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- 주제어 : POLYMERASE (검색결과 544 건)
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편혜우 성균관대학교 일반대학원 2013 국내석사
We previously reported that Tpa-S DNA polymerase (constructed via fusion of the Sso7d DNA binding protein to the C-terminus of Thermococcus pacificus (Tpa) DNA polymerase) is more efficient in long and rapid PCR than wild-type Tpa, Taq, or Pfu DNA polymerases. However, Tpa-S DNA polymerase had a low yield of PCR products compared with commercialized Taq or Pfu DNA polymerases. To improve the yield of PCR products, mutant Tpa-S DNA polymerases were created via site-directed mutagenesis. In this study, we have targeted the N213 residue in the ExoII motif and the K501 residue in the PolIII motif. The mutant Tpa-S DNA polymerases showed enhanced PCR yields compared to that of the Tpa-S DNA polymerase. Specifically, the double mutant Tpa-S N213D/K501R DNA polymerase had an approximately three-fold increase in the yield of 8-10kb PCR products over that of the Tpa-S DNA polymerase, and catalyzed amplification of a 12kb PCR product using a lambda template with an extension time of 30s. Even though the mutation is in the ExoII motif, the error rate of the double mutant Tpa-S N213D/K501R (2.79×10-5) was nearly the same as that seen in the Pfu DNA polymerase (2.70×10-5).
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길의준 성균관대학교 일반대학원 2010 국내석사
The gene encoding Thermococcus radiotolerans DNA polymerase (Tra DNA polymerase) was cloned and sequenced. The Tra DNA polymerase gene consists of 2,328 bp coding for a protein with 775 amino acid residues. Tra DNA polymerase showed a similarity in the sequence with other family B DNA polymerase from Archaea like Thermococcus sp. 9°N-7 (92% identity), Thermococcus guaymasensis (89% identity), and Pyrococcus kodakaraensis KOD1 (89% identity). The molecular weight of the protein derived from this amino acid sequence was 89,793 Da. The Tra DNA polymerase gene was expressed under the control of the T7 lac promoter on pET-22b(+) in Escherichia coli Rosetta (DE3) pLysS. The expressed enzyme was purified by heat treatment, HisTrap™ HP column chromatography, and HiTrap™ SP HP column chromatography. The optimum pH and temperature of the purified enzyme were determined to be 7.5 and 75 °C. The enzyme was activated by magnesium ion. The optimal buffer for PCR with Tra DNA polymerase consisted of 50 mM Tris-HCl (pH 8.6), 1 mM MgCl2, 10mM KCl, 2 mM (NH4)2SO4 and 0.02 % Triton X-100. PCR parameter of Tra DNA polymerase such as error-rate was measured in comparison with Taq and Pfu DNA polymerases. Use of different ratios of Taq and Tra DNA polymerases determined that a ratio of 20:1 efficiently facilitated long range PCR (approximately 20 kb). Thermococcus radiotolerans 유래의 DNA polymerase (Tra DNA polymerase) 유전자를 클로닝하고 염기 서열을 밝혔다. Tra DNA polymerase 유전자는 775 개의 아미노산 잔기를 암호화하는 2,328 bp의 염기서열로 구성되어 있다. 다른 고세균 유래의 family B DNA polymerase의 서열과의 비교하였을 때, Thermococcus sp. 9°N-7는 92%, Thermococcus guaymasensis는 89%, Pyrococcus kodakaraensis KOD1는 89%의 유사도를 나타내었다. 단백질의 분자량은 89,793 Da이었다. Tra DNA polymerase는 pET-22b(+) 와 Escherichia coli Rosetta (DE3) pLysS에서 발현되었으며, 열처리와 HisTrap™ HP 컬럼 크로마토그래피, HiTrap™ SP HP 컬럼 크로마토그래피를 거쳐 정제하였다. 특성 확인 결과, pH 7.5 와 75 °C에서 각각 최고의 활성을 보였다. Tra DNA polymerase를 이용한 최적의 PCR buffer는 50 mM Tris-HCl (pH 8.6), 1 mM MgCl2, 10 mM KCl, 2 mM (NH4)2SO4 and 0.02% Triton X-100이었다. Tra DNA polymerase의 error-rate와 extension efficiency 같은 PCR parameter들은 Taq과 Pfu DNA polymerase와 비교하여 측정하였다. Taq 과 Tra DNA polymerase를 20:1 비율로 섞어서 사용하였을 때 가장 효율적으로 20 kb 까지 long range PCR이 가능하였다.
