gene 항원형에 대한 조사시, C(Chitose) type, I(Ikeda) type과 B(Buffeli) type이 혼합감염되어 있었으며, 주된 type은 C와 B type이었다. B type에 대한 RFLP을 실시하여 변이형을 확인하였다. The piroplasms, Theileria sp. and Babesia sp. are both tick-transmitted intracelluar haemoprotozoan parasites and cause anorexia, fever, anemia and icterus. Bovine piropasmosis caused by T. sergenti and Babesia ovata are a cause of major economic loss in grazing cattle in Japan and Korea. I have investigated co-infection of Theileria and Babesia sp. by PCR and PCR-RFLP and examined the antigenic diversity of MPSP gene on 35 herds of clinically healthy Korean Native Black Cattle that were born and raised in National Jeju Agricultural Experiment Station in May, 2003. In the microscopic examination of Giemsa-stained blood smears(×1,000), intracellular parasites were rare. The hematological data were in normal range. Twenty(57.1%) out of 35 samples were co-infection of Theileria and Babesia sp.. All the blood samples were amplified universal MPSP gene and infected with mixed C, I, B1 and B2 of Theileria sp.. They were mainly C and B type. There were allelic variants in Korean Native Black Cattle in Jeju.

Antigenic diversity of theileria major piroplasm surface protein gene on Korean native Black cattle in Jeju

Ko, Myung Soon 제주대학교 대학원 2003 국내석사

The piroplasms, Theileria sp. and Babesia sp. are both tick-transmitted intracelluar haemoprotozoan parasites and cause anorexia, fever, anemia and icterus. Bovine piropasmosis caused by T. sergenti and Babesia ovata are a cause of major economic loss in grazing cattle in Japan and Korea. I have investigated co-infection of Theileria and Babesia sp. by PCR and PCR-RFLP and examined the antigenic diversity of MPSP gene on 35 herds of clinically healthy Korean Native Black Cattle that were born and raised in National Jeju Agricultural Experiment Station in May, 2003. In the microscopic examination of Giemsa - stained blood smears (×1,000), intracellular parasites were rare. The hematological data were in normal range. Twenty (57.1%) out of 35 samples were co-infection of Theileria and Babesia sp.. All the blood samples were amplified universal MPSP gene and infected with mixed C, I, B1 and B2 of Theileria sp.. They were mainly C and B type. There were allelic variants in Korean Native Black Cattle in Jeju. Piroplasm은 진드기가 매개하는 주혈원충으로, 허약, 발열, 빈혈 및 황달을 일으킨다. 한국과 일본에 분포하는 것은 Theileria sergenti와 Babesia ovata로, 방목중인 소의 증체률 저하로 인한 경제적 손실이 큰 것으로 알려져 있다. 본 연구는 제주농업시험장에서 생산, 방목 사육중인 제주 흑한우 35마리를 대상으로, RLB-F2/R2 pirmer set를 이용한 PCR과 KpnⅠ를 이용한 PCR-RFLP을 실시하여 Theileria 와 Babesia sp의 혼합감염와 Allele-specific PCR를 하여 Theileria의 MPSP gene 항원형의 다양성 에 대한 조사하였다. 35마리의 혈액학적 검사 결과는 정상범위에 속하였으며, Giemsa염 색한 혈액도말표본에서는 35마리 중 9마리에서 충체를 발견하였으나, 그 빈도는 매우 낮았다. PCR결과 35마리 모두 Theileria에 감염되어있었으며, 그 중 20마 리 (57.1%)가 Theileria 와 Babesia sp.의 혼합감염이었다. Theileria의 MPSP gene 항원형에 대한 조사시, C (Chitose) type, I (Ikeda) type 과 B (Buffeli) type이 혼합감염되어 있었으며, 주된 type은 C와 B type이었다. B type에 대한 RFLP을 실시하여 변이형을 확인하였다.

