MITF-E-box 결합저해제의 신규 미백제로서의 특성

최치호 인하대학교 일반 대학원 2009 국내석사

피부색은 melanin의 양에 의해 결정되며, tyrosinase는 melanin 합성과정에서 가장 중요한 효소라고 할수있다. MITF(Microphthalmia-associated transcription factor)는 basic helix-loof-helix-zip domain을 지니고 있으며, tyrosinase와 관련 효소(TRPs)의 전사를 담당하는 주요한 이다. 고속검색방법으로 미백물질을 검색하기 위해 재조합 MITF 단백질을 이용한 단백질 칩이 제작되었으며, 단백질 3차 구조를 컴퓨터 시뮬레이션으로 분석하여 27개의 선도물질을 MITF와 E-box 결합 저해제로 선별할수 있었다. 그 중에서 가장 MITF와 E-box의 결합을 저해하는 걸로 보이는 compound #18을 선정하여 미백효과가 MITF와 E-box의 결합을 저해하여 일어나는지 확인하기 위해 동물세포실험, western blot, RT-PCR과 Electrophoretic mobility assay(EMSA)를 수행하였다. 결과적으로 MITF 단백질 칩은 MITF와 E-box의 결합을 저해하여 미백효과를 일으키는 물질을 찾을 수 있는 강력한 도구이다. Skin color is determined by the amount of melanin and tyrosinase is a key enzyme of melanin synthesis. MITF(Microphthalmia-associated transcription factor) belongs to the basic helix-loop-helix-zip family of transcription factors and is the major regulator of tyrosinase and the related enzymes(TRPs). To screen depigmenting agents by HTS(high-throughput screening) system, a protein chip containing recombinant MITF protein was constructed. Based on the computer-simulated structure, 27 chemical were selected and were investigated as a MITF-DNA binding inhibitor. Among them, compound #18 was found to show the most potent inhibitory activity against MITF-DNA binding. To confirm its inhibitory activity against MITF-DNA binding, a elecrophoretic mobility shift assay (EMSA) was performed. The depigmenting activity of compound #18 was evaluated by melanin assay, RT-PCR, and Western blot. These results indicated the potential use of the MITF-E-Box DNA chip as a screening tool for discovering effective depigmenting agents in the cosmetic industry.

비만세포 특이적 프로테아제 mMCP-6 발현 조절에 전사인자 MITF 아형이 미치는 영향

관수영 전북대학교 대학원 2007 국내석사

전사인자 MITF (mi transcription factor)는 bHLH-Zip(basic- helix-loop-helix-leucine zipper) 단백질계에 속하는 분자이다. 최근 연구에서 MITF는 비만세포의 분화 및 특이적 단백분해효소들의 전사활성을 조절하는 중요한 전사인자임이 보고되었으며, 세포조직에 따라 다수의 MITF아형이 발현하고 있음이 알려졌다. 본 연구자는 마우스 비만세포에서 발현하는 트립테이즈형 단백분해효소인 mMCP-6의 전사를 조절하는 MITF 아형을 연구하고자 하였다. 이를 위해 마우스 골수세포를 분리하여 IL-3존재 하에서 3주 이상 배양하여 미숙형비만세포를 확립하였으며, 이들을 SCF로 자극하여 피부, 근육 등에서 보이는 결합조직 비만세포로 성숙 및 분화 시킨 후 RT-PCR법을 통해 MITF아형 mRNA발현을 분석하였다. 전사인자 MITF-A, -E, H 및 Mc등의 다양한 mRNA가 배양된 미숙형비만세포에서 강하게 발현함을 관찰하였다. 그러나 분화된 결합조직형비만세포(CTMC)는 단지 전사인자 MITF-A만 발현하고 있음을 관찰하였다. 따라서 이 MITF-A가 mMCP-6 전사 활성을 조절하는지 여부를 확인하기 위해 전사인자 MITF 아형(A, E, Mc, 그리고 M)의 발현 플라스미드, mMCP-6 프로모터가 삽입된 luciferase 그리고 전사인자 MITF anti-sense 발현 플라스미드를 준비하였고, 각각의 전사인자 MITF 아형의 발현 플라스미드는 mMCP-6 프로모터 플라스미드와 함께 NIH3T3 세포에 형질도입 하였다. 이를 통하여 mMCP-6 전사활성이 MITF-A의 형질도입에 의해 의미 있게 증가됨을 확인하였다. 또한 비만세포에서 트립테이즈 합성 및 세포질내의 과립량이 전사인자 MITF-A도입에 의해 유의성 있게 증가하였다. 반면에 이들 합성은 전사인자 MITF anti-sense 도입에 의해서는 감소되었다. 이러한 결과들은 전사인자 MITF-A가 마우스 결합조직 비만세포에서 mMCP-6의 전사조절에 중요한 인자 일 것으로 생각된다. mi transcription factor (MITF) is a member of the basic-helix-loop- helix-leucine zipper (bHLH-Zip) protein family of transcription factors. Recent studies have showed that MITF regulated the expression of mouse mast cell-specific serine protease (mMCP-6). In this study, we investigated alternative isotypes of MITF regulating the transcription of mMCP-6 in mouse mast cells. The expression of MITF isotypes was determined by RT-PCR. I found that MITF-A, -E, -H and -Mc were expressed in cultured mast cells, and MITF-A was expressed highly in connective tissue-type mast cells (CTMC). To examine whether mMCP-6 transcription was influenced by MITF-A expressed in CTMC. I prepared expression plasmids containing cDNA of MITF isotypes (A, E, Mc, and M), mMCP-6 promoter-inserted luciferase, and MITF anti-sense expression plasmid, expression plasmids of each MITF isotype were cotransfected into NIH-3T3 cells with mMCP-6 promoter plasmid. I observed that the level of mMCP-6 transcription was increased significantly by transfection of MITF-A. The tryptase activity also was increased by MITF-A, but decreased by MITF anti-sense. Moreover, the granules were increased after transfection with MITF-A. These results support that MITF-A may be an important factor on regulating the transcription of mMCP-6 in mouse connective tissue mast cells.

