Leuconostoc mesenteroides에 의한 Fructose에서 Mannitol로의 최적화 생물전환에 관한 연구

이구환 중부대학교 산업과학대학원 2003 국내석사

최근 전통적인 영양의 개념을 뛰어넘어 건강을 증진시키고 궁극적으로는 질병을 치료하는데 기여를 할 수 있는 기능성 식품에 대한 수요가 급격히 증가하고 있다. 기능성 식품 또는 식품첨가물 중에서 당알콜은 최근 그들의 탁월한 기능성이 알려지면서 특히 수요가 증가하고 있다. 당알코올 중에서도 만니톨은 (C_(6)H_(14)O_(6)) 식품, 화장품, 제약산업 등에 매우 광범위하게 이용되고 인체에 독성이 없어 미국 FDA에 의하여 GRAS(Generally Recognized As Safe)로 승인이 되어 이에 대한 수요량이 급격히 증가하는 추세이다. 본 연구는 Leuconostoc mesenetroides B-742를 이용하여 과당으로부터 만니톨 생산을 위한 최적 생물 전환공정을 개발하기 위한 것인데, 사용 되어진 염배지는 물 1리터에 3.0g KH_(2)PO_(4). 0.01g FeSO_(4) · H_(2)O, 0.01g MnSO_(4) · 4H_(2)O, 0.2 g MgSO_(4) · 7H_(2)O, 0.01 g NaCl, and 0.05 g CaCl_(2) 등을 사용하여 제조를 하였다. 최적공정 조건을 위하여 배양 pH, 배양 온도, 효모 추출물의 농도와 과당의 농도들이 선택이 되었고 측정 되어진 범위는 pH 4.5 to 7.5, 온도 22℃ to 34℃, 효묘 추출물의 농도 0.05 to 2.0% 와 과당의 농도는 5 to 350 g/L 의 범위였다. 연구 결과 최적 조건들은 pH 6.5, 배양온도 28℃, 효모 추출물의 농도 0.5%, 과당의 농도는 30 g/L 이었다. The production of functional foods providing health benefit is one of the fast growing fields in the food industry. Mannitol as GRAS (generally recognized as safe) is a functional food. Mannitol is about 70% as sweet as sucrose and slowly and incompletely absorbed from the intestine, suppling only about one-half energy value of glucose. Commecially, the mannitol is synthesized by catalytic or electrochemical reduction of glucose. However, as strong demand for natural products increased, biological techniques have been developed for mannitol production. The object of this study was to determine statistically optimum conditions for mannitol production by L. mesenteroides NRRL B-742. We optimized the processes' parameters such as pH, temperature, yeast extract concentration, and fructose concentration. The chosen ranges were 4.5 to 7.5 for pH, 22 to 34 for temperature, 0.05 to 2.0% for yeast extract and 5 to 350 g/l for fructose. The mineral medium consisted of 3.0 g KH_(2)PO_(4), 0.01 g FeSO_(4).H_(2)O, 0.01 g MnSO_(4).4H_(2)O, 0.2 g MgSO_(4).7H_(2)O, 0.01 g NaCl, and 0.05 g CaCl_(2) per 1 liter deionized water. The optimum values of pH, temperature, yeast extract, and fructose concentration were obtained at about pH 6.5, temperature 28℃, yeast extract 0.5%, and fructose 30 g/l. We hope that these findings are of particular importance for application of mannitol production industry.