Comparison of Theileria sergenti Infection Rates in Cattle Breeds on Cheju Island : 濟州地域 소의 品種別 Theileria sergenti 感染率 比較

김근형 濟州大學校 大學院 1998 국내박사

제주 지역에서 사육되는 7개월령 이상의 홀스타인 한우, 교잡우 {Charolais (Brah man×Korean native cattle)} 각 40두씩 총 120두와 7개월령 미만의 육성우 각 25두씩 총 75두를 대상으로 Giemsa 염색에 의한 광학현미경적 진단법과 중합효소연쇄반응법(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 이용하여 소의 품종별 Theileria sergenti 감염률과 감염우의 혈액학치에 대한 연구를 수행하였다. 방목 초기인 5윌에 7개월령 이상의 소에서 중합효소연쇄반응법에 의한 Theileria sergenti 양성률은 홀스타인이 92.5 %로 교잡우 85 %, 한우 75 %보다 높았다. 7개월령 미만의 소에서도 홀스타인이 88 %로 교잡우 84 %, 한우 72 %보다 높았다. 소 품종간 원충 감염률은 홀스타인이 다른 품종에 비하여 높았다. 혈액검사에서는 원충에 감염된 7개월령 이상의 소에서 홀스타인의 적혈구수(RBC)와 적혈구 용적(PCV)(573±88 10^(4)/㎕, 31±3%)은 한우(772±100 10^(4)/㎕, 40±4%)와 교잡우 (713±130 10^(4)/㎕, 36±4%)보다 낮았다(p<0.01). 7개월령 미만의 홀스타인의 RBC와 PCV(665±120 10^(4)/㎕, 31±4%)에서도 한우(885±167 10^(4)/㎕, 41±7%)와 교잡우(725±92 10^(4)/㎕, 40±5%)보다 낮았다(p<0.01). 또한 원충감염이 심해질수록 모든 품종에서 적혈구수와 적혈구용적은 유의성 있게 낮았다(p<0.05). 홀스타인에서 방목기간인 5, 7, 9월에 Theileria sergenti 양성률과 원충감염률은 계속적으로 증가했으며, 적혈구수(587±99 10^(4)/㎕, 538±96 10^(4)/㎕, 402±82 10^(4)/㎕)와 적혈구용적(31±4%, 29±3 %, 26±4%)은 계속적으로 낮아졌다(p<0.05). To study about Theileria sergenti infection rates and hematological values in cattle breeds on Cheju Island, equal numbers of Holstein cattle, Korean native cattle and crossbreed cattle {Charolais(Brahman×Korean native cattle)}, totaling 120 cows over seven months old and 75 calves under seven months old, were examined by the microscopic examination of Giemsa-stained blood smears and the polymerase chain reaction (PCR) method. In May, the early pasture season, the positive rate of parasites (92.5 %) in Holstein cattle was higher than those (75 %, 85 %) of Korean native cattle and crossbreed cattle over seven months old. And positive rate (88 %) of Holstein cattle was higher than those (72 %, 84 %) of Korean native cattle and crossbreed cattle under seven months old. In comparison of parasitemia, the result in Holstein cattle was higher than in other breeds. In T. sergenti infected cattle, red blood cell (RBC) counts and the packed cell volume (PCV)(573±88 10^(4)/㎕, 31±3%) of Holstein cattle were lower than those of Korean native cattle (772±100 10^(4)/㎕, 40±4%) and crossbreed cattle (713±130 10^(4)/㎕, 36±4%) over seven months old (p<0.01). Also, RBC counts and PCV (665±20 10^(4)/㎕, 31±4%) of Holstein cattle were lower than those of Korean native cattle (858±167 10^(4)/㎕, 41±7 %) and crossbreed cattle (725±92 10^(4)/㎕, 40±5%) under seven months old (p<0.01). As parasitemia progresses, RBC counts and PCV decreased significantly in all breeds (p<0.05). In the other study of hematological values in Holstein cattle during pasture period (May, July and September), positive rate and parasitemia in Holstein cows increased, and RBC counts (587±99 10^(4)/㎕, 538±96 10^(4)/㎕, 402±82 10^(4)/㎕,) and PCV (31±4%, 29±3%, 26±4%) decreased continuously (p<0.05).

