Isolation and characterization of Staphylococcus strains from traditional Korean fermented soybean foods

전지훈 중앙대학교 대학원 2025 국내석사

Staphylococcus 속은 간장과 같은 전통적인 한국 발효 식품에서 우점하는 것으로 알려져 있지만, 이들의 포괄적인 특성과 안전성에 대한 연구는 제한적이다. 따라서 본 연구에서는 전통적인 한국 발효 식품인 간장에서 Staphylococcus 균주를 분리하고, 게놈 시퀀싱을 통한 유전체 분석과 다양한 표현형 분석을 통해 콩 발효 식품에 존재하는 Staphylococcus 균주의 특성과 안전성을 분석했다. 미생물 군집 분석 결과 Staphylococcus는 간장에서 우점하였고, 간장에서 균주를 분리하여 배양했을 때도 동일한 결과가 관찰되었다. 분리된 균주의 계통학적 분석에서 S. equorum, S. xylosus, S. pseudoxylosus, S. shinii, S. nepalensis, 그리고 S. saprophyticus를 포함한 6종이 확인되었으며, 이전에는 특성이 밝혀지지 않은 신종 2종이 발견되었다. 모든 분리된 Staphylococcus 균주는 D-포도당, D-과당, D-갈락토오스, 수크로스, D-리보스, D-말토오스와 같은 당을 대사하는 데 필요한 모든 유전자를 보유하고 있었고, 알코올, 아세토인, 다이아세틸과 같은 풍미 관련 화합물을 생성하는 완전한 경로를 가지고 있었으며, 단백질 분해 효소 유전자를 보유하고 있어 한국 발효 식품의 풍미 형성에 영향을 미칠 수 있음을 확인했다. 실제 효소 활성 분석 결과에서도 대부분 균주가 지질과 단백질 분해에 활성을 보임으로써 이를 뒷받침하였다. 그러나 모든 분리된 Staphylococcus 균주는 두 개 이상의 항생제 내성 유전자를 보유하고 있었으며, 분리균의 절반은 하나 이상의 항생제에 내성을 보였고 일부 균주에서는 β-용혈이 관찰되어 안전성 측면에서 특별한 주의가 필요했다. 이 연구의 결과는 Staphylococcus가 전통적인 한국 발효 콩 식품의 발효과정에서 풍미 성분 생산에 긍정적으로 기여할 수 있지만 안전성에 부정적인 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. Staphylococcus species are known to be prevalent in traditional Korean fermented soybean foods, such as ganjang. However, research on their comprehensive characteristics and safety remains limited. Therefore, in this study, Staphylococcus strains were isolated from ganjang, traditional Korean soybean fermented foods, and the characteristics and safety of Staphylococcus strains existing in soybean fermented foods were analyzed through genome sequencing and various phenotypic analyses. The results based on cultured and uncultured techniques revealed that Staphylococcus was dominant in ganjang. The phylogenetic analysis of the isolated strains identified six species, including S. equorum, S. xylosus, S. pseudoxylosus, S. shinii, S. nepalensis, and S. saprophyticus, along with the discovery of two previously uncharacterized species. All isolated Staphylococcus strains harbored the genes required for metabolizing sugars, including D-glucose, D-fructose, D-galactose, sucrose, D-ribose, and D-maltose. They also had complete pathways for producing flavor-related compounds such as alcohol, acetoin, and diacetyl, as well as genes encoding protein-degrading enzymes. These findings suggest their potential role in flavor of Korean fermented foods. Furthermore, enzyme activity tests revealed most strains were degrading lipids and proteins, consistent with the presence of the corresponding genes in the isolated strains. However, all Staphylococcus strains possessed two or more antibiotic resistance genes and half of the isolates exhibited resistance to at least one antibiotic. Moreover, β-hemolysis was observed in some strains. These findings indicate that Staphylococcus may play a role in the production of flavor components in Korean fermented soybean foods, but it has potential to negatively impact food safety warrants.

Alternative Antibacterial Strategy Against Multidrug-Resistant Staphylococcus pseudintermedius Using Ligilactobacillus animalis and Evaluation through a Novel Rat Model of Acute Osteomyelitis