멜라닌 세포에서 tetrahydroquinoline 유도체의 MITF 발현 억제

최용표 충북대학교 2017 국내석사

Alpha-melanocyte stimulating hormone (α-MSH) is the most important melanocyte-stimulating hormone in stimulating melanogenesis. α-MSH binds to melanocortin 1 receptor (MC1R), which induces the activation of adenylyl cyclase, followed by cAMP production. cAMP leads to phosphorylation of CREB transcription factors, which in turn stimulate microphthalmia-associated transcription factor (MITF) promoter activation. MITF directly binds to the promoter regions of tyrosinase. In turn, MITF induces expression of tyrosinase for skin pigmentation. The present study aimed to investigate the antimelanogenic effect of 1-propionyl-N-(2-hydroxyphenyl)-1,2,3,4-tetrahydroquinoline-2-carboxamide (EL-B-02) on α-MSH-activated B16F0 melanoma cells. EL-B-02 did not display any significant cytotoxicity up to 100 μM. EL-B-02 efficiently reduced melanin productions induced by α-MSH, dibutyryl-cyclicAMP (db-cAMP) or histamine. Moreover, to investigate the in vivo effect of EL-B-02, i carried out topical treatment with EL-B-02 in UV-irradiated dorsal skins of guinea pig. EL-B-02 suppressed skin pigmentation as compared with the vehicle group. In addition EL-B-02 decreased UV-B induced tyrosinase/MITF expression in guinea pig skin tissue. Furthermore, EL-B-02 decreased α-MSH-induced mRNA and protein level of tyrosinase, also decreased α-MSH-induced transcriptional activity of tyrosinase, but EL-B-02 did not directly affect catalytic activity of cell-free tyrosinase. EL-B-02 decreased α-MSH-induced mRNA and protein level of MITF, also decreased transcriptional activity of MITF. EL-B-02 did not affect CREB and β-catenin phosphorylation but EL-B-02 decreased α-MSH-induced protein level of PAX3. Based on the findings, EL-B-02 has inhibitory effects for cellular melanogenesis by decreasing the expression of tyrosinase/MITF, resulting in the suppression of melanin synthesis. However, it is unknown how PAX3 is regulated in melanocytes. So it requires additional experiments. Furthermore, EL-B-02 showed significant depigmenting effects in guinea pig skin. Thus, here i suggest that EL-B-02 may have potential effects for skin whitening.

MITF- and SFRP5-derived Peptides Inhibit Melanogenesis via Suppression of MITF and Wnt activity