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Seo, Kangjin Sungkyunkwan University 2013 국내석사
The family B DNA polymerase gene from the hyperthermophic crenarchaeon Ignicoccus hospitalis KIN4/I (Iho) were expressed in Escherichia coli strain RIL(DE3)pLysS. The expressed Iho DNA polymerase was purified by heat treatment, HisTrapTM HP column and HiTrapTM SP column chromatography, and then characterized. The molecular mass of the purified Iho DNA polymerase have 88 kDa molecular mass, as estimated by SDS-PAGE. The optimal pH for Iho DNA polymerase activity was 7.0 and the optimal temperature was 70°C. Iho DNA polymerase was strongly activated by magnesium ion, with an optimum concentration of 3 mM. The optimal concentration of KCl for Iho DNA polymerase activity was 60 mM. The half-life of the enzyme at 94°C was about 2 hours. The optimal buffer for PCR with Iho DNA polymerase consisted of 30 mM Tricine-KOH (pH 8.8), 1.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0.015% BSA and 0.02% Tween 20. Iho DNA polymerase possesses 3′→5′ ́exonuclease activity. Fidelity of Iho DNA polymerase was similar to Pfu DNA polymerase. Iho DNA polymerase could amplify 2 kb target gene successfully with 10 sec extension time. Iho DNA polymerase could amplify a DNA fragment up to 8 kb.
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Taq polymerase 발현 E.coli의 임상적용 연구
Taq polymerase 는 호열성 세균인 Thermus aquaticus에서 얻은 고열에서도 활성을 유지할 수 있는 DNA 중합효소이다. Taq polymerase의 사용으로 DNA가 denaturation되는 고온에서도 DNA 가닥의 연장이 가능해 지면서 PCR 기술의 발전을 맞이할 수 있었다. 이러한 Taq polymerase는 대량 생산을 위해 E.coli에 plasmid를 이용하여 Taq polymerase를 발현하는 유전자를 재조합하여 삽입한 뒤 효소의 발현을 유도한다. 이후 Taq polymerase를 발현한 E.coli로부터 효소를 추출해 내어 정제하는 과정이 수반되는데, 본 연구에서는 재조합 유전자로부터 효소를 발현한 E.coli를 추출 및 정제 과정을 생략하고 PCR반응에 바로 사용해 보았다. MD polymerase는 고려대학교 분자진단연구실에서 제작한 Taq polymerase이며 E.coli에서 발현한 Taq polymerase를 별도로 추출 및 정제하지 않고 E.coli 그대로 PCR 반응에 사용할 수 있도록 만들어졌다. 본 연구에서는 MD polymerase의 유용성 검증을 위해 Target gene으로 HLA-B27을 대상으로 하는 PCR 검사를 수행하였다. HLA-B27은 강직성 척추염과 유전적 연관이 강하다고 알려져 있기에, 초기 강직성 척추염 진단에 있어서 중요한 검사이다. 강직성 척추염은 청년기에 주로 나타나며 남성에게서 더 많이 발병하는 류마티스성 척추염의 일종이다. 척추 부위에 뻐근함과 통중이 있으며 염증반응 이후 척추뼈들이 일체화 되기도 한다. 추간판 탈출증과 다르게 아침 기상 직후 또는 휴식 이후에 통증이 오히려 심해지는 것이 특징이다. 강직성 척추염은 HLA-B27 유전자와 연관이 있지만 정확한 발병 기전은 알려져 있지 않다. 서울아산병원에서 HLA-B27 검사에 사용되고 있는 HLA-B27 PCR kit(Biosewoom)는 시판용 Taq polymerase를 사용하는 PCR 시약이다. 이 검사는 혈액검체로부터 추출한 gDNA의 HLA-B27 유전자를 증폭하여 해당 유전자의 존재유무를 확인할 수 있다. 해당 시약은 시판용 Taq polymerase가 개별 포장되어 제공되며, PCR 반응 직전 혼합하는 방식이기 때문에 MD polymerase가 발현된 E.coli와 시판용 Taq polymerase를 비교하기에 적절한 구성이다. 서울아산병원에서 2022년 6월부터 2022년 9월까지 HLA-B27 검사를 시행한 뒤 남은 잔여 검체를 사용하였다. 이중 양성 55개와 음성 55개를 임의로 선정하여 무작위 익명화를 한 뒤, 시판용 Taq polymerase로 검사한 PCR결과와 MD polymerase를 이용한 PCR결과를 비교하여 일치율 및 Cohen’s kappa value를 통해 두 시약의 PCR 증폭 결과에 대한 일치도를 평가하였다. 총 110개의 검체에 대한 일치도 평과 결과, 모든 검체에서 결과가 일치하였다. 일치율은 100%로 나타났으며 Cohen’s kappa value도 1.0으로 완벽한 일치도를 나타내었다. 본 연구를 통해, MD polymerase가 추출과 정제 과정 없이도 PCR 반응에서 기존 시판용 Taq polymerase와 유사한 성능을 보여준다고 생각할 수 있다.