박성용 건국대학교 대학원 2024 국내박사

정형외과에 있어 감염성 골수염은 매우 심각한 합병증 중 하나이다. 수의학에서 나타나는 골수염의 주요 원인은 Staphylococcus pseudintermedius로 알려져 잇다. 반려동물에서 메티실린 내성 S. pseudintermedius (MRSP)가 보고되었으며 최근에는 다양한 항생제에 저항성을 가지는 다제내성 (MDR) S. pseudintermedius가 주요한 문제로 부각되고 있다. 이러한 저항성의 심화는 대체적인 항생물질에 대한 요구를 강화하며 최근 연구 경향들은 이러한 물질을 발견하고 개발하는 데에 집중되고 있다. 박테리오신과 같은 유익균 유래의 항생물질은 기존의 항생제에 대해 유망한 대체제로 주목받고 있다. 본 연구는 Ligilactobacillus animalis SWLA-1과 무세포 상층액의 Staphylococcus 억제 효과를 평가하였다. 제 1장에서는 다제내성 S. pseudintermedius에 강한 억제작용을 보이는 후보 균주를 선발하기 위한 생체외 시험을 진행하였다. 총 다섯 L. animalis 균주를 평가하였으며 L. animalis SWLA-1이 가장 우수한 억제효과를 보여 추가 실험을 위한 균주로 선별되었다. 다제내성균 역할을 위한 세균을 선발하기 위해 건국대학교 부속동물병원에 방문한 환자에서 분리된 다섯 종류의 S. pseudintermedius 임상 균주에 대해 항생제 감수성 테스트를 진행하였다. 열한 종류의 항생제를 이용하였으며 S. pseudintermedius KUVM1701GC가 가장 많은 항생제에 저항성을 보여 다제내성균 역할로 선별되었다. 이어서 S. pseudintermedius KUVM1701GC에 대한 L. animalis SWLA-1과 무세포 상층액의 항생 효과를 평가하였으며 억제효과가 확인되었다. 추가적으로 CCK-8 assay를 진행하여 대조군과 무세포 상층액 처치군 간의 세포 생존력이 유의미한 차이가 없는 것으로 확인되었다 (p>0.05). 이 결과를 통해 L. animalis SWLA-1의 무세포 상층액이 쥐의 뼈모세포와 근육모세포에 독성이 없음을 확인하였다. 전체적으로 종합하여, L. animalis SWLA-1의 무세포 상층액은 동물에서 유효성을 평가할 준비가 되었다고 판단되었다. 제 2장에서는 L. animalis SWLA-1의 무세포 상층액의 항생 효과가 생체에서 평가되었다. 이를 위해 S. pseudintermedius KUVM1701GC를 이용한 새로운 급성 골수염 랫드 모델이 정립되었으며 처치된 물질에 따라 음성대조군, phosphate buffered saline (PBS) 처치군, Man Rogosa and Sharpe broth (MRS) 처치군, 클린다마이신 처치군, L. animalis SWLA-1의 무세포 상층액 처치군으로 구분하였다. 각 물질은 콜라겐 패치를 이용하여 적용되었다. 랫드를 수술 후 7일차에 육안적, 방사선학적, 조직병리학적, 미생물학적 평가를 진행하였다. 모든 평가에서 점수가 높을수록 항생효과가 떨어지는 것으로 판단하였다. 육안평가에서 PBS 및 MRS 처치군은 음성대조군에 비해 유의미하게 높은 점수를 받았다 (p<0.0001). 무세포 상층액 처치군은 음성대조군과 유의미한 차이를 보이지 않았다 (p >0.05). MRS 처치군은 클린다마이신 및 무세포 상층액 처치군보다 높은 점수를 받았다 (p<0.001). 방사선 평가에서는 각 군별 유의미한 차이가 존재하지 않았으며 (p >0.05), 모든 군에서 방사선학적 병변이 확인되었다. 조직병리학 평가에서 PBS 및 MRS 처치군은 음성대조군에 비해 유의미하게 높은 점수를 받았다 (p <0.0001). 클린다마이신 처치군은 PBS 및 MRS 처치군보다 유의미하게 낮은 점수를 받았다 (p <0.001). 무세포 상층액 처치군은 PBS 및 MRS 처치군보다 유의미하게 낮은 점수를 받았다 (p <0.001, p <0.01). 미생물학 평가를 통해 위 결과들이 보완되었다. 무세포 상층액 처치군의 골수는 PBS 및 MRS 처치군보다 유의미하게 낮은 균락수를 보였고 (p <0.0001, p <0.001), 음성대조군과는 균락수 간의 유의미한 차이가 없었다 (p >0.05). 수술에 사용한 스크류의 균락수 결과는 골수와 유사했다. 그러나 무세포 상층액 처치군이 MRS 처치군과 유의미한 차이가 없고 (p >0.05) 음성대조군보다는 유의미하게 높은 균락수를 보였다 (p <0.05). 이는 S. pseudintermedius의 바이오필름의 영향으로 판단되었다. 위 결과들을 종합하여 볼 때, L. animalis SWLA-1의 무세포 상층액은 확실한 Staphylococcus 억제 효과를 가지고 있으며 동물에서의 Staphylococcus 감염에 대한 대체적인 항생제재로 사용될 수 있는 가능성을 확인하였다. 더불어 콜라겐 패치는 L. animalis SWLA-1의 무세포 상층액의 효과적인 전달 매개체로 이용될 수 있는 가능성이 확인되었다. 결론적으로 L. animalis SWLA-1은 동물에서 발생하는 감염성 골수염의 주요 원인체인 다제내성 S. pseudintermedius에 대한 항생 효과를 보였다. S. pseudintermedius를 이용한 새로운 급성 골수염 랫드 모델이 정립되었으며 L. animalis SWLA-1의 무세포 상층액은 콜라겐 패치를 통해 적용되어 생체 내에서 유의미한 Staphylococcus 억제 효과를 보였다. 이를 통해 이번 연구는 수의학에서 다제내성 균에 대한 대체적인 항생물질 연구에 대한 초석이 될 수 있을 것이다. In orthopedic surgery, infectious osteomyelitis represents one of the most serious complications. Staphylococcus pseudintermedius is the predominant causative agent of veterinary osteomyelitis. Methicillin-resistant S. pseudintermedius (MRSP) has been reported in companion animals; however, recently, Multidrug-resistant (MDR) S. pseudintermedius has emerged as a growing concern due to its resistance to various commercial antibiotics. The increasing resistance has heightened the demand of alternative antimicrobial agents, with recent research trends emphasizing their discovery and development. Probiotic-derived antimicrobial substances, such as bacteriocins, present promising alternatives to traditional antibiotics. This study assesses the anti-staphylococcal properties of Ligilactobacillus animalis SWLA-1 and its cell-free supernatants (CFS) were evaluated. In chapter I, in vitro test was performed using a spot agar assay to select candidate bacterial strains that exhibited strong antibacterial activity against MDR S. pseudintermedius. Out of five L. animalis strains evaluated, L. animalis SWLA-1 was chosen for its anti-staphylococcal activity against S. pseudintermedius. For the MDR indicator bacteria, total of five S. pseudintermedius strains isolated from a clinical sample of Konkuk University Veterinary Teaching Hospital (KUVTH) were evaluated with antimicrobial susceptibility profiles. Total of 11 antibiotics were tested using the microdilution method. S. pseudintermedius KUVM1701GC showed resistance to the most diverse range of antibiotics and was selected as MDR indicator bacteria. Antimicrobial effect of L. animalis SWLA-1 and its CFS against S. pseudintermedius KUVM1701GC was evaluated and showed susceptibility to the staphylococcus. Additionally, the CCK-8 assay revealed no significant differences between cell viability of control group and CFS treated groups (p>0.05). This result implies that CFS of L. animalis SWLA-1 is non-toxic to murine osteoblast and myoblast. Considering these results, it was determined that the L. animalis SWLA-1 derived CFS is ready to prove its efficacy in animals. In chapter II, antimicrobial activities of CFS from L. animalis SWLA-1 was evaluated in vivo. A novel rat model of acute osteomyelitis, induced by S. pseudintermedius KUVM1701GC was developed and divided into group according to the treatment; negative control, phosphate buffered saline (PBS), Man Rogosa and Sharpe broth (MRS), clindamycin, and CFS of L. animalis SWLA-1. Every material was treated via collagen patch. Rats underwent macroscopic, radiographic, histopathologic, and microbiologic assessments on the seventh day post-surgery. With every evaluation, it was determined that higher scores across all evaluations indicate a reduced antibacterial effects. In macroscopic evaluation, group treated with PBS or MRS had notably higher scores compared to negative control group (p<0.0001). Group treated with CFS showed no significant differences compared to Staphylococcus-negative group (p>0.05). But PBS treated group and clindamycin or CFS treated group also showed no significant differences (p>0.05). MRS treated group showed higher scores than clindamycin or CFS treated group (p<0.01). In radiographic evaluation, there were no significant differences of score among experimental groups (p>0.05) and radiographic lesion was observed in every group. In histopathologic evaluation, groups treated with PBS or MRS showed notably higher scores than Staphylococcus-negative group (p<0.0001). The clindamycin treated group showed significantly lower scores than PBS or MRS treated groups (p<0.001). CFS treated group showed significantly diminished scores compared to the PBS (p<0.001) or MRS treated group (p<0.01). Microbiologic evaluation compensated the results. Bone marrow of CFS treated group showed significantly lower colony count than PBS (p<0.0001) or MRS (p<0.001) treated group. And there was no significant difference between Staphylococcus-negative group and CFS treated group (p>0.05). Bacterial colony counts from screws showed similar results to bone marrow. However, CFS treated group showed no significant differences to MRS treated group (p>0.05) and notably higher colony counts than Staphylococcus negative group (p<0.05). This may be due to the biofilm of S. pseudintermedius. These results indicated that the CFS from L. animalis SWLA-1 exhibited significant anti-staphylococcal properties, suggesting its potential as an alternative to antibiotics for treating staphylococcal infection in animals. Moreover, the collagen patch demonstrated potential as an effective delivery system for the CFS of L. animalis SWLA-1. In conclusion, L. animalis SWLA-1 showed notable antibacterial activity against multidrug-resistant S. pseudintermedius, a primary causative agent of infectious osteomyelitis in animals. A novel rat model of acute osteomyelitis induced by S. pseudintermedius was successfully established, and CFS of L. animalis SWLA-1, when delivered via a collagen patch, demonstrated significant anti-staphylococcal activity in vivo. This study sets the stage for further veterinary researches focusing on alternative antimicrobials against multidrug-resistant bacteria.

