Mupirocin Resistance Plasmid Analysis of Methicillin Resistant Staphylococci isolates from Tertiary Hospitals in South Korea

신은심 고려대학교 생명공학원 2004 국내박사

Staphylcocci(Staphylcoccus aureus and Coagulase negative Staphylococci(CNS))는 피부와 비강에 분포하는 보통의 상재균이며 심각한 감염증을 유발시키는 원인이 되기도 한다. Mupirocin은 주로 그람양성균, 특히 methicillin-resistanct S. aureus를 포함하는 S .aureus와 CNS에 효과가 있는 국소적, 제한적 범위의 항생제이다. 이 항생제 사용 증가는 병원 내 만연되어 있는 multi-drug resistant MRSA을 퇴치하고자 많이 사용하였기 때문이다. Mupirocin내성은 MIC값에 의해 mupirocin low-(MuL)와 high-level(MuH)으로 나눠진다. 특별히 MuH의 경우 mupA plasmid에 의해 매개되므로 그 내성의 전파는 항생제 내성에 있어서 큰 문제를 야기시킬 수 있다. 이 연구에서 우리는 3차 의료기관에서 분리한 10개의 MuH Staphylococci에서 추출한 mupA plasmid의 유전적특성을 조사하였다. 각 분리주는 다양한 plasmid pattern과 항생제 내성 pattern을 가졌다. Plasmid 기원인 mupA gene은 PCR로 확인하였고, 모든 MuH 분리주에서 1.65kb의 PCR 산물이 검출되었다. MupA 다형성 조사로 RFLP(Restriction fragment of length pattern)을 시행하였고 그 결과로 주로 3가지의 형태로써 4.2kb의 EcoRI fragment, 13kb의 HindIII fragment, 27kb의 ClaI fragment이 나타났다. 내성전이에서의 mupA plasmid의 상관관계는 filter-mating을 통한 conjugation 방법으로 조사하였다. 10종의 Staphylococci 중에서 S. aureus v030, S. aureus 6201, S. haemolyticus 9307 and S. epidermidis 6219는 filter-mating으로 mupA plasmid의 전이를 확인하였다. 이 내성 전이는 동종과 이종간에서 모두 이루어졌으므로, Staphylococci 균종간에서의 MuH 전파가 가능하다는 것을 알 수 있었다. 6.8kb의 EcoRI fragment와 mupA plasmid를 가진 S. aureus v030 transconjugant, v030-8,은 Cloning을 통한 염기서열을 분석하여 한 copy의 IS257이 mupA gene 앞에 있는 것을 확인하였고, 연속되어 있지는 않지만 다른 부위에서의 IS257 부분을 확인 할 수 있었다. 따라서, 우리는 국내 3차 의료기관내 mupirocin resistant Staphylococci 11주를 분리하였고, 그 mupA plasmid의 다형성을 RFLP로 확인하였다. Transconjugant v030-8의 염기분석을 통해 mupA plasmid앞에 IS257이 있는 것을 확인하여 전이와 연관이 있음을 알게 되었고, Filter-mating을 통해 mupA plasmid는 자신뿐만 아니라 다른 항생제 내성을 가진 plamid와 함께 전이되는 것을 보아 mupirocin resistance plasmid는 Staphylococci에서의 multi-drug resistance 전파와 관련이 있음을 알 수 있었다. Staphylococci(Staphylococcus aureus and coagulase negative Staphylococci(CNS)) are normal flora of the skin and nasal passage and one of the most common cause of serious infections. Mupirocin is a topical narrow spectrum antibiotic that is active against mainly gram-positive, especially S. aureus including methicillin-resistant S. aureus(MRSA) and CNS. Because of multi-drug resistant MRSA in hospital, mupirocin usage is increased more and more. There are two types of mupirocin resistance, Low level-(8<MIC≤256㎍/㎖) and high level-resistance(MIC≥512㎍/㎖). Particularly because the mupirocin high-level resistance is mediated by mupA plasmid the resistance spread can cause a big problem for antimicrobial resistance. In this study, we investigated the characterization of isolated mupA plasmid from the 10MuH staphylococci, which were isolated in tertiary hospitals. Each isolate had different plasmid and antibiotic resistance pattern. The mupA gene location was confirmed with plasmid DNA not in chromosomal DNA by PCR product of mupA loci. The restriction fragment of length pattern(RFLP) experiment of mupA plasmid revealed that three different polymorphs of mupA loci and the most prevalent polymorphs were EcoRI-hybridizing fragment of 4.2kb, HindIII-hybridizing fragment of 13kb and ClaI-hybridizing fragment of 27kb. The relation of mupA plasmid with the transfer of mupirocin resistant phenotype was stigated by conjugation experiment. Among the 10 staphylococci, S. aureus v030, S. aureus 6210, S. haemolyticus 9307, S. hominis 9309, S. epidermidis 6219 and S. epidermidis 9310 isolates were analyzed with by filter-mating and mupA plasmid was transferred to recipient with the other plasmid, these findings showed the mupirocin resistance could be transferred between same species and different species and so the rocin resistance can spread between Staphylococci. The ansconjugant v030-8, which having only mupA plasmid, was selected for mupA gene isequencing. The sequence data of 6.8kb EcoRI fragment in v030-8 had 257 sequence attached to mupA gene directly, we find IS257 in other EcoRI fragment. It suggested that IS257 is concerning with the sferable mupA plasmid. Therefore, we selected mupirocin resistant staphylococci isolates in tertiary hospital. The mupA plasmid polymerphisms was confirmed with RFLP and transconjugant v030-8 with only mupA plasmid has IS257 in front of mupA gene by sequence analysis. As the result, mupA plasmid can transferable with other antimicrobial agents so that mupirocin resistance in staphylococci was related of transmission with multi-drug resistance.