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서강진 성균관대학교 일반대학원 2013 국내석사
The family B DNA polymerase gene from the hyperthermophic crenarchaeon Ignicoccus hospitalis KIN4/I (Iho) were expressed in Escherichia coli strain RIL(DE3)pLysS. The expressed Iho DNA polymerase was purified by heat treatment, HisTrapTM HP column and HiTrapTM SP column chromatography, and then characterized. The molecular mass of the purified Iho DNA polymerase have 88 kDa molecular mass, as estimated by SDS-PAGE. The optimal pH for Iho DNA polymerase activity was 7.0 and the optimal temperature was 70°C. Iho DNA polymerase was strongly activated by magnesium ion, with an optimum concentration of 3 mM. The optimal concentration of KCl for Iho DNA polymerase activity was 60 mM. The half-life of the enzyme at 94°C was about 2 hours. The optimal buffer for PCR with Iho DNA polymerase consisted of 30 mM Tricine-KOH (pH 8.8), 1.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0.015% BSA and 0.02% Tween 20. Iho DNA polymerase possesses 3′→5′ ́exonuclease activity. Fidelity of Iho DNA polymerase was similar to Pfu DNA polymerase. Iho DNA polymerase could amplify 2 kb target gene successfully with 10 sec extension time. Iho DNA polymerase could amplify a DNA fragment up to 8 kb.
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송재근 성균관대학교 일반대학원 2009 국내석사
The known archaeal family B DNA polymerases are unable to participate in the PCR in the presence of uracil. Here I report on a novel archaeal family B DNA polymerase from Nanoarchaeum equitans that can successfully utilize deaminated bases such as uracil and hypoxanthine. In addition, I have focused on two amino acid residues (Y515, A523) in fingers subdomain of Neq DNA polymerase, which were shown to locate at the tip of fingers subdomain from the alignment of amino acid sequence with structure?]determined archaeal DNA polyemrases. Those two residues were changed by site-directed mutagenesis, enzymatic properties of mutants were analyzed. I conclude that the Y515 and A523 located at the tip of fingers subdomain affect the processivity of Neq DNA polymerase. The mutational analyses have allowed to understand the function of the residues and to enhance the protein function. Neq A523R DNA polymerase, one of the mutant proteins, exhibited about 3-fold enhanced processivity and extension rate than wild-type, which enables more efficient PCR. In the presence of uracil, Neq A523R DNA polymerase outperformed Taq DNA polymerase with more specific and sensitive amplification. It is expected that Neq A523R DNA polymerase should be beneficial in real time PCR using uracil-DNA glycosylase without the risk of carry-over contamination. 지금까지 알려진 고세균 유래의 family B DNA 중합효소는 우라실 존재 하에서 PCR을 수행할 수 없었다. 이 논문을 통해 우라실과 하이포잔틴과 같은 탈아민화된 염기들을 잘 이용할 수 있는 Nanoarchaeum equitans 고세균 유래의 새로운 family B DNA 중합효소를 보고한다. 더불어서 구조가 밝혀진 고세균 유래의 family B DNA 중합효소와 alignment를 통하여 fingers subdomain의 끝 쪽에 위치할 것이라 예상되는 Neq DNA 중합효소의 두 아미노산 잔기 (Y515, A523)를 가지고 연구를 진행 하였다. site-directed mutagenesis를 통하여 위의 두 잔기를 다른 잔기들로 치환하였으며, 만들어진 돌연변이 효소들의 특성을 분석하였다. 이 논문을 통해 fingers subdomain의 끝에 위치한 Y515, A523 아미노산 잔기가 Neq DNA 중합효소 의 진행성에 영향을 준다는 사실을 밝힌다. 이 논문에서 수행한 돌연변이 분석은 특정 아미노산 잔기의 역할을 이해하게 하였고 또한 효소의 성능을 향상시켰다. 돌연변이 단백질 중의 하나인 Neq A523R DNA 중합효소는 원래의 효소에 배해 약 3 배 정도 진행성과 신장 속도가 증가하였고 또한 더욱 효율적으로 PCR을 수행하였다. 우라실 존재 하에서 Neq A523R DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소보다 더욱 특이적이고 높은 증폭효율을 가지고 PCR을 수행할 수 있었다. 무엇보다 Neq A523R DNA 중합효소는 우라실-DNA 글리코실라제를 함께 이용하여 교차오염을 방지하는 real-time PCR에 매우 유용할 것으로 여겨진다.