Interaction of interspecies : cutibacterium and staphylococcus species on the skin microbiome

김주빈 중앙대학교 대학원 2021 국내석사

피부는 외부 침입자로부터 우리를 보호하는 첫 번째 방어 기작이며, 다양한 미생물이 서식하는 곳이다. 지성 피부에는 Cutibacterium 이, 피부의 습한 부위에는 Staphylococcus 와 Corynebacterium 이 우점하고있다. 이와 같이, 피부에서의 미생물 군집 및 구성은 많이 연구되었지만, 피부 미생물의 종간 상호 작용은 연구가 거의 이루어지지 않았다. 이 연구에서 우리는 (i) 사람의 피부에서 분리된 Cutibacterium 과 Staphylococcus 와의 상호 작용을 확인하고 (ii) MinION 장치로 진행한 유전체 시퀀싱을 통해 상호 작용과 관련된 유전자를 발굴할 것이다. Staphylococcus 와 Cutibacterium 의 분리 및 동정을 위해 각각 23명과 28명의 피험자를 모집했다. 면봉과 코팩을 이용하여 샘플을 수집했으며, Tryptic Soy agar, Mannitol salt agar 및 Brucella Anaerobic agar를 배양 배지로 사용했다. Staphylococcus aureus 와 Cutibacterium 및 Staphylococcus 와의 상호 작용을 확인하기 위해 pCM29를 삽입한 S. aureus USA300을 사용했으며, 분리 동정된 균주들과 4시간동안 공동배양을 진행했다. 초기 샘플들의 광학 밀도는 0.1 로 설정했으며, S. aureus USA300의 형광 발현 정도는 InVivo Smart-LF 장치를 사용하여 검출하였다. 유전체 시퀀싱은 MinION 장치를 이용하여 분석을 수행하였고, 그 결과로 상호 작용과 관련된 유전자를 발굴했다. 피부에서 총 198 개의 Staphylococcus 와 125 개의 Cutibacterium 을 분리하였고, 시퀀스가 서로 겹치지 않는 50 개의 Staphylococcus 와 40 개의 Cutibacterium 을 선정하여 피부 pH에 따른 피부 미생물들간의 종간 상호작용을 알아보았다. 두 가지 종의 공동 배양을 통해 우리는 19 개와 10 개의 Staphylococcus 샘플과, 2 개 및 8 개의 Cutibacterium 샘플이 S. aureus 의 형광 발현 정도를 감소시키는 것을 확인하였고 (감소 그룹), 6 개와 2 개의 Staphylococcus 샘플과 7 개 및 5 개의 Cutibacterium 샘플이 S. aureus의 형광 발현 정도를 증가 시켰음을 확인했다 (증가 그룹). pH 7.2 의 Columbia 배지에서 S. aurues 와 Cutibacterium 을 공동 배양 했을 때, 증가 그룹에서만 5개의 유전자를 발굴하였고, pH 4.5 의 Columbia 배지에서 S. aurues 와 Staphylococcus 샘플을 공동 배양한 경우는 증가 그룹과 감소 그룹에서 각각 6 개의 유전자를 발굴하였다. The skin is the first line of defense against foreign invaders and is home to diverse microorganisms. The sebaceous sites of the skin are dominated by Cutibacterium, and in the moist areas, Staphylococcus and Corynebacterium were abundant. Although the microorganism compositions of every skin site were well-studied, the interspecies interactions of the skin microorganisms were poorly understood. In this study, we identify (i) the interactions of Staphylococcus aureus with Cutibacterium and Staphylococcus species isolated from the skin and find out (ii) the pathways or genes related to the interactions by Nanopore MinION sequencing. A total of 23 and 28 subjects were recruited for isolation of Staphylococcus and Cutibacterium, respectively. Samples were collected with cotton swabs and nose strips. Tryptic Soy agar, Mannitol salt agar and Brucella Anaerobic agar were used as culture media. To identify the interactions of Staphylococcus aureus with Cutibacterium and Staphylococcus, we use S. aureus USA300 containing pCM29 and co-culture with isolates for 4 h. At 0 h, the optical density (OD) of samples was 0.1, and fluorescence intensities of S. aureus were detected using InVivo Smart-LF device. Genome sequencing was performed using MinION device with Nanopore technology to identify the pathways and genes related to the interactions. A total of 198 Staphylococcus and 125 Cutibacterium were isolated from the skin, and 50 Staphylococcus and 40 Cutibacterium were selected to find out the interactions on the skin of acne patients and healthy individuals. Through intergenera and interspecies co-culture, we find out the 19 and 10 Staphylococcus, 2 and 8 Cutibacterium isolates decreased (Descending group) and 6 and 2 Staphylococcus, 7 and 5 Cutibacterium isolates increased (Ascending group) the fluorescence intensities of S. aureus at two kinds of skin pH environment. In Cutibacterium samples, only 5 genes were identified in the Ascending group at pH 7.2 and in Staphylococcus samples, every 6 genes were identified in the Ascending group and Descending group at pH 4.5, respectively.