Antimicrobial resistance of methicillin-resistant staphylococci isolates from dog ears in Korea : 한국의 개에서 분리한 Methicillin 내성 Staphylococcus의 항생제 내성 특성

권근형 경북대학교 대학원 2018 국내석사

Methicillin-resistant staphylococci (MRS)는 주로 다제내성 (multi-drug resistant)을 띄면서 사람과 동물 모두에 병원성을 나타내는 중요한 원인체로 알려져 있다. 이 연구의 목적은 반려견의 귀에서 분리된 MRS의 항균제 내성의 특성을 알아보는 것으로, 총 827마리의 개로부터, 외이염 증상 귀 (n=161, 41.0%)와 건강한 귀 (n=135, 31.1%)의 양쪽에서 각각 staphylococci를 분리하였다. 외이염이 있는 귀에서의 coagulase-positive staphylococci (CoPS)의 유병률은 58.4%로 건강한 귀 (28.2%)보다 유의하게 높았으며 (p<0.05), 건강한 귀에서 coagulase-negative staphylococci (CoNS)의 유병률은 74.8%로 외이염이 있는 귀 (41.6%)보다 높았다 (p<0.05). CoPS와 CoNS 균주에서의 MRS는 각각 46개 (35.1%) 및 74개 (44.8%)로 유의성에 차이는 없었으나, MRS의 penicillin (76.7%), ampicillin (61.7%), kanamycin (61.7%), erythromycin (47.5%), tetracycline (47.5%) 및 trimethoprim/sulfamethoxazole (46.7%)에 대한 내성율은 methicillin-sensitive staphylococci보다 유의성 있게 높음을 알 수 있었다 (p<0.05).