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Improved PCR efficiency of thermococcus pacificus DNA polymerase via mutagenesis
김인혜 성균관대학교 일반대학원 2012 국내석사
The biochemical properties of the Thermococcus pacificus (Tpa) DNA polymerase were determined to evaluate its feasibility for use in polymerase chain reaction (PCR) application. The Tpa DNA polymerase gene was constructed in the pET-22b (+) plasmid. To improve PCR efficiency, the Sulfolobus solfataricus DNA binding protein Sso7d gene was fused to 3' region of Tpa DNA polymerase gene to get Tpa-S DNA polymerase gene. Tpa N213D DNA polymerase and Tpa-S N213D DNA polymerase genes were also created via site-directed mutagenesis. The resulting plasmids were expressed in Escherichia coli strain BL21-CodonPlus(DE3)-RIL, respectively. The expressed enzymes were purified by heat treatment, HiTrapTM Heparin HP column chromatography and HisTrapTM HP column chromatography and then characterized. The optimal buffer for PCR with wild-type Tpa DNA polymerase consisted of 50 mM Tris–HCl (pH 8.0), 5 mM MgCl2 and 30 mM KCl. The optimal buffer for PCR with Tpa N213D mutant contains 50 mM Tris–HCl (pH 7.8), 3 mM MgCl2. The optimal buffer for PCR with Tpa-S mutant contains 50 mM Tris–HCl (pH 8.0), 2 mM MgCl2, and 90 mM KCl. The optimal buffer for PCR with Tpa-S N213D 50 mM Tris–HCl (pH 8.0), 2 mM MgCl2, and 80 mM KCl. The mutant Tpa DNA polymerase all showed enhanced PCR efficiency compared to that of the wild-type Tpa DNA polymerase. Specifically, the mutant Tpa-S N213D DNA polymerase exhibited the best PCR efficiency and amplification rate among the mutant DNA polymerases. The mutant Tpa-S N213D DNA polymerase could amplify the long PCR product of 12 kb within a extension time of 1 min. Fidelity assay shows the amplification accuracy of the each polymerases. Tpa-S DNA polymerase (2.75×10−6) and Tpa-S N213D DNA polymerase (2.40×10−6) revealed more than 2-fold higher fidelity than Taq DNA polymerase (5.78×10−6), which value is similar to that of Pfu DNA polymerase. 본 연구에서는 Thermococcus pacificus (Tpa) DNA 중합효소의 생화학적 특성을 확인하여 PCR에의 적용 가능성을 평가하였다. 고세균 Thermococcus pacificus (Tpa) 유래의 family B DNA 중합효소 유전자는 774 개의 아미노산 잔기를 암호화하는 2,322 bp의 염기서열로 구성되어 있다. 본 연구에서는 Sulfolobus solfataricus DNA binding protein Sso7d 유전자를 Tpa DNA 중합효소에 연결시켜 Tpa-S DNA 중합효소를 얻었고 Tpa N213D와 Tpa-S N213D DNA 중합효소 유전자는 Tpa DNA 중합효소에 점 돌연변이를 일으켜 얻을 수 있었다. 이들은 각각 Escherichia coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL에서 발현시켰다. 발현된 효소들은 열처리, HiTrapTM Heparin HP 컬럼 크로마토그래피, HisTrapTM HP 컬럼 크로마토그래피를 거쳐 정제하였다. SDS-PAGE로 확인한바, 정제된 Tpa, Tpa N213D DNA 중합효소의 분자량은 약 90 kDa이였고, Tpa-S와 Tpa-S N213D는 약 97 kDa 임을 알 수 있었다. Tpa DNA 중합효소를 이용한 최적의 PCR buffer의 조성은 50 mM Tris–HCl (pH 8.0), 5 mM MgCl2,이였고, Tpa N213D의 최적 PCR buffer는 50 mM Tris–HCl (pH 7.8), 3 mM MgCl2, 10 mM KCl이였다. Tpa-S는 50 mM Tris–HCl (pH 8.0), 2 mM MgCl2, 90 mM KCl에서 Tpa N213D-S는 50 mM Tris–HCl (pH 8.0), 2 mM MgCl2, 80 mM KCl일 때 최적이였다. PCR 증폭 효율에 있어서는 야생형 Tpa와 비교하였을 때 Tpa-S N213D 돌연변이체의 PCR 효율이 가장 많이 증가하였다. 