Characterization of pathogenic modulation through bacterial-fungal interactions in the skin microbiome

류은선 Graduate School, Yonsei University 2025 국내박사

피부 미생물군 내에서 일어나는 세균-진균 사이의 복잡한 상호작용은 피부 건강과 질병에 중추적인 역할을 한다. Staphylococcus와 Malassezia는 우점하는 피부미생물로, 병원성과 면역 반응을 조절하며 상호작용하는것으로 알려져 있지만, 상호작용 기저에 있는 구체적인 메커니즘은 아직 완전히 이해되지 않았다. 따라서 피부 건강과 질병 진행에 미치는 미생물 상호작용의 역할을 규명하기 위한 종합적인 연구가 필요하다. 본 연구는 간단한 in vitro 공동배양에서 재구된 인간 표피(RHE)모델에 이르기까지 다양한 실험 환경을 사용하여 Staphylococcus와 Malassezia 간의 미생물 역학을 탐색하였다. 통제된 액상 공동배양 시스템에서 M. restricta는 Staphylococcus 종에 따라 상이한 영향을 미쳤으며, 이러한 상호작용의 결과는 표현형적 특성으로 분석할 수 있었다. 실험실 균주인 S. aureus NCTC 8325-4는 M. restricta에 거의 반응하지 않았으나, S. epidermidis는 활발한 상호작용을 보였다. M. restricta에 대한 S. aureus NCTC 8325-4의 최소 반응은 생물막 환경에서도 일관되게 나타났다. S. aureus 균주의 strain수준에서 병원성에 따른 공간적 상호작용을 비교하기 위해, 한천 공동배양 시스템에서 콜로니의 공간역학을 평가하였다. S. aureus NCTC 8325-4와 달리, 병원성 균주인 S. aureus USA300은 M. restricta와 공동 배양 시 향상된 운동성으로 독특한 공간 구조를 형성하였다. 이러한 행동은 S. aureus가 운동성과 생물막 형성의 이점을 활용하여 감염성을 향상시키는 방법을 강조한다. 최종 목표인 다중 미생물 상호작용이 숙주의 면역 반응에 미치는 영향을 종합적으로 이해하기 위해, S. aureus USA300과 M. restricta를 3D 재구성 인간 표피(RHE)에 동시에 감염시켰다. 그 결과, 공동 감염이 염증성 사이토카인 생성 증가 및 피부 장벽 무결성에 영향을 미친다는 것을 확인하였다. 이는 미생물 상호작용이 단순한 경쟁이나 협력을 넘어 숙주 방어 기전에 적극적으로 영향을 미친다는 것을 시사한다. 이러한 결과들을 통해 피부 세균과 곰팡이 사이의 복잡한 관계에 대한 새로운 통찰력을 얻을 수 있었다. M. restricta가 S. aureus의 병원성을 조절하고 숙주 면역 반응에 미치는 영향을 밝힘으로써, 향후 박테리아-진균 상호작용을 제어하여 피부 건강을 유지하거나 회복하는 치료 접근법의 기초를 마련하였다. Complex interactions between bacteria and fungi within the skin microbiome are essential for determining skin health and disease. Among the predominant microorganisms, Staphylococcus and Malassezia interact in ways that influence the pathogenicity and immune responses. The mechanisms underlying this self-organization among bacteria remain largely unknown. Comprehensive investigations are required to understand how microbial interactions affect skin health and disease progression. This study employed a diverse experimental environment to investigate the microbial dynamics of Staphylococcus and Malassezia restricta. The study ranged from primary in vitro co-cultures to advanced 3D reconstructed human epidermis (RHE) models. In a controlled liquid co-culture system, the presence of M. restricta resulted in differential effects on Staphylococcus species, and the results of this interaction could be analyzed by phenotypic characterization. S. aureus NCTC 8325-4 exhibited minimal phenotypic response to M. restricta, unlike the active interactions observed with S. epidermidis. The minimal response of S. aureus NCTC 8325-4 to M. restricta was consistent, even in biofilm environments. To compare the spatial interactions of the S. aureus strains based on pathogenicity, we evaluated the spatial dynamics of the two colonies using an agar co-culture system. In contrast to the laboratory strain S. aureus NCTC 8325-4, the pathogenic strain S. aureus USA300 forms a unique spatial structure with enhanced motility with M. restricta. This highlights how S. aureus exploits motility and biofilm formation to enhance infectivity. The ultimate goal of this study was to comprehensively understand how polymicrobial interactions influence host immune responses. RHE was simultaneously infected with S. aureus USA300 and M. restricta. RHE demonstrated that co-infection increased inflammatory cytokine production and affected the skin barrier integrity. This dissertation provides novel insights into the complex relationships between skin bacteria and fungi. Elucidating how M. restricta regulates S. aureus pathogenicity and affects host immune responses establishes a foundation for future therapeutic approaches to control bacterial-fungal interactions in skin health.