임동영 강원대학교 일반대학원 2016 국내박사

피부에 자외선이 노출되면 표피의 멜라닌세포에서 멜라닌이 생성되어 피부를 보호하게 된다. 그러나 과도한 멜라닌 생성은 Melanoma, Nevus, Freckles와 같은 질환을 유발할 수 있다. 멜라닌은 멜라닌세포에서 합성되며 다양한 분자적 신호가 관여하게 된다. cAMP/PKA과 WNT/β-catenin 신호전달경로는 멜라닌 합성에 관여하는 대표적인 경로이다. cAMP/PKA 경로는 cAMP Response Element Binding Protein (CREB) 전사인자 발현을 유도하고, 그 결과 멜라닌세포의 증식과 멜라닌색소의 합성을 조절하는 Master Regulator인 Microphthalmia-associated Trascription Factor (MITF)를 활성화 시킨다. 반면, 분비된 WNT protein이 멜라닌세포 표면에 분포되어 있는 Frizzled Receptor와 LRP5/6에 결합하게 되면 WNT/β-catenin 신호전달경로가 활성화된다. 그 결과 GSK-3β가 감소되고, β-catenin는 안정화되어 세포질 내에 β-catenin이 증가하게 된다. 활성화된 MITF와 안정화된 β-catenin은 핵 안으로 이동하여 멜라닌 합성과 세포 생존에 관여하는 Tyrosinase나 BCL-2와 같은 유전자들의 프로모터부위에 결합하여 이 유전자들의 전사를 유도한다. 이러한 멜라닌 합성에 관여하는 신호전달경로를 억제하는 미백소재들이 많이 개발되고 있지만, MITF나 WNT 경로를 직접적인 표적으로 하는 멜라닌 합성저해연구는 보고된 바가 적다. 본 연구의 목적은 MITF와 SFRP5로부터 유래한 펩타이드들의 멜라닌합성 억제 기전을 규명하는 것이다. B16F1 melanoma cell에 처리하였을 경우, MITFpepC는 MITF의 Tyrosinase Promoter Region 결합을 농도의존적으로 감소시켰으며, SFRP5pepD는 MITF와 β-catenin의 핵으로의 이동 및 MITF와 β-catenin의 결합을 농도 의존적으로 감소시킴을 확인할 수 있었다. 다음으로 다양한 농도의 MITFpepC와 SFRP5pepD를 B16F10 세포와 사람 멜라닌세포에 처리할 경우, 멜라닌세포의 성장, 타이로시네이즈 활성 및 멜라닌 생성이 펩타이드 처리농도에 비례하여 감소함을 확인하였다. 또한 Tyrosinase, Tyrosinase-Relative Protein1, 2와 같은 멜라닌합성 관련효소들의 발현이 감소함을 확인하였다. Skin hairless mouse 이용한 in vivo 실험에서는 펩타이드들이 처리된 표피에서 멜라닌 생성이 억제됨을 조직화학염색법을 통해 확인하였다. 이러한 결과들은 MITF와 SFRP5로부터 유래된 펩타이드들이 Melanoma의 예방 또는 치료용 약제 개발과 피부 미백용 및/또는 피부 색소 침착 억제용 화장료 소재 개발에 널리 이용될 수 있음을 보여 준다. Melanin is synthesized by melanocytes in skin epidermis and provides a vital protection against the ultraviolet radiation of the solar light. UV-exposed keratinocytes secrete α-MSH, which then activates cyclic adenosine monophosphate/protein kinase A (cAMP/PKA) signaling and subsequently upregulates the expression of microphthalmia-associated transcription factor (MITF), the master regulator of melanogenesis, through the phosphorylation and activation of the cAMP response element binding protein (CREB) transcription factor. On the other hand, canonical Wnt/β-catenin is activated by Wnt family of secreted glycolipoproteins and stabilizes β-catenin by inhibiting GSK-3β through the Wnt signalosome. Upregulated MITF and stabilized β-catenin are translocated into nucleus and bind the target genes for melanogenic enzymes including tyrosinase, tyrosinase related protein-1 (TYRP1), and tyrosinase related protein-2 (TYRP2). In this study, we investigated the effects of MITF and Sfrp5 antagonist peptides on melanogenesis and molecular mechanisms underlying their anti-melanogenic activity both in vitro and in vivo. Our findings showed that the treatment of melanocytes with the MITF and Sfrp5 antagonist peptides inhibited α-MSH-induced melanin production and TYR activity. Furthermore, MITF and Sfrp5 antagonist peptides reduced the expression of the melanogenic enzyme genes at both mRNA and protein levels in a dose-dependent manner. We have also found that MITF and Sfrp5 antagonist peptides inhibited the formation of MITF/β-catenin complexes, leading to an overall decrease in melanin synthesis. These results collectively suggest that MITF and Sfrp5 antagonist peptides could be promising candidates for the treatment of melanogenesis-associated disorders.

인간비만세포에서 트립타아제 유전자 발현에 전사인자 MITF-A 아형이 미치는 영향

이선희 전북대학교 대학원 2009 국내석사

Mast cells play a central role in initiation and development of allergic diseases through release of various mediators. Tryptase may be a key mediator in mast cell-mediated inflammatory reactions. In the present study, we investigated whether the transcription of tryptase gene in human mast cells was involved in mi transcription factor (MITF). We observed that the human CD34+ progenitor drived cultures and HMC-1 cell line mast cells expressed strongly MITF-A, which is one of MITF isoforms. The overexpression of MITF-A elevated the production of tryptase in the immature human mast cell line HMC-1, while the introduction of specific siRNA against MITF attenuated their expression. Moreover, the transfection of MITF-A overexpression vector and tryptase promoter region-harboring reporter plasmid into Jurkat cells (MITF-negative) increased significantly the luciferase activity. Using mutant constructs of tryptase promoter, we identified that two E-box (CANNTG) motifs associate with MITF-A to transactivate tryptase gene. An experiment by EMSA also showed that these E-box are able to bind to MITF for tryptase gene transcription. These data suggest that MITF might play a role in regulating the transcription of tryptase gene in human mast cells. 비만세포는 다양한 알러지 유발 매개물을 통해 일어나는 알러지의 개시와 전개에 중요한 역할을 한다. 단백질분해 효소인 트립타아제는 비만세포 매개 염증반응의 중요한 매개물이다. 전사인자 MITF (mi transcription factor)는 bHLH-Zip(basic- helix-loop-helix-leucine zipper) 단백질계에 속하는 분자이다. 비만세포의 분화 및 특이적 단백분해효소들의 전사활성을 조절하는 중요한 전사인자임이 보고되었으며, 세포조직에 따라 다수의 MITF아형이 발현하고 있음이 알려졌다. 최근 마우스 골수유래 비만세포에서 MITF 아형 중MITF-A가 강하게 발현함을 보고하였다. 본 연구자는 인간비만세포에서의 트립타아제 유전자의 전사활성이 MITF와 관련함에 대하여 연구하였다. 이를 위해 인간 제대혈에서 전구세포를 분리하여 IL-3, SCF, IL-6존재 하에서 8주 이상 배양하여 성숙 및 분화 시킨 비만세포와 비만세포 세포주를 RT-PCR법을 통해 MITF아형 및 트립타아제 아형 mRNA발현을 분석하였다. 배양된 비만세포 세포주에서 전사인자 MITF-A, -E, H 의 다양한 mRNA가 강하게 발현함을 관찰하였다. 그러나 제대혈로부터 분화된 비만세포에서는 전사인자 MITF-A만 발현하고 있음을 관찰하였다. 트립타아제 아형 mRNA는 세포주와 제대혈로부터 분화된 비만세포주 모두에서 트립타아제 베타1 만이 발현함을 관찰하였다. 따라서 MITF-A가 트립타아제 전사 활성을 조절하는지 여부를 확인하기 위해 전사인자 MITF-A강제발현 프라스미드를 합성하였고, 트립타아제 프로모터영역을 삽입한 repoter 벡터 그리고 이들을 일정크기로 삭제하거나 점돌연변이 시킨 프라스미드를 제작하였다. 강제발현 프라스미드를 트립타아제 프로모터 프라스미드와 함께 Jurkat 세포에 형질도입 하였을 때. 트립타아제 전사활성이 MITF-A의 형질도입에 의해 의미 있게 증가됨을 확인하였다. 트립타아제 프로모터 영역을 일정크기로 단계적으로 삭제한 reporter 프라스미드를 HMC-1에 형질도입 할 경우 -817~-715 사이와 -421~-202 사이의 프로모터 영역이 삭제된 경우에서 Luciferase 활성이 유의적으로 감소함을 관찰하였다. 이 영역에 MITF 결합예상부위인 E-box (CANNTG)가 각각 1개씩 존재하였다. 이들 결합부위를 점돌연변이 시킨 reporter 프라스미드를 HMC-1에 도입 할 경우 전사 활성이 감소함을 확인하였다. EMSA에서 또한 두 전사인자결합부위 모두에 MITF가 결합을 확인하였다. 한편, 미성숙 비만세포주에 MITF-A의 강제발현에 의해 트립타아제 생산이 증가되었으며 MITF 특이적siRNA 의해 트립타아제 생산이 감소되었다. 이러한 결과들은 전사인자 MITF-A가 인간 비만세포에서 트립타아제 프로모터의 E-box 와 결합하여 트립타아제 전사를 조절하는 중요한 인자 일 것으로 사료된다.