In vitro에서 선발된 지속성 erm 유전자 함유 그람양성구균의 분자적 특성

진성혜 서울시립대학교 2005 국내석사

국문초록 Macrolide, lincosamide, streptogramin B, ketolide 계 (MLSBK) 항생물질은 서로 다른 화학적 특징을 가지지만 세균의 단백질 합성을 저해하는 유사한 작용을 하므로 이들 MLSBK계 항생물질에 공통적으로 내성을 가지는 세균이 증가하고 있다. MLSBK 항생제 내성은 유도성내성(iMLSBK)과 지속성내성(cMLSBK)으로 나뉘는데, 포도상구균 (Staphylococci)에서는 주로 erythromycin resistance methylase (erm) 유전자인 erm A 와 erm C 유전자에 의해서 일어나게 된다. 유도성내성은 14혹은 15환계 macrolide계 항생물질에 낮은 농도로 노출되었을 때 MLSBK 항생물질에 내성을 가지게 되는 경우이고, 지속성내성은 모든 MLSBK 항생물질에 항상 내성을 가지는 경우이다. 본 연구에서는 유도성내성의 표현형을 보이는 S. aureus (SA) 와 Coagulase negative staphylococci (CNS)중 erm A와 erm C를 가지는 균주를 각각 선발하여, MLSBK 항생제 배지 내에서 지속성내성으로 변이 된 자발적인 돌연변이의 비율을 조사하는 In vitro 실험을 실시하였고, 지속성 내성화 된 돌연변이체의 염기서열을 분석하였다. 실험결과 유도성내성에서 지속성내성으로 변하는 비율은 erm C를 가진 균주가 erm A를 가진 균주 보다 높게 나타났고, 염기서열 분석을 통해 확인한 돌연변이 유형은 일부 염기서열이 결실되거나 일정구간이 중복된 두 가지로 나뉘었다. erm A를 가진 균주의 돌연변이체는 75%가 결실형이었고 25%는 중복형이었으며, erm C를 가진 균주의 돌연변이체는 모두 결실형인 것을 확인할 수 있었다. erm A 돌연변이체는 7가지의 돌연변이 유형을 보였는데, 72bp, 95bp, 115bp, 121bp가 결실된 4가지 유형과, 25bp, 25bp(다른 부위), 93bp가 중복된 3가지 유형이었다. erm C 돌연변이체에서는 16bp, 24bp, 56bp, 58bp, 60bp, 68bp, 71bp, 121bp, >154bp가 결실된 9가지 유형을 확인하였다. 실험 결과를 통해 S. aureus 와 CNS 의 균종 차이보다는, 각 균주가 가지고 있는 erm 유전자에 따라 돌연변이의 비율과 유형이 달라짐을 확인하였다. 주요어: MLSBK resistance, Staphylococci, ermA, ermC, iMLSBK, cMLSBK Abstract Macrolide, lincosamide, streptogramin B and ketolide (MLSBK) antibiotics are widely used in the treatment of Gram positive bacterial infections. MLSBK antibiotics are chemically different, but have similar inhibitory effects on bacterial protein synthesis. The expanded use of these antibiotics has been accompanied by increased numbers of resistant strains among staphylococci. The expression of the predominant macrolide resistance genes in staphylococci, erm A and erm C, is either inducible or constitutive. Strains with inducible MLSBK resistance (iMLSBK) demonstrate in vitro resistance to 14 and 15 member macrolides, while appearing susceptible to 16 member macrolides, lincosamides, type B streptogramins and ketolide ; strains with constitutive MLSBK resistance (cMLSBK) show in vitro resistance to all of these agents. In this study, inducible MLSBK resistance (iMLSBK) phenotype showing four isolates each of S. aureus (SA), coagulase negative staphylococci (CNS) containing erm A or erm C were used. In vitro selection was performed by spontaneous mutation method. The selected mutants were sequenced for detection of structural alteration of mRNA. The conversion ratio of erm A into constitutive MLSBK resistance strains was lower than erm C. Sequence alteration of the regulatory region revealed 2 types ; deletion and tandem duplication. In erm A, 75% of mutants were included in the deletion type and the others were tandem duplication. Also, there were only deletion in erm C. erm A mutants had seven different types of structural alterations : deletions of 72, 95, 115, 121bp and three closely related tandem duplications of 25, 25 (different location), 93 bp. erm C mutants had nine different types of structural alterations : deletions of 16, 24, 56, 58, 60, 68, 71, 121, >154 bp. There is no noticeable difference between S. aureus and CNS in the result of the experiment. It is ascertained that ratio and pattern of the mutation are changed according to erm gene of each isolate. Keyword : MLSBK resistance, Staphylococci, ermA, ermC, iMLSBK, cMLSBK