인간 피부 유래 Staphylococcus sp. 및 Skermanella sp. 신종 규명

최유진 창원대학교 2022 국내석사

Many microorganisms reside on the human skin. Gram-positive bacteria belonging to the genera Staphylococcus, Micrococcus, Streptococcus, Corynebacterium, Propionibacterium, Cutibacterium and gram-negative bacteria belonging to the genera Moraxella, Veillonella are dominatly present on the human skin. Although skin microbiome are generally harmless organisms coexisting with humans, the harmony can become disrupted by the administration of antibiotics, weaken immunity, or the commensals could turn into opportunistic bacteria due to environmental factors such as personal hygiene habits and cause pathogenic infections. Therefore, it is important to study the skin flora and to elucidate the unknown species member in skin microbiome. Novel bacterial species belonging to Staphylococcus와 Skermanella were isolated during the study of microorganisms inhabiting on human skin. By 16S rRNA gene sequence homology comparison with Staphylococcus warneri NCTC 11044T, strain SB1-57 and HL28 belonging to Staphylococcus showed more than 99% sequence similarities. However, morphological differences between the three strains were evident when colonies were observed. To identify genomic differences, the genome sequences of strains SB1-57 and HL28 were analyzed using Illumina and Oxford nanopore sequencing technology platforms. The ANI values ​​between the strains SB1-57, HL28 and S. warneri NCTC 11044T were 94.09% and 96.03%, respectively, and the dDDH values ​​were 55.1% and 66.9%, respectively, which were below the classification criteria of 70% species. Phenotypic, genotype, chemotaxonomic and physiological experiments were performed to investigate differences other than morphological differences between strains SB1-57, HL28 and S. warneri NCTC 11044T. The results suggested that strains SB1-57 (=KCTC 43302) and HL28 (=KCTC 43381) are novel species belonging to the genus Staphylococcus. Strain TT6 belonging to the genus Skermanella showed more than 98% 16S rRNA gene sequence homology with Skermanella rosea M1T, Skermanella mucosa 8-14-6T and Skermanella pratensis W17T. The genome sequences of strain TT6 was analyzed using PacBio and Illumina sequencing technology platforms. In addition, the genome sequencing of S. rosea M1T, S. mucosa 8-14-6T without genome sequence information was performed using Illumina and Oxford nanopore sequencing technology platforms. The ANI values ​​and dDDH values ​​between strains TT6, S. rosea M1T, S. mucosa 8-14-6T and S. pratensis W17T were below the threshold values ​​for classifying bacteria as novel species. Phenotypic, genotype, chemotaxonomic and physiological experiments were performed to investigate the differences between strains TT6 and S. rosea M1T, S. mucosa 8-14-6T, S. pratensis W17T. The results suggested that strain TT6 (=KCTC 82306) is novel species belonging to the genus Skermanella.

Distribution of Exfoliative Toxin Genes of Staphylococcus intermedius Group (SIG) Isolated from Dogs