이 돌연변이체는 12 kb 정도의 긴 PCR 표적산물도 1 분 정도의 짧은 연장시간 안에 증폭시킬 수 있음과 동시에 증폭량 또한 야생형에 비해 많이 증가했다. 충실도 실험에서는 Tpa-S (2.75×10−6)와 Tpa-S N213D DNA 중합효소(2.40×10−6)가 Taq (5.78×10−6)보다 약 2배 가량 향상된 충실도 수치를 나타내었고 이 값은 Pfu와 비슷한 값을 보였다.
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김기쁨 성균관대학교 일반대학원 2011 국내석사
Thermococcus celericrescens 유래의 DNA polymerase (Tcel DNA polymerase) 유전자를 클로닝하고 염기 서열을 밝혔다. Tcel DNA polymerase 유전자는 775 개의 아미노산 잔기를 암호화하는 2,328 bp의 염기서열로 구성되어 있다. 다른 고세균 유래의 family B DNA polymerase의 서열과의 비교하였을 때, Pyrococcus kodakaraensis KOD1는 92%, Thermococcus celer는 86%, Pyrococcus furiosus는 79%의 상동성을 보였다. 단백질의 분자량은 90,134 Da이었다. Tcel DNA polymerase는 pET-20b(+) 와 Escherichia coli Rosetta (DE3) pLysS에서 발현되었으며, 열처리와 HisTrapTM HP 컬럼 크로마토그래피, HiTrapTM SP HP 컬럼 크로마토그래피를 거쳐 정제하였다. 특성 확인 결과, pH 8.0 와 70 °C에서 각각 최고의 활성을 보였다. Tcel DNA polymerase를 이용한 최적의 PCR buffer는 30 mM Tris-HCl (pH 8.4), 1.5 mM MgCl2, 60 mM KCl, and 0.0025% BSA였다. Tcel DNA polymerase의 error-rate와 extension efficiency들은 Taq과 Pfu DNA polymerase와 비교하여 측정하였다. Taq 과 Tcel DNA polymerase를 10:1 비율로 섞은 Tcel plus DNA polymerase를 사용하였을 때 가장 효율적으로 30 kb 까지 long range PCR이 가능하였다. 또한 두 개의 아미노산 잔기를 치환하여 야생형의 DNA polymerase보다 thermostability와 PCR effeciency가 향상된 돌연변이 Tcel DNA polymerase를 발굴하고자 하였다. 752번과 213번 잔기를 타켓으로 하여 점 돌연변이를 일으킨 결과, 세 종류의 돌연변이 Tcel DNA polymease에서 모두 thermostability와 PCR efficiency가 향상된 것을 확인하였다. 세 종류의 돌연변이 중에서 가장 PCR efficiency가 향상된 이중 돌연변이 TcelA752K/N213D DNA polymerase는 3' → 5' 엑소뉴클아제 활성에 영향을 미치는 ExoII 모티브에 돌연변이화 한 것임에도 불구하고 야생형의 Tcel DNA polymerase와 비교하여 3' → 5' 엑소뉴클아제 활성에 변화가 거의 없음을 확인 하였다. 이중 돌연변이 TcelA752K/N213D DNA polymerase는 Taq DNA polymerase보다 2.6배 향상된 충실도를 나타내었고, 더욱이 PCR 증폭 효율에 있어서는 2분의 증폭시간에도 10 kb의 긴 표적산물을 증하였다. 이러한 결과는 이중 돌연변이 TcelA752K/N213D DNA polymerase가 LA (long and accurate) PCR에 적용가능함을 보여주었다. The family B DNA polymerase gene from the euryarchaeon Thermococcus celericrescens (Tcel) contains a open reading frame of 2,328 bp that encodes 775 amino acid residues. In this study, the Tcel DNA polymerase gene was expressed in Escherichia coli strain Rosetta(DE3)pLysS. The expressed enzyme was purified by heat treatment, HisTrapTM HP column chromatography and HiTrapTM SP HP column chromatography and then characterized. The molecular mass of the purified Tcel DNA polymerases are about 90 kDa, as estimated by SDS-PAGE. The optimal pH and temperature of the purified enzyme were determined to be 8.0 and 70℃. The enzyme was activated by magnesium ion. The optimal buffer for PCR with Tcel DNA polymerase consisted of 30 mM Tris-HCl (pH 8.4), 1.5 mM MgCl2, 60 mM