미백물질 탐색을 위한 HTS System으로서의 Protein Chip의 적용가능성에 대한 연구

양상희 인하대학교 일반대학원 2007 국내석사

MITF (Microphthalmia-associated transcription factor) plays a key role in the pigmenting process in the skin. Binding of MITF on its DNA binding domain, E-box of the corresponding promoter, initiates the production of melanin, a key determining factor of skin color. A protein chip was developed to screen the depigmenting agents. MITF was produced as a fusion protein of maltose binding protein (MBP) and was immobilized on a cyclodextrin-coated glass plate. Binding of Cy-3 labeled 8-mer E-box DNA was monitored by fluorescence. Kinetics of DNA binding with MITF showed Langumuir isotherm and its kinetic constants were determined. Based on the computer-simulated structure, 27 chemicals were selected and were investigated as a MITF-DNA binding inhibitor. Reasonable correlation of melanin synthesis inhibition was observed between the chip-based estimation and cell-based melanin assay. This result showed that MITF chip can be used as a HTS screening tool of depigmenting agents. 미백물질의 high-throughput screening (HTS) system으로서 protein chip의 적용가능성을 확인하고자 이 실험을 수행하였다. 피부색을 결정 짓는 melanogenesis의 주요 조절 인자인 Microphthalmia transcription factor (MITF)와 MITF의 주 결합 DNA인 tyrosinase promoter의 결합 (protein-DNA결합)을 protein chip에 적용하여 depigmenting agent 선별에 응용하였다. Maltose Binding Protein(MBP)과 fusion하여 생산(MBPMITF)된 MBP-MITF를 cyclodextrin으로 코팅된 유리기판에 고정시키는 방법을 이용하여 protein chip을 제작하고, tyrosinase promoter 내 MITF와의 특이적인 결합 부위인 E-box (CATGTG)를 기준으로 제작한 22-mer의 oligonucleotide를 Cy3로 표지 하여 형광으로 그 결합 정도를 측정하였다. MITF와 DNA의 결합 반응 정도는 Langumuir isotherm으로 보이고 그 반응 상수를 구하였다. MITF와 tyrosinase promoter의 결합 저해 인자로써는, 현재까지 알려진 MITF와 tyrosinase의 결합 구조를 토대로 Chemical DB를 통해 MITF 내 결합부위의 구조적 특징을 확인 하고 결합 저해 가능성이 있는 27개의 후보물질을 virtual screening을 통해 선별·합성하였다. 이 경쟁자 물질들을 protein chip에 적용하여 효과를 보이는 후보물질을 선정하고, cell test를 통해 최종 3개의 물질을 선정 하여, 그 저해 효과를 확인하고 수치화 하였으며, Electrophoretic Mobility Shift Assay를 통해 sample 처리 전후의 단백질과 DNA의 결합 정도 변화를 확인 하였다.