Kim, Jeong-Hee 제주대학교 대학원 2022 국내석사

Staphylococcal exfoliative toxins (ETs) are known to digest desmoglein-1, a desmosomal cell–cell adhesion molecule, thus causing intraepidermal splitting in human bullous impetigo, staphylococcal scalded skin syndrome(SSSS) and swine exudative epidermitis. Staphylococcus pseudintermedius, one of members of Staphylococcus intermedius group (SIG), has a few ETs, such as siet, expA (formerly exi) and expB. The aim of this study was to determine the distribution of ET genes in SIG isolated from diseased, and healthy dogs. Total 135 and 73 isolates of SIGs were identified in diseased dogs and healthy dogs. The isolates of diseased dogs were taken from lesions related to eyes, nose, ears, skin, interdigit and urine, and those of healthy dogs were isolated from nose, mouth and skin. The siet gene not related to skin exfoliation was most common in SIGs isolated from both groups, but the isolates from diseased dogs (89.6%) had much higher siet gene then those from healthy dogs (37.0%). In diseased dogs and helathy dogs, expA and expB genes were found in 29 (21.5%) and 7 (9.6%), and 8 (5.9%) and 6 (8.2%) isolates, respectively. In diseased dog group, siet gene was found in 100% of nose and urine samples and the prevalence rate was high in most other samples. expA gene was detected in 21.3% of skin, 37.5% of interdigit, 19.4% of ear, 23.1% of nose, 12.5% of eyes and 33.3% of urine. expB gene was present in 23.1% of nose, 6.6% of skin, 2.8% of ears. In healthy dogs, siet gene was found 40.0% of nose, 33.3% of mouth and 37.1% of skin samples. expA gene was found in mouth and skin samples, and expB gene was present in nose, mouth and skin samples. SIGs (65.2%) with only the siet gene were the most common, while in healthy dogs, those without any toxins (53.4%) were prominent. In particular, 19.3% of the isolates from the diseased dog showed siet-expA combination, and expA-expB combination was found 1 strain of healthy dog-derived SIG. The siet-expA-expB combination was found in 2 and 1 isolates from the diseased dogs and healthy dogs, respectively. In conclusion, our results showed that expA and expB genes were found in SIGs from various leisons of both groups and there were expA-expB combination in some organisms. Since S. pseudintermedius is well-known normal flora of dog and could cause opportunistic infection in dogs and human, especially in immune suppressed patients. This subject can be effective for help of diagnosis of SIGs induced disease in veterinary medicine and risk control for dog owners who have underlying medical problems like immunosuppression. Staphylococcus의 exofolative toxin은 데스모좀 세포 접착 분자인 desmoglein-1을 선택적으로 소화하여 사람에서 수포성 농가진, SSSS 및 돼지 삼출성 표피염을 유발하는 것으로 알려져 있다. 그 중 수의학, 특히 개에서 자주 분리되고 있는 기회감염균인 Staphylococcus pseudintermedius 는SIG(Staphylococcus intermedius) 그룹에 속하는데, siet, expA(구 exi), exp B와 같은 몇 가지 exfoliative toxin(ET)를 보유하고 있다. 본 연구는 다양한 질병을 앓고 있는 개와 건강한 개에서 임상적으로 분리된 SIG에서의 exfoliative toxin 유전자의 분포를 확인하였다. 먼저, 질병에 걸린 개에서 총 135개, 건강한 개에서 73개의 SIG 분리주를 확보하였다. 샘플은 질병에 걸린 개의 눈, 코, 귀, 피부, 지간 및 소변과 관련된 병변에서, 건강한 개의 코, 입 및 피부에서 채취하였다. 피부 박리와 관련이 없는 siet 유전자가 두 그룹 모두에서 흔했지만 질병에 걸린 개에서 분리한 확률(89.6%)이 건강한 개에서 분리한 확률(37.0%)보다 훨씬 더 높았다. 질병에 걸린 개와 건강한 개에서 expA 및 expB 유전자는 각각 29개(21.5%), 7개(9.6%) 및 8개(5.9%), 6개(8.2%)주에서 발견되었다. 질병군에서 siet 유전자는 코와 소변 검체에서 100% 발견되었으며 대부분의 다른 검체에서도 높은 확률로 발견되었다. expA 유전자는 피부 21.3%, 손가락 37.5%, 귀 19.4%, 코 23.1%, 눈 12.5%, 소변 33.3%에서 검출되었으며 expB 유전자는 코 23.1%, 피부 6.6%, 귀 2.8%에 존재했다. 건강한 개에서 siet 유전자는 코 40.0%, 입 33.3%, 피부 37.1%에서 발견되었다. expA 유전자는 입과 피부 샘플에서, expB 유전자는 코, 입 및 피부 샘플에서 발견되었다. siet 유전자만 있는 SIG(65.2%)가 가장 많았고 건강한 개에서는 독소가 없는 SIG(53.4%)가 두드러졌다. 특히, 질병에 걸린 개의 분리주 중 19.3%가 siet-expA 조합을 보였고, expA-expB 조합은 건강한 개 유래 SIG 1개주를 발견했다. siet-expA-expB 조합은 질병군에서 2개 건강군에서 1개주를 발견했다. 결론적으로, expA 및 expB 유전자가 두 그룹 모두의 다양한 해부학적 부위에서 검출된 SIG에서 발견되었으며 일부는 expA-expB 조합이 있음을 알게 되었다. Staphylococcus pseudintermedius는 개의 정상 세균총 중 하나로 개에게 기회 감염을 일으킬 수 있고, 더욱이 개를 반려동물로 키우는 사람들이 증가하고 있으므로 이런 분리주는 사람에게 전염되어 질병을 유발할 수도 있다. 임상 샘플에서 이러한 분리주를 확보하여 모니터링하면 수의학적 측면에서는 SIG 유발 질병의 진단에 도움이 될 수 있으며, 의학적으로는 면역 억제와 같은 근본적인 문제가 있는 반려견 보호자의 위험 관리에 효과적일 수 있겠다.

Staphylococcus sp. LAM 91-4에 의한 중성 단백질 분해효소의 생산 및 효소학적 성질

김병순 建國大學校 産業大學院 1991 국내석사

토양으로부터 중성 pretense를 생산 분비하는 Staphylococcus속균수 LAM 91-4를 분리 선별하였다. 중성 pretense생산의 최적배양조건은 glucose 2%, peptone 0.5%, K_(2)HPO_(4) 0.1%, MgSO_(4) · 7H_(2)O 0.05% 조성의 배지(pH7.0)을 사용하여 30℃에서 5일간 배양했을때 효소생산이 최대에 달하였으며 배양액에 냉각된 acetone을 최종농도가 80%되게 서서히 가하여 12000xg에서 15분간 원심한후 회수된 침전물을 조정제효소로 사용하여 효소학적성질을 조사한 결과는 다음과 같다. 최적 pH와 온도는 각각 pH 7.0과 50℃였으며 효소의 pH안정성은 6.0에서 7.0 까지의 범위에서 비교적 안정성이 있었다. 열안정성은 40℃에서 60분간 처리했을때 거의 안정하였으나 70℃에서는 10분간 처리했을때 약 30% 정도 실활하였다. Mg^(2+)는 본효소의 활성을 증가시킨반면 Ag^(+), Co^(2+), pb^(2+), Hg^(2+), p-CMB 및 EDTA등은 효소활성을 저해하였다. 효소의 기질특이성조사에서 casein(Hammasten)을 제외하고는 분해력이 거의 없었다. 본균주의 배양적 특성, 형태, 생리 및 생화학적 특성을 조사한 결과 Staphylococcus aureus또는 유연균으로 동정되었다. A strain of Staphylococcus sp. LAM 91-4 which produces neutral pretense was isolated from soil. Production conditions and properties of the enzyme were investigated. Among carbon and nitrogen sources tested, glucose 2% and peptone 0.5% was favorable for the production of the enzyme, respectively. The addition of Mg^(2+) to the basal medium increased the enzyme production. Initial pH and optimum temperature for the enzyme production was pM 7.0 and 30℃, respectively. The maximal proteolytic activity was observed after 5 days of cultivation under above conditions in the medium (pH 7.0) composed of glucose 2%, peptone 0.5%, MgSO_(4) · 7H_(2)O 0.05%. The enzyme was precipitated in the cultured broth by the addition of the cold acetone in the concentration of 80% and the precipitated enzyme was recovered by centrifugation. The optimum pH was 7.0 and optimum temperature was 50℃. The enzyme was stable in the pH range from 6.0 to 7.0. The enzyme was most active at 40℃ and lost 30% of its activity by treatment at 70℃ for 10 min. The enzyme activity was increased by addition of Mg^(2+) and inhibited by Co^(2+), Hg^(2+), Ag^(2+), Pb^(2+), and p-CMB. The enzyme was acted well on casein (Hammarsten) but it had poor activity against egg-albumin and gelatin. Used strain LAM 91-4 was identified as Staphylococcus aureus through the morphological and physiological characteristics.