KCl, 0.0025% BSA. The error-rate and extension efficiency of Tcel DNA polymerase were tested and compared with Taq and Pfu DNA polymerases. Use of different ratios of Taq and Tcel DNA polymerases determined that a ratio of 10:1 efficiently facilitated long PCR (approximately 30kb). Also mutant DNA polymerases were created by site-directed mutagenesis targeting two residues to enhance thermostability and PCR efficiency than wild-type Tcel DNA polymerase. As the result of the point mutation by targeting residues of A752 and N213, it was confirmed that the PCR efficiency and thermostability were all enhanced with three of mutant Tcel DNA polymerases. Among these type of mutant, The double mutant TcelA752K/N213D DNA polymerase, enhanced the most PCR efficiency, was confirmed there was little change in 3' → 5' exonuclease activity comparing with wild-type Tcel DNA polymerase even though mutation in ExoII motif. The double mutant TcelA752K/N213D DNA polymerase had a 2.6-fold lower error rate than Taq DNA polymerase. Furthermore it could amplify the long PCR product of 10 kb even in extension time of 2 minute at PCR efficiency. It seems that the double mutant TcelA752K/N213D DNA polymerase can be apply to LA(long and accurate) PCR.
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PCR을 사용하여 응용할 수 있는 분야들이 증가함에 따라 다양한 종류의 내열성 DNA 중합효소들이 필요로 된다. 그래서 우리는 DNA 중합효소와 SSBs등 PCR에 이용할 수 있는 효소들을 정제하고 이것을 실험실내에서 개발 중인 shRNA 라이브러리를 제작하는 기술 개발에 이용하고자 하였다. PCR 수행 시 필요한 DNA 중합효소는 사용목적과 기능에 따라 사용 용도가 달라지는데 그 중 Pyrococcus furious유래Phusion DNA 중합효소는 95kDa크기의 단백질로서 5´→3´ DNA 중합효소 활성과3´→5´ 핵산말단가수분해효소 활성을 가지며, 기존에 판매되는 중합효소들보다 정확도가 높고, 에러율이 낮다는 장점을 가진다. 또 다른 중합효소인 Tth DNA 중합효소는 Thermus thermophilus 에서 추출한 94kDa의 단백질로 3'→5' 핵산말단가수분해효소 활성은 결여되어 있지만 역전사 효소 활성을 가지고 있어 RT-PCR에 많이 사용되는 효소이다. PCR을 할 때 중합효소와 함께 첨가하면 DNA 중합효소의 정확도를 높여주고 PCR의 효율을 높여주는 역할을 하는 것으로 알려져 있는 Tth SSBs는 Thermus thermophilus로 부터 SSBs유전자를 얻어 발현시켰고, 그 크기는 약29.8kDa이다. 여러 효소들을 높은 순도와 화학적 활성을 유지시키기 위해 정제과정을 거쳐야 한다. 하지만 그전에, 많은 양의 단백질을 얻을 목적으로 표적 유전자를 단백질 발현 벡터에 클로닝하고 표적 단백질을 pLysS 플라스미드가 포함되어있는 BL21(DE3)균주에 도입하였다. 단백질 과발현은 IPTG induction을 통해 유도하였다. 그 후, 열처리, 염석법, 금속 친화성 크로마토그래피의 3단계의 정제 과정을 거쳐 표적 단백질을 분리 정제하였다. 그 결과, IPTG induction후에 표적 단백질이 과발현되는 것이 확인되었다. 또한, Ni-NTA 아가로즈를 이용한 금속 친화성 크로마토그래피 결과로 표적 단백질 외의 상당 부분이 제거되는 것이 확인되었다. PCR 수행 후에 정제된 단백질들이 높은 효율의 DNA 중합효소 활성을 나타내는 것을 확인 할 수 있으며 두 중합효소 모두 DNA 증폭 및 PCR관련 기술에 응용 가능할 것으로 여겨진다. This study describes the cloning of three different genes from thermostable microorganisms, as well as the expression, purification and characterization of the corresponding proteins. First, Phusion DNA polymerase is a thermostable enzyme of approximately 95 kDa isolated from Pyrococcus furiosus. It has 5´→3´ DNA polymerase and 3´→5´ exonuclease activities, which confers fidelity to the