방목 가축에 대한 Theileria sergenti 감염 조사 및 외부기생충 구제제 투여의 예방 효능 평가

차승언 전북대학교 일반대학원 2023 국내박사

국토 면적의 약 64%가 산지로 구성되어 있는 우리나라는, 현행 배합 사료 위주의 밀식 사육 방식의 축산업 일변도에서 탈피하여 산지에 초지를 조성하여 산지 방목 축산을 도입하는 것이 좋은 대안이 될 수 있다. 이는 배합사료를 생산하는데 사용되는 수입 곡류를 절감하여 축산업의 경쟁력을 강화시킬 수 있을 뿐만 아니라 초지 조성을 통해 축산업을 친환경 관광산업으로도 육성, 발전시킬 수 있는 6차 산업의 기초가 될 수도 있다. 하지만 국내 산지 내의 초지 조성이 제대로 이루어져 있지 않은 상태이기 때문에 우리나라의 방목형 산지 축산은 그 도입 및 정착도 제대로 되어 있지 않은 실정이다. 따라서 우리나라의 여건에 맞는 산지 축산 질병 관리 시스템 개발이 시급히 이루어져야만 한다. 이에 본 연구에서는 1) 한우의 방목시기 및 방목방법에 따른 혈액학적 변화를 분석하고, 2) 한우의 Theileria sergenti 감염에 따른 혈액학적 변화를 밝히며, 3) 방목 소에서 Theileria sergenti 감염에 대한 ivermectin의 효능을 평가함으로써 산지 축산 가축들의 주요 질병들에 대한 표준화된 조기 감별 및 치료, 관리 매뉴얼 확립 및 현장 적용에 활용하는 기초 근거를 제시하였다. 혈액 검사는 가축에서 질병 진단, 치료 효과 및 예후 결정과 같은 치료 계획을 개발하는 데 사용되었다. 제 1장에서는 봄부터 가을까지 방목한 한우를 대상으로 방목 전후의 적혈구, 백혈구, 혈소판 등 혈구수 변화를 알아보았다. 방목 기간 동안 매일 저녁 방목장에서 축사로 돌아온 가축군(A, n=34)과 방목장에서 축사로 돌아오지 않은 가축군(B, n=21)의 혈구수를 비교하였다. RBC, 헤모글로빈, 헤마토크릿, MCV, WBC, 호중구, 호산구, 단핵구, 림프구 등의 혈액학적 변수는 혈구분석기를 이용하여 측정하였다. 가축군 A는 RBC, MCV, MCHC, WBC, EOS, LYM 값에서 유의미한 차이를 보였다. 가축군 B는 RBC, Hb, HCT, MCV, MCH, PLT, NEU, BAS 값에서 유의미한 차이를 보였다. 특히 방목 전과 비교했을 때 방목 후 적혈구 수가 감소하였다. 방목 전과 비교하여 방목 1개월부터 5개월까지는 낮은 적혈구수를 유지하였다. WBC 수는 방목 4개월부터 증가한 반면 EOS 수는 방목 2개월부터 증가했다. 이러한 결과는 RBC와 WBC의 값이 방목 전후와 방목 기간에 따라 다르다는 것을 시사한다. 나아가, 이러한 혈액 분석값을 바탕으로 방목장에서 사육되는 가축들을 위한 사양관리 방안을 개발할 필요가 있다. 진드기 매개 병원체는 소를 방목하는 데 심각한 문제를 일으킬 수 있다. 그러나 산에서 방목하는 소의 진드기 매개 질병에 대한 정보는 거의 없는 실정이다. 제 2장에서는 한우의 계절 및 방목 형태에 따른 유행성 진드기 매개 감염과 이에 따른 혈액학적 변화를 조사하여 방목 소의 진드기 매개 질병과 관련된 잠재적인 문제점을 파악하는 것을 목적으로 한다. 2014년과 2015년, 봄부터 가을까지 대한민국 3개 지역의 한우 소를 축사 내 사육하거나 산지에 방목하였다. 산지에서 방목한 소의 Theileria sergenti 감염률(54.7%)은 방목하지 않은 소의 감염률(16.3%)에 비해 Theileria sergenti 감염률이 크게 증가하여 진드기 매개 감염의 유병률이 더 높았다(P < 0.001). 따라서 방목 소의 적혈구(RBC) 수치와 헤마토크리트(HCT) 수치는 방목하지 않은 소에 비해 기간 내내 유의미하게 낮았다(P < 0.05). 또한, RBC, hemoglobin (Hb), HCT는 T. sergenti 양성군이 T. sergenti 음성군보다 유의미하게 낮았다(P < 0.05). T. sergenti는 한국에 널리 퍼진 진드기 매개 병원체이다. 산악 지역에서 소를 방목하는 것은 T. sergenti 감염의 증가와 밀접한 관련이 있으며(RR = 3.4, P < 0.001) 결과적으로 RBC 수와 HCT가 감소한다. 따라서 이러한 결과는 한국 산간지역의 한우가 혈액학적 변이를 일으킬 수 있는 T. sergenti 감염 위험이 높다는 것을 시사한다. 이 연구를 통해 T. sergenti 감염에 대한 예방 전략의 필요성이 대두된다. 목초지에서 소를 기르는 것은 동물 복지와 비용 절감에 유익한 것으로 알려져 있다. 그러나 방목은 타일레리아증과 같은 진드기 매개 질병에 걸릴 위험도 크다. 제3장에서는 이러한 질병 및 관련 임상 증상에 대한 ivermectin의 효능을 평가했다. 방목 농장에서 총 68마리의 소를 선택하여 예방적 구충제를 투여하지 않은 대조군(17마리)과 이버멕틴 처리군(51마리)으로 나누었다. 두 그룹 사이의 Theileria sergenti 감염률과 RBC 수, 헤마토크리트 값 및 헤모글로빈 농도 같은 적혈구(RBC) 프로필을 봄(방목 전)과 여름(방목 중)에 비교했다. Major piroplasm surface protein(MPSP) 유전자의 PCR 증폭에 기초하여 12두 소가 T. sergenti 감염에 대해 양성이었다. 계통발생학적 분석 결과, 본 연구에서 확인된 분리주는 3가지 MPSP 유형(1, 2 및 7)으로 구성되어 있음이 밝혀졌다. 방목 중 대조군의 T. sergenti 감염률은 ivermectin 처리군보다 3배 더 높았다. 또한 방목 중 RBC 프로필 수치의 차이는 ivermectin 처리군보다 대조군에서 더 컸다. 특히 대조군에서 헤마토크리트 값이 유의하게 감소하였다. 이 연구의 결과는 ivermectin이 방목 소에서 T. sergenti 감염과 RBC 용혈에 대한 예방 효과가 있음을 보여주었다.

