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MDCK cell에서 OAT1의 기능적 발현 : 인간과 Rat에서 그 기능의 종간 차이에 관한 근거
미국 식품의약국은 여러 약물수송체들(Drug transporters) 중 약물상호작용(Drug-drug interaction, DDI)에 큰 영향을 미치는 7가지 주요 약물수송체를 발표하고 신약개발 과정에서 후보물질과 이들 간의 상호작용을 반드시 평가하도록 권고하고 있다. 그 중 유기음이온 수송체인 OAT1은 다양한 상피세포의 basolateral membrane에 발현되는 단백질로 기질인 음이온성 물질의 세포막 투과를 매개하는 역할을 담당하고 있다. 특히 신장의 근위세뇨관에 주로 존재하여 신 배설에 중요한 역할을 하기 때문에 음이온성 약물(예, non-steroidal anti-inflammatory drug)의 조직분포 등 체내동태를 평가하기 위해서는 OAT1과 이들 간의 상호작용을 먼저 면밀히 검토할 필요가 있다. 따라서 본 실험에서는 OAT1과 관련된 잠재적인 약물상호작용을 평가하기 위해 in vitro screening system을 구축하였다. 또한 문헌보고에는 몇 종 약물에서 실험동물(예, Rat)의 OAT1과 사람의 OAT1에는 종간 차이가 존재한다고 보고되어 있을 뿐이고, 그 종차가 체내동태에 영향을 줄 정도로 큰 파급효과를 가지는지, 또 얼마나 많은 어떠한 약물들이 종간 OAT1 수송 특성의 차이를 보이는지 등에 대해서는 거의 연구되어 있지 않다. 따라서 임의의 19가지 빈용처방 약물들에 대한 DDI screening study를 통해 어떠한 약물들이 human과 rat에서 서로 다른 inhibitory potential을 보이는지 연구함으로써 체내동태예측 가능성을 평가하고자 하였다. 먼저 실험실에서 보유 중인 plasmid 상태의 human과 rat OAT1을 MDCK cell에 각각 transfection 시켰다. RT-PCR과 function test를 통해 OAT1의 안정적이고 기능적인 발현을 확인한 후, 임의의 빈용처방 약물 19종에 대한 inhibition screening study를 진행하였다. 실험 후 cell 수의 차이는 BCA method를 사용하여 보정하였고, fitting 프로그램인 Winnonlin®을 사용하여 IC50값을 측정하였다. 빈용처방 19가지 약물 중 17가지 약물이 OAT1과 상호작용을 보였으며, 특히 NSAIDs 몇 종과 cimetidine, methotrexate와 quinine은 human과 rat OAT1에서 서로 다른 inhibition 양상을 보였다. 또한 흥미롭게도 quinine, rifampicin과 theophylline은 anionic moiety가 없는 약물임에도 불구하고 OAT1과 상호작용을 나타내었다. 본 연구를 통해 human과 rat OAT1이 MDCK cell에 기능적으로 잘 발현되었음을 확인할 수 있었고 앞으로 OAT1의 DDI screening을 위한 in vitro system으로서도 적절함을 확인할 수 있었다. 따라서 신약개발의 초기단계에 후보물질들의 약물상호작용 평가에 유용하게 이용될 수 있을 것이라 기대된다. 또한 몇몇 약물에서 human과 rat OAT1에서 종간차이를 나타내는 것을 확인하였으며, 추후 연구를 통해 어떠한 약물들이 종차를 나타내는지 예측할 수 있다면 신약개발의 전 임상단계에서 실험동물을 통해 인간에서의 체내동태를 예측할 때 발생할 수 있는 오류를 줄이는데 큰 도움이 될 것으로 사료된다.
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Anaylsis of AsDA1-2D gene in response to heat stress in oat (Avena sativa L.)
Joo Sun Lee 고려대학교 대학원 2023 국내석사
귀리는 사람들의 식단에서 높은 영양학적 가치와 건강상의 이점을 가지고 있기 때문에 점점 그 중요성이 증가하고 있다. 그러나 생식생장기 동안의 고온 스트레스는 종자 저장 단백질의 구조와 함량 변화시켜 최종산물에 나쁜 영향을 미친다. 유비퀴틴-프로테아좀 중 하나인 DA1은 등숙기 동안 세포의 증식을 제어함으로써 종자의 크기를 조절하는데 중요한 역할을 한다. 그러나 현재까지 귀리 DA1 유전자에 대한 보고서나 연구는 거의 전무하였다. 본 연구에서는 게놈 분석을 통하여 3개의 DA1 유전자 패밀리 (AsDA1-2D, AsDA1-5A, AsDA1-1D)를 확인했다. 그 중 AsDA1-2D는 thermo tolerance assay를 통해 고온 스트레스에 대한 내성을 가지고 있는 것이 확인되었다. Yeast two-hybrid screening을 통하여 AsDA1-2D와 귀리의 저장 단백질인 글로불린 (AsGL-4D) 및 단백질분해효소 억제제 (AsGL-4D) 들과의 물리적 상호작용이 관찰되었다. Subcellular localization 분석 결과 AsDA1-2D와 상호 작용 단백질은 세포기질과 원형질막에 위치하는 것으로 밝혀졌다. In vitro pull-down assay결과 AsDA1-2D는 AsPI-4D와 AsGL-4D 모두와 상호작용을 하는 것으로 나타났다. In vitro cell-free degradation assay 결과, AsGL-4D는 고온에서 AsDA1-2D에 의해 분해되었으며, AsPI-4D는 AsDA1-2D의 기능을 억제하였다. 이러한 결과는 AsDA1-2D가 시스테인 프로테아제의 역할을 하며 고온 스트레스 하에서 귀리 저장단백질인 글로불린을 음성조절 한다는 것을 시사한다. The importance of oats has increased because of their high nutritional value and health benefits in the human diet. High-temperature stress during the reproductive growth period has a detrimental effect on grain morphology by changing the structure and concentration of several seed-storage proteins. DA1, a conserved ubiquitin-proteasome pathway component, plays an important role in regulating grain size by controlling cell proliferation in maternal integuments during the grain-filling stage. However, there have been no reports or studies on oat DA1 genes. In this study, we identified three DA1-like genes (AsDA1-2D, AsDA1-5A, and AsDA1-1D) using genome-wide analysis. Among these, AsDA1-2D was found to be responsible for high-temperature stress tolerance via a yeast thermotolerance assay. The physical interaction of AsDA1-2D with oat-storage-globulin (AsGL-4D) and a protease inhibitor (AsPI-4D) was observed using yeast two-hybrid screening. A subcellular localization assay revealed that AsDA1-2D and its interacting proteins are localized in the cytosol and plasma membrane. An in vitro pull-down assay showed that AsDA1-2D forms a complex with both AsPI-4D and AsGL-4D. An in vitro cell-free degradation assay showed that AsGL-4D was degraded by AsDA1-2D under high-temperature conditions and that AsPI-4D inhibited the function of AsDA1-2D. These results suggest that AsDA1-2D acts as a cysteine protease and negatively regulates oat-grain-storage-globulin under heat stress.revealed that AsDA1-2D and its interacting proteins are localized in the cytosol and plasma membrane. An in vitro pull-down assay showed that AsDA1-2D forms a complex with both AsPI-4D and AsGL-4D. An in vitro cell-free degradation assay showed that AsGL-4D was degraded by AsDA1-2D under high-temperature conditions and that AsPI-4D inhibited the function of AsDA1-2D. These results suggest that AsDA1-2D acts as a cysteine protease and negatively regulates oat-grain-storage-globulin under heat stress.
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