enzyme. Second, Tth DNA polymerase is a thermostable enzyme of approximately 94 kDa isolated from eubacterium Thermus thermophilus strain HB8. The enzyme is a highly processive 5'-3' DNA polymerase and lacks 3'-5' exonuclease activity. It has a strong reverse transcriptase activity and thus has been widely used for RT-PCR. Finally, Tth SSBs is a thermostable enzyme of approximately 29.8 kDa isolated from eubacterium Thermus thermophilus strain HB8. The enzyme binds to single-stranded DNA. The presence of Tth SSB increases the fidelity and efficiency of the DNA polymerase. In this study, I amplified the three corresponding genes using genomic PCR and cloned them into two different kinds of E. coli expression vectors, pQE30 andpET28. After selecting the constructs that do not contain any mutations by DNA sequencing analysis, I expressed the His-tagged proteins in E. coli BL21(DE3) containing the pLysS plasmid by adding IPTG.. The tagged proteins were purified by heat treatment, ammonium sulfate precipitation, and then a metal-affinity chromatography on Ni-NTA agarose. The DNA polymerase activity of the purified Phusion DNA polymerase and Tth DNA polymerase was determined by PCR. The purified DNA polymerases fractions do not contain any contaminating DNA that could serve as template for PCR, and the Tth SSB protein fraction does not contain contaminating polymerase activity. Thus, I was able to use the purified proteins for the future molecular biological experiments on the construction of RNAi library.
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Pyrobaculum arsenaticum로부터 DNA polymerase 遺傳子의 cloning과 鹽基序列 分析
신혜진 成均館大學校 大學院 2002 국내석사
Deoxyribonucleic acid polymerase에 의한 유전 정보의 복제는 살아있는 생물체의 번식과 진화 과정에 있어 중요한 역할을 하고 있다. 지금까지 많은 다양한 종의 생물체로부터 DNA polymerase가 동정되어 아미노산 서열이 밝혀졌는데 아미노산 서열상의 유사성을 토대로 크게 다섯 종류의 그룹으로 분류되어지고 있다. 그 중 최근까지 밝혀져 온 대부분의 archaeal DNA polymerase들은 family B type에 속하고 있는 것 으로 보고되어지고 있으며, 크게 5´-r3´polymerase와 5´-i3´ exonuclease, 그리고 3´-i5´exonuclease domain들로 구성되어 있다. Archaeal DNA polymerase는 생물체가 갖는 특성에 따라 75´c 이상의 고온에서도 안정성을 오랫동안 유지할 수 있을 뿐 아니라, 3´-r5´ exonuclease 활성에 의한 높은 replication fidelity를 지니고 있어 상업적 으로 이용 가치가 높아지고 있다. 더구나 crerlarchaeal DNA polyrnerase 에 대한 연구는 아직까지 미흡하여 학문적으로도 연구 가치가 높다 할 수 있겠다. 본 연구에서는 처음으로 crenarlarchaeon Pyrosaculum arsenaticum 으로부터 DNA polyrilerase를 암호하고 있는 유전자를 동정하여 그 것의 염기서열과 아미노산 서열을 밝혀내었다. 아미노산 서열 분석 결과 」p.ersenofl´cum polymerase는 GTG (Valin)을 start codon, TAG를 stop codon으로, 총 746개의 아미노산들을 암호하는 open reading frame으로 구성되어 있음을 알 수 있었다. 또한 이미 아미노산 서열이 밝혀져 있는 다른 archae전 DNA polyrnerase들과의 비교 분석 결과 같은 속에 속하는 p. islandicum의 polymerase (Gene Bank accession no. AAF27815) 와는 77%의 높은 상동성을, p.furious polymerase (Gene Bank accession no. D12983)와는 34%, 그리고 T.litoralis polymerase (Gene Banlt accession no. S42459)와는 32%의 서열상의 유사성를 보이고 있음을 확인해 볼 수 있었다. 