Microphthalmia-associated Transcription Factor Regulates the Differentiation and Function of Myeloid-derived Suppressor Cells

이아람 숙명여자대학교 대학원 2022 국내박사

Myeloid-derived suppressor cell (MDSC) are immature immune suppressive cells observed in tumors, infections, and autoimmune diseases. They are identified as two major subtypes in mice, either granulocytic polymorphonuclear-MDSCs (PMN-MDSCs, Ly6G+Ly6ClowCD11b+), and monocytic-MDSCs (MO-MDSCs, Ly6G-Ly6ChighCD11b+) and both populations strongly suppress the immune response through diverse mechanisms. Microphthalmia-associated transcription factor (MITF), a basic/helix-loop-helix/leucine zipper (b-HLH-Zip) transcription factor, is mainly expressed in melanoma cells. MITF is well known to be a master regulator of melanogenesis, and it affects survival, metastasis, cell cycle arrest, and differentiation. Recently, MITF has also been reported to be expressed in nonpigment cells, including osteoclasts, mast cells, B-cells, and natural killer (NK) cells. However, the roles of MITF in immune cell differentiation and function remain unclear. In this study, it was investigated to identify the role of MITF in the differentiation and activation of MDSCs during tumor development. It was revealed that MITF expression is significantly increased in MDSCs obtained from tumor tissue or splenocytes of tumor-bearing mice. In addition, MITF expression was induced by tumor cell-conditioned medium (TCCM) treatment during the generation of MDSCs from bone marrow (BM) cells in vitro. Treatment with IL-18 or IL-10 related with the tumor microenvironment (TME) markedly promoted the expression of MITF and MDSC activation markers. Moreover, statins, which have been known to enhance differentiation and activation of MDSCs, also induced MITF expression in BM-MDSCs. Besides, all-trans retinoic acid (ATRA), which has been known to reduce ROthe differentiation and function of tumor-associated MDSCs, suppressed the expression of MITF and activation markers of MDSCs. MITF overexpression in myeloid cells substantially promoted the immunosuppressive function of MDSCs, whereas shRNA-mediated knockdown of MITF in myeloid cells altered the immunoregulatory function of MDSCs. Furthermore, while berberine, which has been used in anticancer therapy, abrogated the immunosuppressive function of BM-MDSCs by inhibiting MITF expression, ML-329, an inhibitor of the MITF molecular pathway, suppressed the expression levels of MDSC activation markers. Similarly, nelfinavir that is recently known to suppress MITF expression altered the differentiation and activation of MDSCs through MITF inhibition. In contrast, an increase in MDSC number and activity was observed after treatment with 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), which is known to be a MITF inducer. Finally, it was observed that the tumor size is significantly reduced by a coinjection of 4T1 cells with MDSCs pretreated with MITF inhibitory small molecule, such as ML-329, compared to coinjection of 4T1 tumor cells with untreated MDSCs in tumor-bearing mice. In contrast, tumor progression is increased by a coinjection of 4T1 cells with MDSCs pretreated with MITF inducer, such as IBMX. Furthermore, immunohistochemical staining of human tumor tissues revealed that MITF+ MDSCs are more frequently observed in tumor tissues than in tumor-free draining lymph nodes (TDLNs) obtained from cancer patients. In summary, these results indicate that MITF regulates the differentiation and function of MDSCs and can be a novel therapeutic target for modulating MDSC activity in dysregulated tumor microenvironments. 골수유래억제세포 (MDSCs) 는 종양, 감염, 자가면역질환에서 관찰되는 미성숙 면역억제세포이다. 이들은 두 가지 유형 (PMN-MDSCs, MO-MDSCs)으로 나뉘며, 마우스에서 다양한 반응을 통해 강한 면역억제작용을 한다고 알려져 있다. Microphthalmia-associated transcription factor (MITF)는 주로 흑색종 세포에서 발현된다. MITF는 melanogenesis의 주요조절자로 잘 알려져 있으며, 생존, 전이, 세포 주기, 분화에 영향을 미친다. 최근 MITF는 파골세포, 비만세포, B세포, NK세포 등 멜라닌세포 이외에도 발현되며 중요한 기능을 한다고 발표된 바 있다. 그러나 MITF가 골수유래억제세포의 분화 및 기능에서의 역할은 아직까지 알려져 있지 않다. 본 연구에서는 종양 형성 시 골수유래억제세포의 분화와 활성에서 MITF의 역할에 대해 알아보았다. 종양 조직이나 비장세포에서 얻은 골수유래억제세포에서 MITF의 발현이 유의미하게 증가한 것을 관찰 하였다. 또한 in vitro에서 골수세포로부터 골수유래억제세포로 분화시키는 경우에 암 미세환경과 유사한 암 배지 처리에 의해 MITF의 발현이 증가함을 확인하였다. 암 미세환경과 관련된 IL-18과 IL-10은 MITF와 골수유래억제세포 활성마커의 발현을 촉진하였다. 또한, 골수유래억제세포의 분화와 활성을 높인다고 알려진 스타틴은 골수유래억제세포에서 MITF의 발현을 유도하였다. 이외에도 암조직내의 골수유래억제세포의 분화와 기능을 감소시키는 것으로 알려진 all-trans retinoic acid (ATRA)는 골수유래억제세포의 MITF와 활성마커의 발현을 억제하였다. 실제로 골수세포에서의 MITF 과발현은 골수유래억제세포에서의 면역억제기능을 유도하였다. 대조적으로, 골수세포에서 shRNA를 이용한 MITF 발현저해는 골수유래억제세포의 면역조절 기능을 변화시켰다. 또한, 항암 치료에 효능을 보이는 베르베린은 MITF의 발현을 저해함으로써 골수유래억제세포의 면역 억제기능을 저해하였고, MITF의 저해제인 ML-329는 골수유래억제세포의 활성마커의 발현 및 면역억제능을 저해하였다. 마찬가지로, MITF의 억제제로 스크리닝된 넬피나비르는 MITF 억제와 함께 골수유래억제세포의 분화와 활성을 억제하였다. 반대로 MITF의 유도제로 알려진 3-isobutyl-1-methylxanthin (IBMX)는 골수유래억제세포의 활성을 증가시켰다. 다음으로는 골수유래억제세포에 DMSO와 ML-329를 사전에 처리하고 마우스 유방암 세포주인 4T1과 함께 마우스에 주사하였다. DMSO를 처리한 경우는 4T1만 주사한 경우에 비해 종양 크기가 증가하였고 ML-329를 처리한 경우에는 종양 크기가 다시 4T1만 주사한 경우와 유사한 수준으로 감소하는 것을 관찰하였다. 이와는 대조적으로 IBMX를 전처리하여 4T1과 함께 마우스에 주사한 경우에는 종양 성장과 무게가 증가하였다. 마지막으로, MITF를 발현하고 있는 골수유래억제세포는 암 환자의 tumor draining lymph nodes (TDLNs)보다 종양 조직내에서 많이 관찰되었다. 이러한 결과는 MITF가 골수유래억제세포의 분화와 기능을 조절하며, 암 미세환경에서 골수유래억제세포에서의 MITF 발현조절은 암 치료에 대한 새로운 전략이 될 수 있음을 나타낸다.