Leuconostoc mesenteroides와 lactobacillus bulgaricus의 혼합 발효에 관한 연구

권경열 檀國大學校 大學院 1993 국내석사

Leuconostoc mesenteroides ATCC 27258과 Lactobacillus 5종으로부터 선별된 Lactobacillus bulgaricus KCCM 35463을 환원 탈지유배지에 혼합 배양하여 젖산발효 조건을 검토하였다. 혼합배양의 최적 해양조건은 10.0 %(w/v); skim milk, 0.1 %(w/v); yeast extract, 10.0 %(w/v); sucrose, pH; 6.8, 30℃이며 두 균주의 starter접종 비율은 1:1이 가장 좋았다. 배양액의 점도 변화에 영향을 미치는 sucrose 농도는 10.0%(w/v)에서 가장 효과적이였다. 혼합배양시의 pH는 각각의 단독배양보다 낮았으며, 생균수는 높았다. Leuconostoc mesenteroides의 배양여액은 Lactobacillus bulgaricus의 생육을 촉진하였으나 100℃에서 10분간 열처리에 의해 촉진력이 소실되었다. 배양액의 점도는 Leuconostoc mesenteroides의 단독배양보다는 혼합배양에서 높게 나타났다. 24시간동안 배양한 발효액의 점도와 pH는 각각 2,750cps, 3.5이였으며 생균수는 8.7×10^(9) cells/㎖이였다. Leuconostoc mesenteroides ATCC 27258 and Lactobacillus bulgaricus KCCM 35463 selected among 5 Lactobacillus strains were incubated together in reconstituted non-fat skim milk medium, and then lactic fermentation conditions were investigated. The optimum conditions for viscous lactic acid beverage fermentation by mixed culture were as follows: l.%(w/v); skim milk, 0.l%(w/v); yeast extract, 10.0%(w/v); sucrose, pH; 6.8, 30℃ and starter ratio of Leuconostoc mesenteroides ATCC 27258 to Lactobacillus bulgaricus KCCM 35463 was most effective at 1 : 1 for mixed culture of the two strains. The sucrose concentration on the production of viscous culture broth was most effective at 10 percent. The final pH of mixed culture fermentation broth was lower than that of single culture broth of each microorganism. The viable cell number of mixed culture fermentation broth was higher than that of single culture broth of each microorganism. The culture broth of Leuconostoc mesenteroides was stimulated the growth of Lactobacillus bulgaricus. But the stimulating activity disappeared when the culture broth was heated at 100℃ for l0min. The viscosity of mixed culture fermentation broth was higher than that of single culture broth of Leuconostoc mesenteroides. The total number of lactic acid bacteria and viscosity in final mixed culture broth after 24 hours of inoculation was 8.7×10^(9) cells/ml and 2,750cps, respectively.

Characterization of the major dehydrogenase related to D-lactic acid synthesis in Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ATCC 8293 : Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ATCC 8293 유래 D형젖산 생성에 관여하는 주요 단백질에 대한 특성 분석

Li Ling 충북대학교 2012 국내석사

The demand for lactic acid has been increasing considerably because of its use as a monomer for the synthesis of polylactic acid (PLA), which is a promising and environment-friendly alternative to the petroleum-derived plastics. Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ATCC 8293 is a lactic acid bacterium that converts pyruvate mainly to D-(-)-lactic acid by D-(-)-lactate dehydrogenase (ldhD). This study aims to determine the gene responsible for D-lactic acid formation, as well as to provide information of enzymes for the optically pure D-lactic acid production. A genomic analysis of L. mesenteroides ATCC 8293 revealed that 7 genes encode lactate-related dehydrogenases. According to the transcriptomic, proteomic, phylogenetic analysis, LEUM_1756 is a major gene responsible for the production of D-lactic acid. The LEUM_1756 gene, which has 996 bp encoding 332 amino acids (36.5 kDa), was cloned and over-expressed in E. coli BL21(DE3) star with an inducible expression vector pET-21a(+). The purified enzymes via Ni-NTA column chromatography showed specific activity of 4448.20 U/mg, which is sighificantly high compare to previously reported ldhs. The optimum pH and temperature for the enzyme were 8.0 and 30°C, respectively, in the pyruvate reduction reaction, and 11.0 and 20°C, respectively, in the lactate oxidation reaction. The kinetic parameters, Km and Vmax for pyruvate were 0.58 mM and 476.19 µM/min, respectively, and for lactate were 259.96 mM and 375.14 µM/min, respectively. In addition, the Kcat values of pyruvate and lactate were 2896.85 s-1 and 2282.12 s-1, respectively. The enzyme was not inhibited by Ca2+, Co2+, Cu2+, Mg2+, Mn2+, Na+, urea, while it was inhibited by 1 mM of Zn2+ and SDS. 환경오염을 일으키는 석유화학제품으로 만든 플라스틱을 대체할 수 있는 바이오폴리머인PLA(폴리락트산)에 대한 관심이 높아짐에 따라서 PLA에 생산에 단량체로 사용되는 젖산에 대한 수요도 증가하고 있다. 젖산은 D형젖산과 L형젖산을 갖고 있고 그 비율은 PLA 내열성에 영향을 준다. 따라서 순수한 D형젖산 혹은 L형젖산 생산이 필요하게 되며 화학적합성기술과 미생물발효에 의한 생산기술을 이용하여 젖산을 생산하고 있다. 한편 근래에는 바이오 기술의 발전과 함께 미생물발효를 통한 합성기술이 빠르게 부상하고 있다. Leuconostoc 속은 김치와 사우어크라우트 같은 야채발효식품에서 스타터로 이용되는 이형젖산균으로서 발효과정에 젖산, 알코올, 이산화탄소를 생성하고 있다. Leuconostoc 속 균주는 D-(-)-lactate dehydrogenase (ldhD) 효소에 의하여 pyruvate 로부터 주로 D형젖산을 생성한다. 지금까지Lactobacillus 속 균주에서의 ldhD 효소에 대한 연구가 진행되었고 Leuconostoc속 균주에서의 ldhD 효소에 대한 연구가 아직까지 미흡하다. 본 연구에서는Leuconostoc 속 균주에서 D형젖산 생성에 관여하는 유전자를 찾고 순수한 D형젖산을 생성하는데 유전적 정보를 제공해줌으로써 산업적으로 PLA생산에 starter로 이용되고자 한다. 전사체와 프로테옴 분석으로부터 LEUM_1756 유전자가 주요 D형젖산 생성에 관여하는 유전자임을 추정할 수 있다. LEUM_1756 유전자는 996 bp이고 332개 아미노산을 번역하며 유도성 플라스미드pET-21a(+)에 클론 하여 E. coli BL21(DE3) star 균주에서 발현시켰고 니켈 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 이 효소의 최적 pH와 온도는 pyruvate 환원반응과 lactate 산화반응에서 각각 8.0과 30°C, 11.0과 20°C 였다. Pyruvate의 속도 변수 Km과 Vmax의 값은 각각0.58 mM과476.19 µM/min이고 lactate의 속도 변수 Km과 Vmax의 값은 각각 259.96 mM과 375.14 µM/min 로 측정되였다. 그리고 이 효소는 Ca2+, Co2+, Cu2+, Mg2+, Mn2+, Na+, urea 등과 같은 금속이온의 저해를 받지 않고 다만 1 mM 의Zn2+ 과 SDS에 대해 제해 효과를 갖고 있다.