식품유래 병원성세균의 생육을 저해하는, Staphylococcus warneri AW25 유래 Bacteriocin의 특성 조사

오수빈 창원대학교 일반대학원 2019 국내석사

김치로부터 박테리오신 생산균주를 분리하여 16S rRNA sequencing 결과 S. warneri AW25로 동정되었다. 주사전자현미경(SEM)을 이용하여 세포의 모양을 관찰한 결과 구균으로 확인되었으며 M. luteus IAM 1056, L. monocytogenes KCCM 40307, E. faecium KCCM 12118, B. cereus KCCM 11204에 대해 항균활성을 나타내었다. 또한 S. warneri AW25가 식중독의 원인이 되는 장독소 유전자를 가지는지 확인하기 위하여 PCR을 수행한 후 전기영동을 실시한 결과 sea, seh 유전자를 가지고 있음을 확인하였다. 박테리오신 생산을 위한 최적 배양학적 조건은 maltose와 malt extract를 첨가한 BHI 액체배지에 37℃, 24-42시간 및 pH 7-8로 맞춘 후 배양하였을 때 박테리오신 활성이 320 ㍳/㎖이 가장 높게 나타났다. 박테리오신에 가수분해효소를 처리하였을 때 trypsin, subtilisin A, α-chymotrypsin, proteinase K에서 활성이 소실되어 S. warneri AW25가 생산하는 항균물질이 펩타이드성임을 확인하였다. 이 박테리오신은 강산과 약염기성에서 안정하였으며 강염기성에서는 불안정한 것으로 나타났다. 또한 100℃까지 안정하였으며 유기용매에 대한 내성을 확인한 결과 시료가 녹지 않는 100% 농도를 제외한 methanol, ethanol, isopropanol, acetone 80%까지 안정하였으며 acetonitrile은 60% 까지 안정하고 80%에서는 활성이 절반으로 감소함을 확인할 수 있었다. 무기염류나 계면활성제를 1% 농도 처리했을 때 tween-20, tween-80 및 CuSO4를 제외한 0.5 M EDTA, triton X-100, triton X-114, urea, SDS, N-lauroyl sarcosin, MgCl2, NiSO4 및 NaCl에 내성을 보였다. Isopropanol로 농축한 박테리오신 용액을 사용하여 각 지시균에 대한 MIC50를 구한 결과 L. monocytogenes KCCM 40307 1.31 ㎎/㎖, M. luteus IAM 1056 1.35 ㎎/㎖, B. cereus KCCM 11204 1.82 ㎎/㎖, E. faecium KCCM 12118 1.95 ㎎/㎖으로 이 중에서 감수성이 가장 높은 균주는 L. monocytogenes KCCM 40307으로 나타났다. 또한 박테리오신의 작용기작은 M. luteus IAM 1056 및 L. monocytogenes KCCM 40307에 대하여 흡광도와 생균수가 일정하게 유지되는 것으로 보아 bacteriostatic으로 판단되었다. Isopropanol 농축액을 이용하여 –20℃와 4℃에서 박테리오신의 저장성을 실험하였다. 저장을 시작한 후 –20℃는 25일, 4℃는 20일 까지 온전한 활성을 유지하였으나 이후로 활성이 절반으로 줄어들었으며 35일부터 잔여활성은 160 ㍳/㎖로 나타났다. 박테리오신의 식품 중 Listeria균 억제 가능성을 확인하기 위하여 L. monocytogenes KCCM 40307을 포함한 소시지에 박테리오신을 첨가한 후 초기 CFU/㎖이 감소하여 유지됨을 확인한 결과로부터 박테리오신을 이용하여 육가공품의 품질과 저장기간을 향상시킬 수 있을 것으로 판단된다. S. warneri AW25를 대량 배양한 후 isopropanol 농축, Sep-Pak C18, RP-HPLC를 통하여 정제 하였으며 최종 specific activity는 3282.05 ㍳/㎎으로 기존 배양액에 비해 5.75배 증가하였으며 총 0.4%의 회수율을 보였다. 정제한 박테리오신의 tricine SDS-PAGE 분석을 통해 분자량이 2.5~3.0 kDa로 추정하였다. 정확한 분자량을 확인하기 위하여 MALDI-TOF MS를 의뢰하여 분석한 결과 S. warneri AW25가 생산하는 박테리오신의 분자량은 2549.594 Da로 확인되었다. 정제된 박테리오신의 N-말단 아미노산 서열을 확인하기 위해 edman sequencing을 의뢰하여 분석한 결과 M-Q-F-I-T-D-L-I-K-K-A-V-D-F-F로 확인되었으며 15잔기를 NCBI에서 protein BLAST를 수행한 결과 epsilon family phenol-soluble modulin과 100% 일치하였다. Various bacteria were isolated from fermented foods and tested for antibacterial activity using agar well diffusion method. The physicochemical properties of bacteriocin produced by the isolated strain of Staphylococcus warneri AW25, were examined. The bacteriocin showed antibacterial activity against Gram-positive bacteria such as Micrococcus luteus IAM 1056, Bacillus cereus KCCM 11204, Listeria monocytogenes KCCM 40307 and Enterococcus faecium KCCM 12118. Enterotoxin A and H were detected in S. warneri AW25 by PCR analysis. The bacteriocin was stable at up to 100℃ for 120 min and at pH value from 2.0 to 8.0. Bacteriocin activity was not affected at up to 80% of organic solvents like methanol, ethanol, acetone, and isopropanol. Bacteriocin was resistant to 1.0% concentration of 0.5 M EDTA, Triton X-100, Triton X-114, urea, SDS, N-lauryl sarcosine, MgCl2, NiSO4 and NaCl. In addition, the bacteriocin activity was removed by treatment with trypsin, subtilisinA, α-chymotrypsin and proteinase K. The approximate half minimal inhibitory concentration (MIC50) of crude concentrate against M. luteus IAM 1056, L. monocytogenes KCCM 40307, B. cereus KCCM 11204 and E. faecium KCCM 12118 was 1.35 ㎎/㎖, 1.31 ㎎/㎖, 1.82 ㎎/㎖ and 1.95 ㎎/㎖ respectively. The bacteriocin exhibited its antibacterial activity through bacteriostatic action against M. luteus IAM 1056 and L. monocytogenes KCCM 40307. The crude bacteriocin was stable at –20℃ and 4℃ for 25 day and 20 day respectively. The number of viable cells of L. monocytogenes KCCM 40307 started to decrease after addition of bacteriocin to the sausage. The purification of bacteriocin was performed by isopropanol concentration, Sep-Pak C18 cartridges and RP-HPLC. The purification resulted in a final yield of 0.4% and a 5.75-fold increase in the specific activity. Tricine SDS‐PAGE analysis showed its molecular weight was about 2500 Da. The exact molecular weight was determined to be 2550 Da by MALDI-TOF MS analysis. The partial N-terminal amino acid sequences of bacteriocin were determined to be M-Q-F-I-T-D-L-I-K-K-A-V-D-F-F, the same N-terminal amino acid sequences as epsilon family phenol-soluble modulin of staphylococcus.