Antimicrobial resistance and genetic characterization of coagulase-negative staphylococci from bovine mastitis milk in Korea : 내 젖소 유방염에서 분리한 coagulase-negative staphylococci의 항생제 내성 및 특성분석

김수정 경북대학교 대학원 2019 국내석사

본 연구는 2013년부터 2017년까지 5년간 국내 젖소 유방염에서 분리한 coagulase-negative staphylococci (CNS)의 분포 및 항생제 내성과 methicillin의 내성을 가지는 CNS에 대해서 조사하였다. 국내 81개 농장의 3,692개의 분방우유 샘플에서 총 311주의 CNS를 분리하였다. 분리된 CNS를 동정한 결과 S. chromogenes (34.4%)로 가장 많이 분리되었고, S. simulans (20.3%), S. epidermidis (18.6%), S. xylosus (7.4%) 그리고 S. haemolyticus (6.1%) 순으로 분리되었다. 또한 항생제 감수성 검사를 실시한 결과, oxacillin (21.2%)에서 가장 높은 내성을 보였고, penicillin (13.5%), tetracycline (10.3%) 그리고 ampicillin (8.4%) 순으로 높게 나타났지만, cephalothin, ceftiofur 그리고 penicillin/novobiocin 에서는 내성이 드물게 나타났다. 그리고 다재내성(multi-resistance)을 보인 CNS는 2013년부터 2017년까지 2.8%로 낮게 나타났다. Methicillin에 내성을 보이는 66주를 methicillin resistance gene PCR 검사를 진행한 결과 21주가 mecA 양성을 나타내었고 mecC는 나타나지 않았다. 총 21주의 mecA 양성 CNS중 S. epidermidis가 85.7%로 가장 높은 비율을 차지하였고 S. sciuri, S.equorum 그리고 S. hominis가 각각 한 주씩 분리되었다. SCCmec typing을 실시한 결과, 동물 유래 균주에서 주로 확인되는 type Ⅳ가 가장 많이 확인되었다. 18주의 methicillin 내성 S. epidermidis의 경우 ST59, ST179 그리고 ST640 타입이 확인되었고 그 중 국내외 젖소 및 사람에서 주로 확인된 ST59가 88.9%로 나타났다. PFGE 분석 결과 농장간의 전파는 확인할 수 없었고, 농장 내에서는 동일한 ST59와 같은 PFGE 패턴의 균주가 3년동안 한 개체에서 지속적으로 확인되는 것으로 보아 특정 클론이 지속적으로 농장에 존재하는 것으로 생각된다. 본 연구의 결과, 항생제 내성균의 전파 및 유방염 치료를 위한 적절한 항생제를 선택할 수 있는 정보를 제공할 수 있을 것으로 예상되고 젖소 유방염에 대하여 지속적인 모니터링이 필요하다고 생각된다.