Characterization of bioactive substances from culture filtrate extraction of Leuconostoc mesenteroides LabMP-A04

홍연주 을지대학교 대학원 2024 국내석사

Lactic acid bacteria (LAB) have antimicrobial properties because they contain the existence of bioactive substances with low molecular weight. Previous studies have provided compelling evidence of the antimicrobial activity of cyclic dipeptides (CDPs) derived from culture filtrates (CFs) of Lactobacillus plantarum LBP-K10 and the highly effective antimicrobial probiotic Leuconostoc mesenteroides LBP-K06. These microorganisms were isolated from traditional Korean kimchi. The results of our research suggest that these Lb. plantarum LBP-K10 show significant efficacy against multidrug-resistant bacteria. However, there is limited literature on the various biological activities of Ln. mesenteroides and its low-molecular-weight compounds are present in secondary metabolites, exhibiting distinctive chemical structures. To address this issue, this study aims to investigate the impact of low-molecular-weight peptidyl derivatives ranging from 100 to 600, obtained from Ln. mesenteroides LabMP-A04, a newly isolated strain from Korean traditional fermented kimchi. The CFs obtained from the three-day cultured Ln. mesenteroides LabMP-A04 was extracted using methylene chloride and then fractionated through preparative-high performance liquid chromatography (prep-HPLC), resulting in 13 distinct fractions. The fractions were analyzed using gas chromatography Multi-Omics High Resolution Mass Spectrometry (GC-HRMS) with both electron ionization (EI) and chemical ionization (CI) techniques. The fragmentation patterns from EI and CI showed that the fractionated samples contained various CDPs. These included eight proline-based CDPs, cyclo(Thr-Pro), cyclo(Ala-Pro), cyclo(Pro-Pro), cyclo(Val-Pro), cyclo(Tyr-Pro), two cyclo(Leu-Pro), three cyclo(Phe-Pro), and cyclo(Trp-Pro). Additionally, one CDPs were not based on proline, cyclo(Leu-Leu) and a non-peptidyl compound, DL-3-phenyllactic acid, was identified in the fractionated fraction. A considerable proportion of the fractionated samples consisted of the most basic form of CDPs, 2,5-diketopiperazines. Based on this finding, it can be inferred that Ln. mesenteroides LabMP-A04 culture and/or its liquid-liquid solvent extracts can isolate bioactive CDPs. To investigate the proteins associated with the biosynthesis of CDPs, proteins were obtained from cultured Ln. mesenteroides LabMP-A04 cells and separated using weak-anion exchange chromatography. Furthermore, an analysis was conducted using ninhydrin staining with an amino acid substrate. The activity staining on native gels revealed colorless bands, indicating the presence of active proteins. The observed colored bands suggests that amino acids do not form chromophores. The colorless areas were excised and analyzed using 2D Liquid Chromatography Multi-Omics high-resolution mass spectrometry (LC-HRMS). Approximately 14 proteins were