Anti-melanogenic activity of phytosphingosine via modulation of microphthalmia-associated transcription factor signaling pathway

장은정 서울대학교 대학원 2015 국내석사

사람의 피부색은 유전적, 외적 요인에 의해 차이가 있으며 그 중 피부색을 결정하는 주요 요인은 멜라닌이라는 색소이다. 멜라닌은 표피의 기저층에 존재는 melanocytes에서 여러 단계에 걸쳐 합성되어지는데 이 모든 과정을 melanogenesis라고 한다. 본 연구의 대상 물질인 phytosphingosine은 세라마이드를 구성하는 스핑고이드의 일종으로 항염증, 보습 효과, 각질 강화 효능 등으로 이미 잘 알려진 물질이지만 미백 효능 및 그 기전 연구는 보고되어 있지 않다. 따라서 본 연구에서는 phytosphingosine을 이용하여 멜라닌 생성 첫 단계인 tyrosinase 및 멜라닌 생성 억제효능을 분석한 결과, 농도가 증가함에 따라 유의적으로 tyrosinase 활성과 melanocytes에서의 멜라닌 생성이 억제되었다. 또한 microphthalmia-associated transcription factor (MITF)는 멜라닌 생성시 중요한 역할을 하는 전사인자로 phytosphingosine의 MITF에 대한 저해 활성을 확인한 결과 MITF 뿐만 아니라 melanogenesis 관련 효소계인 tyrosinase, tyrosinase-related protein-1, and -2 (TRP-1, -2)의 발현을 모두 억제하였다. 더 나아가 MITF의 중요한 전사 인자인 paired box 3 (PAX3), SRY-related HMG-box 10 (SOX10), β-catenin, phospho cAMP response element binding protein (p-CREB)의 단백질 발현을 억제함으로서, MITF의 유전자 발현을 저해시킨다는 것을 확인할 수 있었다.Phytosphingosine을 12시간 이상 melanocytes에 처리하였을 때, MITF의 전사 인자들에 대한 변화 없이 MITF의 단백질 발현을 감소시켰다. 반면, MITF의 ubiquitination과 관련 있는 extracellular signal-regulated kinase (ERK)의 단백질 발현은 증가되었다. 따라서, phytosphingosine을 12시간 이상 처리시의 MITF 감소는 MAPK kinase의 활성화와 연관되어 있음을 알 수 있었다. 본 연구를 통해 phytosphingosine에 의한 MITF의 감소는 MITF의 유전자 발현을 억제시키거나 직접적으로 MITF 단백질 발현을 제어함으로서 영향을 받는 것으로 나타났다. 따라서 phytosphingosine은 melanocytes에서 MITF를 조절하여 melanogenesis를 억제하는 새로운 미백 후보물질이 될 가능성이 높을 것으로 여겨진다. Sphingolipids are ubiquitous components of the plasma membrane in animals, plants, and fungi. Of the structural analogues of sphingolipds, phytosphingosine (PSX) is well-known to be involved in many significant cellular responses including apoptosis, differentiation, and migration. Moreover, PSX is commonly used as acne treatments because of its anti-bacterial and anti-inflammatory activities. PSX also has use in cosmetic compositions, and can be found in a variety of cosmetic products as skin and hair conditioning agents. Nevertheless, its mechanism of action remains unclear. In this present study, we investigated anti-melanogenic activity of PSX and its molecular mechanism in mouse originated melan-a cells. The present findings showed that PSX significantly inhibits melanin synthesis in a concentration-dependent manner. One Plausible mechanism of the anti-melanogenic activity of PSX seems to be associated with the modulation of the microphthalmia-associated transcription factor (MITF) which suppresses the expression of tyrosinase, tyrosinase-related protein-1, and -2 (TRP-1, -2). Further analysis revealed that PSX suppressed the paired box 3 (PAX3) and SRY-related HMG-box 10 (SOX10), critical transcription factors of MITF. PSX also effectively down-regulated protein level of ?-catenin and phospho cAMP response element binding protein (p-CREB), an up-stream regulatory factor of MITF. These results were closely related with the suppression of MITF gene expression. In addition, the treatment of PSX for over 12 hours, relatively long period of time, did not directly suppressed these MITF transcriptional factors. Instead, PSX induced ERK activation which led to the MITF phosphorylation and subsequently its degradation. Therefore, the down-regulation of the MITF protein level in a long period of time exposure of PSX is in part associated with the MITF protein degradation through MAPK kinase activation pathway. In conclusion, the modulation of MITF by PSX is correlated with the signaling pathways such as the suppression of MITF gene expression and the degradation of MITF protein depending on a period of treatment time. These results suggest that PSX might serve as a candidate for an effective melanogenesis inhibitor in melanocytes via the regulation of MITF signaling pathway.