혈액배양에서 검출된 Coagulase-negative staphylococci에 대한 임상적 고찰

박영춘 충남대학교 대학원 2013 국내석사

Background: Coagulase-negative staphylococci (CoNS) has been previously considered as nonpathogenic contaminants, but now are a major cause of nosocomial infections as increased use of prosthetic devices, intravascular catheters, and other invasive technology in more immunosuppressed patients. In this study, species frequency, antimicrobial susceptability and clinical characteristics of CoNS were evaluated to deciding whether a blood isolate is a pathogen or a contaminant.. Methods : One hundred and twenty coagulase-negative staphylococcal strains isolated from blood culture from October to September 2012 were included. We performed species identification and antimicrobial susceptibility, and analyzed clinical characteristics retrospectively by retreospectively review of patient’s clinical data. Results : The most common species of CoNS were S. epidermidis (42.5%), followed by S. hominis(32.5%), S. capitis (15.0%), S. hemolyticus (5.8%), etc. The antimicrobial susceptibility showed high resistance to oxacillin (55.6~84.9%). The isolates were regarded as pathogens of bloodstream infections in 45(37.5%), contaminants in also 44(36.7%), and in 31(25.8%) the clinical significance could not be ascertained. Body temperature, CRP and fever were significantly high in pathogen group than contaminant group(P<0.001, P<0.0003 and P=0.02). The percentage of catheterization and mortality were also higher in pathogen group. Satisfying more than one of 3 conditions that two or more set of blood culture positive, detecting same CoNS species in multiple blood cutures and growing microorganisms in less than 24 hours, are 36 isolates(78.3%) in pathogens, contrast to 8 isolates(17%) in contaminants. Conclusion : Coagulase-negative staphylococci are the most frequently isolated microorganisms in blood cultures, and become important nosocomial pathogens. The clinical data and laboratory data should be carefully evaluate for find true bactremia due to coagulase-negative staphylococci isolated from blood cultures.

Polymerase chain reaction을 이용한 Methicillin-resistant staphylococci의 신속동정에 관한 연구

박영진 韓南大學校 1996 국내석사

Coagulase Negative Staphylococci의 Slime검출법 비교 및 항생제 감수성

김경숙 경산대학교 1992 국내석사

With isolated 165 strains of coagulase-negative staphylococci(CNST) from various specimens, such as blood, cerebrospinal fluid, pus, urine, etc., we performed experiment to detect slime-production using polyethylene tube, micro-plate and congo red agar methods and their antimicrobial susceptibility against several antibiotics. The results can be summarized as followes; 1. To see observer variation, two observers read the findings of polyethylene tube and congo red agar tests separately. There showed 43.6%(72/165) of positive agreement and 3.8%(5/165) of discrepancy. 2. To see interassay reproducibility, we repeated each assay with tested strains 3 times, 36.4%(60/165) of polyethylene tube, 43.6%(72/165) of micro-plate and 26.6% (43/165) of congo red agar methods were all positive in 3 set of assay and 46.1%(76/165) of polyethylene tube and micro-plate and 71.5%(118/165) were all negative. 3. 24.3%(40/165) showed positive result agreement and 49.1%(81/165) negative result agreement in 3 used methods. 18.8%(31/165) in both polyethylene tube and micro plate, 1.2% in both micro plate and congo red agar and both polyethylene tube and congo red agar showed positive correspondence, respectively. 4. There were slime-producing CNST in larger portions of peritoneal fluid, catheter tip, pus, blood, urine and slime-nonproducing strains in that of eye and cerebrospinal fluid etc. 5. There were 38.1%(16/42) of pathogens and 30.4%(24/79) of contaminants in slime-producing CNST and 69.1%(26/42) of pathogens and 69.6%(55/79) of contaminants in slime-nonproducing. 6. The antimicrobial susceptibility results of 121 strains of CNST showed 81.2% resistance in penicillin, 73.9% in ampicillin, 68.5% in gentamicin, 63.6% in methicillin and erythromycin, 37.6% in clindamycin, 24.2% in amikacin, 15.8% in cephalothin and cefamandole and 3.6% in vancomycin. The difference of resistance against in amikacin, cephalothin, cefamandole and clindamycin between slime-producing and slime-nonproducing CNST showed statistical significance(P<0.05, P<0.01). 7. 40. 4% strains from blood revealed as pathogen and 59.6% as contaminant. 58.3% from catheter tip, 27.3% from cerebrospinal fluid, 38.7% from urine and 13.3% from miscellanenous specimens revealed as pathogen. As you see, with comparing three methods and examining the antibiotic sensitivity of CNST to find out merits and demerits of all and to use these practically, I think that the above results will be helpful to the precise diagnosis and treatment on diseases.