Molecular identification of tick-borne pathogens in wild animals from the Republic of Korea : 한국 야생동물에 존재하는 진드기 매개 병원체의 분자적 진단

한유정 경북대학교 대학원 2016 국내석사

이 논문은 한국의 야생동물 구조 센터 12곳 중 6개 지역 (경남, 경북, 충남, 충북, 전북 및 울산)으로 부터 34마리의 야생동물에서 수집한 혈액에서 진드기매개 병원체에 대해 조사하였다. 총34마리의 야생동물은 18마리의 고라니 (Hydropotes inermis argyropus), 15 마리의 너구리 (Nyctereutes procyonoides koreensis), 그리고 한 마리의 노루 (Capreolus capreolus) 였다. PCR 분석에서 11마리의 고라니와 한 마리의 노루는 Anaplasma spp. 감염, 14마리 고라니와 한 마리의 노루에서 Theileria spp. 감염이 확인 되었다. 이 중에서 10마리의 고라니와 한 마리의 노루에서 두 가지 병원체 (Anaplasma spp. 및 Theileria spp.)의 중복감염이 확인되었다. 다른 진드기매개성 병원체인 Ehrlichia spp. 와 Rickettsia spp. 감염은 수집된 야생동물에서 확인되지 않았다. 계통발생분석에서 Anaplasma sp., A. bovis, A. phagocytophilum, Theileria sp., T. cervi 및 T. luwenshuni의 병원체들이 확인되었다. 본 연구결과에 의하면 고라니에서 T. luwenshuni 가 가장 많은 발생을 보이는 병원체로 나타났으며, 인수공통전염병의 병원체인 A. phagocytophilum이 고라니에서 상당수 감염되어 있는 것으로 확인 되었다. 흥미롭게도 본 연구는 한국 너구리가 아나플라즈마증의 보균자로서 역할을 할 수 있고, 또한 A. bovis의 전염은 숙주의 종에 제한되지 않는 것을 증명하였다. 노루에서는 T. cervi Type F 에 감염된 것이 확인되었다. 본 연구 결과는 한국 너구리에서 A. bovis의 감염, 노루에서 T. cervi 및 고라니에서 T. luwenshuni감염에 대한 최초의 보고로서, 야생동물이 진드기매개 병원체의 보균자일 가능성을 암시하고 있으며, 사람과 가축에게 진드기매개성 질병의 전파에 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. In this study, we investigated tick-borne pathogens in blood samples collected from 34 wild animals including 18 Korean water deer (Hydropotes inermis argyropus), 15 Korean raccoon dogs (Nyctereutes procyonoides koreensis), and one roe deer (Capreolus capreolus) from six different regions in the Republic of Korea. PCR analysis identified Anaplasma spp. infection in 11 Korean water deer, one roe deer, and one Korean raccoon dog. Theileria spp. infection was detected in 14 Korean water deer and one roe deer. Of these, ten Korean water deer and one roe deer were positive for co-infection with two pathogens (Anaplasma spp. and Theileria spp.). Ehrlichia spp. and Rickettsia spp. infections were not detected in any of the sampled animals. Genetic analysis showed that Anaplasma sp., A. bovis, A. phagocytophilum, Theileria sp., T. cervi, and T. luwenshuni were present in these animals. The results showed that T. luwenshuni was the most prevalent species found in Korean water deer. Interestingly, our findings demonstrated that Korean raccoon dogs can serve as a reservoir for anaplasmosis, indicating that transmission of A. bovis is not restricted to host species. The roe deer sample was found to be infected with a type-F T. cervi strain. To our knowledge, this study is the first report of the infections of A. bovis in Korean raccoon dog, T. cervi in roe deer, and T. luwenshuni in Korean water deer. These results demonstrate that wild animals represent possible reservoirs for these tick-borne pathogens, thus playing an important role in transmission of tick-borne diseases (TBDs) to domestic animals, livestock, and humans. This highlights the risk of introducing new pathogens and the role of wild animals in the transmission and spread of zoonotic TBDs pathogens.