黃色葡萄球菌 감염에 의한 家兎의 骨髓病變에 關한 實驗的 연구

이용건 漢陽大學校 大學院 1981 국내박사

Enterococcus faecium 및 Staphylococcus succinus를 스타터로 적용한 된장의 향기성분

정근철 경기대학교 대학원 2018 국내석사

개량식 된장의 풍미 개선을 위하여 선발된 박테리아 스타터 Enterococcus faecium 0AME20과 Staphylococcus succinus 14BME20를 코지균 Aspergillus oryzae와 함께 적용하여 된장을 제조하였다. 본 실험의 된장은 개량식 된장 제조법을 수정하여 볶은 콩 분쇄물과 쌀을 소재로 각 균주를 접종하여 코지를 제조한 다음, 마쇄한 삶은 콩, 정제소금, 물을 혼합하여 제조하였다. 두 종류의 코지 재료를 적용하여 제조한 된장 시료는 코지의 배합에 따라 A된장(A. oryzae 코지), AE된장(A. oryzae 및 E. faecium 코지), AS된장(A. oryzae 및 S. succinus 코지), AES된장(A. oryzae, E. faecium, S. succinus 코지)으로 구분되는 총 8개를 제조하였다. 각 시료는 20 kg 단위로 제조하였고, 수분함량은 55% (w/w), 정제염은 12% (w/w) 농도로 고정하였고, 25℃에서 84일간 숙성시키면서 박테리아 및 화학적 변화와 함께 향기성분 변화를 검토하였다. 숙성이 진행되면서 12% 이상의 NaCl 농도에서 생장이 가능한 내염성 박테리아 및 enterococci, streptococci의 수는 감소하는 것으로 나타났고, pH는 감소하는 것으로 나타났으며, 쌀코지를 사용한 된장시료의 pH 감소가 더 현저하게 나타났다. 아미노태질소는 84일차까지 지속적으로 증가하였고, 박테리아보다는 곰팡이가 아미노태질소 생성의 주요 요인으로 나타났다. GC-MS 분석을 통해 각 시료로부터 검출한 향기성분 19가지를 동정하였고, 2-methyl propanoic acid는 A. oryzae가 생성하는 향기성분으로, 2-methyl butanoic acid와 3-methyl butanoic acid, acetic acid는 E. faecium이, 3-methylbutan-1-ol, 3-methylbutyl acetate, hexanal은 S. succinus가 생성하는 향기성분으로 확인되었다. 주성분분석(principal component analysis)를 통하여 코지의 재료 및 발효에 따른 향기성분을 종합적으로 분석한 결과, 된장의 재료뿐만 아니라 스타터의 종류에 따라 향기성분이 달라지는 것을 확인하였다. To diversify the flavor of commercial doenjang, we applied bacterial starter cultures of Enterococcus faecium 0AME20 and Staphylococcus succinus 14BME20 together with the koji fungus Aspergillus oryzae to the manufacture of doenjang. To manufacture the doenjang samples, six types of koji inoculated with each microorganism were prepared with soybean flake and rice, then mixed with steamed and ground soybeans, refined salt, and water. Doenjang samples manufactured with two koji raw materials were classified according to the combinations of koji samples: deonjang A (A. oryzae koji), doenjang AE (A. oryzae koji and E. faecium koji), donjang AS (A. oryzae koji and S. succinus koji), doenjang AES (A. oryzae koji, E. faecium koji, and S. succinus koji). Each doenjang sample was prepared at a 20 kg weight and contained 12% (w/w) NaCl and 55% (w/w) water, then ripened at 25℃. The changes of bacterial and chemical properties as well as volatile compounds were analyzed for 84 days. During the ripening period, the numbers of salt-tolerant bacteria, enterococci, and staphylococci as well as the pHs of samples were decreased. The pH in doenjang samples made with rice koji decreased more remarkably than that made with soybean flake koji. The concentration of amino-type nitrogen increased until day 84 and A. oryzae was proved as the major contributor. Nineteen volatile compounds were identified from doenjang samples by GC-MS analysis. During the ripening of doenjang, 2-methyl propanoic acid was determined as an odor note specific to A. oryzae, 2-methyl butanoic acid, 3-methyl butanoic acid, and acetic acid as odor notes specific to E. faecium, 3-methylbutan-1-ol, 3-methylbutyl acetate, and hexanal as odor notes specific to S. succinus. Pricipal component analysis of these volatile comounds from samples prepared with two koji raw materials cocnluded that starters as well as raw materials determined the profiles of volatile compounds in donjang.