Regulation of C-X-C Chemokine Receptor Type 4 (CXCR4)- Mediated Migration of Myeloid-derived Suppressor Cells (MDSCs) by Modulating Microphthalmia-associated Transcription Factor (MITF) Expression

홍연주 숙명여자대학교 대학원 2021 국내석사

Myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) are immature myeloid cells that have immunosuppressive ability. MDSCs are recruited into tumor site by various chemokines secreted from tumor and tumor microenvironment (TME). They promote tumor growth and inhibit anti-cancer immunity by suppressing T cell activity and inducing Treg cells. In mouse and human breast cancer, MDSCs are associated with bad prognosis. Therefore, recent researches focus on inhibition of MDSCs to treat cancer. MITF is a transcription factor which regulates melanogenesis and cell survival in melanocytes and melanoma. It controls EMT-related genes and promotes survival of cancer cells. Although several studies revealed the role of MITF in non-pigment cells, such as osteoclasts and mast cells, the role of MITF in MDSCs has not been elucidated. In this study, I studied on regulation of migration of MDSCs by modulating MITF expression. Treatment of bone marrow-derived MDSCs with 4T1 tumor cell-derived culture medium (TCCM) increased expression of MDSC activation markers, such as iNOS, TGF-β, IL-10 and arginase 1, as well as MITF. BM-MDSCs with TCCM treatment showed enhanced migration ability toward CXCL12. Treatment with MITF activator IBMX induced MDSC activation in BM-MDSCs. Remarkably, IBMX enhanced the migration ability toward CXCL12. In contrast, MITF inhibitor, ML-329, suppressed MDSC activation of BM-MDSCs and hampered migration ability toward CXCL12. I estimated whether enhanced motility is caused by upregulation of chemokine receptor in BM-MDSCs. Thus, mRNA levels of several chemokine receptors were assessed to identify which chemokine receptor is affected by MITF modulation. Although CXCR1, 2, 4 mRNA expression was declined by ML-329, CXCR4 was investigated because all BM-MDSCs in transwell migration were toward CXCL12. In addition, our group has confirmed the possibility that MITF promotes MDSC activation through upregulation of HIF-1α which is known to regulate CXCR4 expression. CXCR4 expression was induced by TCCM treatment in BM-MDSCs, whereas ML-329 decreased CXCR4 expression in BM-MDSC. However, IBMX didn’t enhance CXCR4 expression in BM-MDSCs which is an unexpected result. Collectively, these results demonstrate that CXCR4-mediated migration of MDSCs can be regulated by MITF. In conclusion, regulating CXCR4 expression by MITF modulation in MDSCs may be a promising strategy to prevent tumor progression by blocking MDSC accumulation into TME. 골수유래억제세포는 면역억제 기능을 가지는 미성숙한 골수성 세포이다. 골수유래억제세포는 암 세포와 암 미세환경에서 분비하는 다양한 케모카인과 사이토카인에 의해 종양 위치로 모이며, T 세포의 활성을 억제하고 조절 T 세포를 유도함으로써 항암 면역을 억제하고 암의 성장을 촉진한다. 골수유래억제세포는 특히 유방암 환자에서 증가해 있으며 종양의 임상적 단계와 전이능력과 연관되어 있다고 알려져 있다. 또한 골수유래억제세포의 증가는 유방암 환자의 짧은 전체 생존기간을 의미하기 때문에 골수유래억제세포를 억제하고자 하는 다양한 연구가 진행되고 있다. Microphthalmia-associated transcription factor (MITF)는 주로 멜라닌세포와 흑색종에서 멜라닌 생성과 분화, 분열을 조절한다고 알려진 전사인자이다. 최근 무색소세포인 파골세포와 비만세포 등에서의 MITF 역할에 대한 연구가 진행되었으나 골수유래억제세포에서의 역할에 대해서는 연구된 바 없다. 최근 본 실험실에서 MITF의 과발현이 골수유래억제세포의 분화와 활성을 촉진한다는 것을 확인하였기 때문에 MITF의 발현이 골수유래억제세포의 이동성에 영향을 줄 수 있을 것으로 예상하고 이를 확인하기 위한 실험을 진행하였다. 우선 암 조건의 배지를 처리한 골수유래억제세포에서 활성 마커로 알려진 iNOS, TGF-β, IL-10과 MITF의 발현이 증가하는 것을 mRNA와 단백질 수준에서 확인하였다. MITF의 발현 조절에 의해 골수유래억제세포의 이동성에 변화가 생기는지 확인해보기 위해 C57BL/6의 골수세포와 LLC1 암 조건화 배지를 이용하여 만든 골수유래억제세포로 생체외 트랜스웰 이동성 실험을 설계하였다. 1, 2, 4 시간 동안 배양한 후 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 이동성을 비교해본 결과, 암 조건화 배지를 처리한 골수유래억제세포에서 더 높은 이동성을 보였으며 4시간의 결과에서 유의미한 차이를 보였다. 암 조건화 배지는 농축 후 30%로 희석한 조건에서 이동성이 가장 크게 증가하였다. 설계한 생체외 트랜스웰 이동성 실험의 조건에서 4T1 마우스 유방암 세포주를 이용해 골수유래억제세포를 만든 경우에도 암 조건화 배지를 추가하여 만든 골수유래억제세포의 이동성이 강화되었다. 다음으로, 골수유래억제세포에서MITF의 발현을 조절하였을 때 이동성에 변화가 생기는지 확인해보았다. MITF의 발현을 억제하거나 증가시킨다고 알려진 각각의 물질을 처리해보았을 때, MITF억제제인 ML-329처리로 골수유래억제세포의 이동성이 감소하였다. 반대로MITF활성제인IBMX 처리 시 골수유래억제세포의 이동성이 증가하는 것을 확인하였다. MITF 발현 조절을 통한 이동성의 변화가 케모카인 수용체 발현의 변화로 나타났다고 생각하여 ML-329 처리로 어떤 케모카인 수용체의 발현이 변화하는지 확인해보았다. ML-329 처리로 CXCR1, CXCR2, CXCR4의 mRNA발현이 감소하는 것을 확인하였다. 생체외 트랜스웰 실험이 모두 CXCL12에 대한 이동을 측정하였기 때문에 CXCL12에 대응하는 케모카인 수용체인 CXCR4의 변화가 MITF 조절에 의해 변화했을 것으로 추측하였다. 실제로 골수유래억제세포에서의 CXCR4 발현은 4T1암 조건화 배지 처리에 의해 증가하였다. 또한 ML-329 처리에 의해 CXCR4의 발현이 감소하였지만 IBMX 처리에 의해서는 CXCR4의 발현에 변화가 없었다. 요약하자면, MITF의 발현이 골수유래억제세포의 이동성을 증가시키는데 관여되어 있다는 것을 확인하였고, 이것이 CXCR4의 발현 변화를 매개할 수 있다는 가능성을 확인하였다. 그러므로, 본 연구결과로 MITF 발현 조절을 통해 골수유래억제세포의 종양 부위로의 이동을 억제하여 암을 치료할 수 있을 것이라는 새로운 접근법을 제시할 수 있었다.