Theileria sergenti DNA probe 제작을 위한 기초 연구

김명철 全北大學校 大學院 1993 국내석사

This study was attempted to develope a method for detection of Theileria sergenti infection on the basis of hybridization of parasite DNA with a probe. For construction of a T sergenti genomic library, T sergenti DNA was digested completely with Bam-HI and the fragments were ligated into the Bam-HI site of pUC-19 before transformation of Escherichia Coli strain JM83. To detect clones containing the parasite's DNA sequences, a genomic DNA library of T sergenti constructed in pUC-19 was screened by cracking and Southern hybridization. Seven colonies were chosen from 29 colonies which were screened by transformation of Escherichia coli strain JM83. Seven transformants were comfirmed from seven colonies by cracking. The sizes of transformants were about 5 Kb, 5.7 Kb, 4.3 Kb, 7.75 Kb, 7.85 Kb, 5.8 Kb, 3.8 Kb, respectively. DNA inserts, T sergenti DNA, and bovine DNA were hybridized with radio-labelled T sergenti DNA. Two (pT_4, pT_1) of the seven inserts and T sergenti DNA reacted strongly but another 5 inserts and bovine DNA showed weak reaction. All of the DNA inserts were not reaction, but T sergenti DNA were very weakly and bovine DNA were strongly reacted to hybridization with radio-labelled bovine DNA. Therefore, we obtained total 7 T sergenti DNA fragments in this study.

Theileria sergenti merozoite의 합성 polypeptide 백신의 야외 실험

정재명 전북대학교 대학원 1995 국내석사

The immunized six calves(5-6 month old) with 100 /dose of 34 kDa, 45 kDa polypeptide and Theileria sergenti merozoite vaccine(protein contend 100 /dose) which were mixed with aluminium hydroxide to elicit antibodies were challenged in field with tick in endemic pasture of theileriosis from March to September 1994 respectively. All animals were monitored for the erythrocyte numbers, parasitemia, hematocrit and the specific antibody reactions. The vaccinated cattle with 34 kDa polypeptide showed more slightly changes in the erythrocyte numbers, hematocrit, hematological changes after vaccination and challenged than those of nonvaccinated cattle. The cattle were challenged with the tick in the pasture during the summer. The immunological responses demonstrated that vaccination elicited a significant. specific antibody to T. sergenti merozoite soluble antigen due to the 34 kDa and 45 kDa polypeptides vaccine. Immunization with the 34 kDa polypeptide inhibited the production of antigen in cattle infected naturally with T. sergenti while the specific antibody still detected the antigen in the non-immunized cattle. Immunization with 45 kDa polypeptide also inhibited the production of the specific antibody induced by 34 kDa antigen from T. sergenti. However it produced 75 kDa antigen. The vaccine derived from the merozoite of T. sergenti produced the 34 kDa. It was very sensitively detected. The control group which had natural theileriosis revealed 75 kDa and 43 kDa and 32 kDa. The specific bands, 75 kDa antigen from the vaccine derived from the merozoite and 34 kDa antigen from the synthesized polypeptide vaccine were not showed in the natural infection. The vaccine derived from the synthetic polypeptide were evaluated for efficacy and imunogenicity in the pasture infected with tick.