따라서 Archaea에서는 계통 분석학적으로 연관되어 있는 DA polymerase들간에 높은 서열상의 유사성을 지니고 있음을 추정해 볼 수 있다. Italy, Naples, Pissiarelli Solfatara 지방의 온천에서 분리되어진 .p. arsenaticum(type strain PZ6 DSMZ 13514, ATCC 700994)은 165 rRNA sequence 비교를 통해 archaea 균으로 분류되고 있는데 분자 생물학적 연구를 위해 본 실험에서는 pH 6.0, 95´c 리고 협기적 상태가 유지되고 있는 배양 조건에서 대량으로 키워 사용하였다. 배양액 내의 혐기적 조건을 만들어주기 위해서는 배지 내에는 환원제로 sodium sulfide를 침가해주었으며, 배양 용기의 혐기적 조건을 유지하기 위해서는 질소 가스로 30분간 치환시키는 방법을 이용하였다. The duplication of genetic information by DNA polymerase is the basis for evolution and propagation of living organisms. Based on amino acid sequences, DNA polymerases can be classified into at least five distinct groups. The majority of archaeal DNA polymerases described to date, as well as the eucaryotic replication DNA polymerses a, 6 and E belongs to the family B. An archaeal family BDNA polymerase, consisting of the 3 ´ - 5 ´ exonuclease and 5 ´ +3´ polymerase domains, possess an extreme themostability and a high replication fidelity. Therefore these thermostable proofreading polymerases are highly useful in commercial value for the polymerase chain reaction application. Futhermore it is scientific worth studying them because our knowledge about crenarchaeal DNA polymerase leaves much to be desired. In this study, we cloned a gene encoding a family B DNA polymerase from crenarchaeon Pyrobuculum arsenaticurn at the first time and presented its nucleotide and amino acid sequence. P. arsenaticum DNA polymerase was found to contain an open reading frame encoding 746 amino acids with a calculated mass of 81,314 Da. Its open reading frame starts, with GTG, Valin and stops with TAG. The P. arsenaticum DNA polymerase sequence was aligned with several, archaeal DNA polymerases available in public databases. The six conserved regions and the three conserved 3´-5´ exonuclease motifs of family B DNA polymerases were identified in P. arsenaticum DNA polymerase. In a painvise alignment, the P. arsenaticum DNA polymerase sequence shows a 77% identity with P. islandicum polymerase (Gene Bank accession no. AAF27815), 34% with P. furious. polymerase (Gene Bank accession no. D12983), and 32% with 57 Zitoralis polymerase (Gene Bank accession no. S42459). P. arsenaticum DNA polymerase shared highest sequence identity with phylogenetically related P. islandicum DNA polymerase. P. arsenaticum (type strain PZS DSMZ 13514, ATCC 700994) isolated from a hot spring at Pissiarelli Solfatara, is anaerobic, hyperthennophilic and facultative organotrophic archaeon. This organism with optimal growth temperature of 95°C and pH of 6.5 was incubated under anaerobic culture condition for five days. This condition is made by reducing agent, sodium sulfide and nitrogen gas.
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