장류 발효용 종균 개발을 위한 coagulase 음성 staphylococci의 안전성 및 기능성 평가

이빛나라 경기대학교 일반대학원 2016 국내석사

고염발효식품인 된장의 우점균으로 검출된 coagulase negative staphyococci (CNS)로부터 된장 발효에 적합한 종균 후보를 선정하기 위해 안전성 평가와 기능성 평가를 수행하였다. 된장에서 분리된 총 81균주의 CNS, Staphylococcus saprophyticus 49균주, S. succinus 14균주, S. xylosus 18균주,를 대상으로 disk difusion 법을 통한 항생제내성 평가를 실시한 결과, 25균주가 적어도 하나이상의 항생제에 대해 내성을 보였다. 독성인자 중 하나인 α-용혈현상과 β-용혈현상에 대해 11균주, 5균주가 양성반응을 보였으나 모든 균주가 biofilm을 형성하지는 않았다. 결과적으로 본 실험에서 적용한 8종의 항생제에 대한 민감성을 보이고, 용혈현상을 보이지 않는 균주는 81균주 중 33균주, S. saprophyticus 22균주, S. succinus 9균주, S. xylosus 2균주, 였고, 이들을 대상으로 바이오제닉아민 생성능을 조사한 결과 모든 CNS 33균주가 histamine은 생성하지 않았고, cadaverine, tyramine, putrescine은 100ppm 이하의 농도를 생산하였다. Tyramine 생성균주로 알려진 E. faecium균주들이 같은 조건에서 3000ppm 이상의 tyramine 생성량에 비하면 적은 양으로 간주되어 바이오제닉아민 생성 확인 균주 모두 염농도에 따른 내염성, 산생성능, 단백질 분해능, 지질 분해능에 대한 활성 평가하였다. 대부분의 균주는 21%의 고염 조건에서 생존하였고, 15% 염농도에서 산을 생성하였으나, protease와 lipase 활성에 있어서는 균주 특이적 특성을 보였다. 다만, S. saprophyticus 14BME11균주와 S. succinus 14BME20 균주는 6%와 4% 염농도에서 protease와 lipase 활성을 보임으로써 여러 가지 효소활성을 고려한다면 해당 균주들이 풍부한 향미 성분 생산에 적당하다고 판단되었다. 이 중, S. saprophyticus 14BME11와 S. succinus 14BME20와 더불어 안전하면서 효율적인 효소활성을 보인 Bacillus licheniformis 14BML13, Enterococcus faecium 0AME20, Tetragenococcus halophilus 7BDE22를 종균 후보군으로 선정하여 0%, 7%, 14% 염을 보유한 대두발효에 적용한 결과 발효가 진행됨에 따라, pH가 감소하나 균수는 증가하는 것을 확인하였으며, 염농도가 높아질수록 감소나 증가 폭이 낮아지는 경향을 보였다. 발효가 진행됨에 따라 증가하는 균이 접종한 균주임을 추적하기 위해 특이적 프라이머를 이용한 PCR 증폭, 선택배지를 이용한 확인 결과 모두 오염되지 않고, 접종한 종임을 확인하였다. 접종한 균주가 휘발성 성분 생산에 미치는 영향을 확인한 결과 균을 접종하지 않은 대조군에 비해 확인된 volatile compound의 수가 많았을 뿐만 아니라 생산된 양도 높은 경향을 보였다. 특히, B. licheniformis 14BML13균주를 접종한 콩에서는 대조군과 다른 균주를 접종해준 콩에 비해 땅콩향의 피라진 화합물들을 많이 생성하였다. 결론적으로 따라서 본 실험에 적용한 종균 후보균주들은 된장 제조에 있어서 적용한다면 기존의 된장에 비해 풍부한 향미성분을 보유할 것으로 판단된다.

토양에서 분리한 크롬(Ⅵ) 내성 Staphylococci의 특성에 관한 연구

김창석 亞洲大學校 1992 국내석사

경기지역 젖소 유즙 유래의 Staphylococci에 관하여

김혜래나 경북대학교 1990 국내석사