포타슘 채널을 활성화시키는 CyPPA의 ERK/MITF 경로를 통한 멜라닌 생성 억제

조홍일 울산대학교 대학원 2015 국내석사

Background: The development of anti-melanogenesis agents is important for the treatment of hyperpigmentary disorders, such as lentigo and melisma. In the course of screening an ion channel-modulating chemical HTS library for inhibitors of melanogenesis in B16F10 cells, we found that CyPPA, a K+ activator, had strong anti-melanogenesis activity. Objectives: In this study, we investigated whether CyPPA would affect melanogenesis in human melanocyte and mouse Mel-Ab cells. Methods: The cell toxic effects of CyPPA on human melanocyte cells and mouse Mel-Ab cells were assessed by EZ-Cytox. To verify the effect of CyPPA on melanogenesis, human melanocytes and mouse Mel-Ab cells were treated with 0?10 μM of CyPPA for 72 h, and melanin content and tyrosinase (TYR) activity were determined. MelanoDerm™ was used to test the melanogenesis inhibitory effect of CyPPA. To investigate whether CyPPA decreases the expression levels of TYR and MITF, Mel-Ab cells were analyzed by western blot. Next, to determine whether MITF down-regulation by CyPPA is a result of the decrease in MITF mRNA expression or MITF degradation, RT-PCR assays using specific primers for MITF were performed. To understand the mechanism, we investigated whether ERK and CREB signaling pathways were involved in the inhibitory effect of CyPPA. We finally determined if the decreases in MITF and TYR levels were due to proteasome-mediated degradation induced by CyPPA treatment. Mel-Ab cells were incubated with CyPPA for 72 h in the absence or presence of the proteasome inhibitor MG132, and then melanin content was determined by western blot analysis. Results: CyPPA did not show any cytotoxic effect within the tested concentration range. CyPPA treatment significantly decreased the melanin content in a concentration-dependent manner. In MelanoDerm™, the visual evaluations revealed a significantly lower melanin content in the CyPPA-treated human skin model than in the untreated control. TYR activity of CyPPA-treated cells was dose-dependently and time-dependently reduced. Treatment with CyPPA at a concentration of 10 μM decreased both the level of TYR protein and the level of MITF. However, there was no change in MITF mRNA expression following CyPPA treatment. CyPPA induced the phosphorylation of ERK with peak levels observed at 30 min after treatment. MG132 reversed the decreases in MITF and TYR protein levels induced by CyPPA. Conclusion: CyPPA treatment suppressed melanogenesis by stimulating the degradation of MITF via its effect on the regulation of the ERK 1/2 signaling pathway. Our findings suggest that CyPPA is an ion channel modulator that antagonizes melanogenesis. It may have potential as a therapeutic agent for the treatment of hyperpigmentation.