identified. The study shows that proteins are linked to CDPs biosynthesis. Two proteins are being considered for investigation: branched-chain amino acid aminotransferase (BCAAT, gi: KGB51011.1) with a molecular mass of 38 kDa, and universal stress protein (USP, gi: TLP97301.1) with a molecular mass of 15.7 kDa. The gene sequences for both proteins were obtained from the NCBI Genome Database. The first protein had a nucleotide sequence length of 1,044 bp, while the second protein had a nucleotide sequence length of 432 bp. The gene sequences of both proteins were amplified using polymerase chain reaction, inserted into the pGEM T-easy vector, and cloned into the pET-15b expression vectors using NdeI/XhoI and NdeI/BamHI, respectively. The insert was then transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS cells for efficient protein production. Protein overproduction was induced by adding isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). It was hypothesized that inducing protein overproduction with IPTG would enhance the synergistic effect by selectively synthesizing CDPs. This strategy, using recombinant proteins, has various applications in veterinary antibiotics, functional foods, and non-toxic natural food preservatives. 유산균(LAB)은 저분자 생리활성 화합물을 함유하고 있어 항균성이 있다. 선행 연구에서는 Lactobacillus plantarum LBP-K10과 매우 효과적인 항균 프로바이오틱스인 Leuconostoc mesenteroides LBP-K06의 배양추출물에서 추출한 싸이클릭 디펩타이드의 항균 활성에 대한 강력한 증거가 제시된 바 있다. 이 미생물들은 한국 전통 김치에서 분리한 것이다. 연구 결과에 따르면 Lb. plantarum LBP-K10은 다제내성균에 대해 상당한 효능을 보이는 것으로 나타났다. 그러나 Ln. mesenteroides의 2차 대사산물에 존재하는 독특한 화학구조를 나타내는 저분자 화합물에 대한 문헌은 제한적이다. 그래서 본 연구에서는 한국 전통 발효 김치에서 새로 분리한 균주인 Ln. mesenteroides LabMP-A04에서 얻은 100~600 분자량의 저분자 펩티딜 유도체가 미치는 영향에 대해 조사하는 것을 목표로 한다. 3일간 배양한 Ln. mesenteroides LabMP-A04에서 얻은 배양 여과물을 메틸렌 클로라이드를 사용하여 추출한 후 배양 추출물을 분취용 고성능 액체 크로마토그래피를 통해 분획한 결과 13개의 뚜렷한 분획물이 생성되었다. 분획물은 전자 이온화 및 화학 이온화 기법과 함께 기체 크로마토그래피 다중 오믹스 분해능 질량 분석기를 사용하여 분석하였다. 전자 이온화와 화학 이온화의 단편화 패턴은 분획 된 샘플에 다양한 사이클릭 디펩타이드가 포함되어 있음을 보여주었다. 여기에는 프롤린 기반의 싸이클릭 디펩타이드 11개, cyclo(Thr-Pro), cyclo(Ala-Pro), cyclo(Pro-Pro), cyclo(Val-Pro), cyclo(Tyr-Pro), cyclo(Leu-Pro) 2개, cyclo(Phe-Pro) 3개, cyclo(Trp-Pro)가 포함되었다. 또한 비프롤린 기반 사이클릭 디펩티드 1개, cyclo(Leu-Leu) 비펩티딜 화합물 DL-3-phenylactic acid도 확인되었다. 분획 된 샘플의 상당 부분은 가장 기본적인 형태의 사이클릭 디펩타이드인 2,5-디케토피페라진으로 구성되어 있었다. 이 결과를 바탕으로, Ln. mesenteroides LabMP-A04 배양 및/또는 그 액체-액체 용매 추출물이 생리활성 싸이클릭 디펩타이드를 분리할 수 있다고 추론할 수 있다. 사이클릭 디펩타이드의 생합성과 관련된 단백질을 조사하기 위해 배양된 Ln. mesenteroides LabMP-A04 세포에서 단백질을 얻고 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 분리하였다. 또한 아미노산 기질로 닌히드린 염색 반응을 이용하여 분석을 수행하였다. Native PAGE 겔의 활성 염색은 활성 단백질의 존재를 나타내는 무채색의 밴드를 나타냈다. 관찰된 무채색의 밴드는 아미노산이 발색단을 형성하지 않음을 시사한다. 무채색 밴드 부위을 절제하고 액체 크로마토그래피 다중 오믹스 분해능 질량 분석기을 사용하여 분석하였다. 이를 통해 약 14개의 단백질이 확인되었다. 이 연구는 단백질이 사이클릭 디펩타이드 생합성과 관련이 있음을 보여준다. 분자량이 38 kDa인 branched-chain amino acid aminotransferase (BCAAT, gi: KGB51011.1)와 분자량이 15.7 kDa인 universal stress protein (USP, gi: TLP97301.1) 두 가지 단백질이 사이클릭 디펩타이드 생합성과 관련될 것으로 예상하였다. 두 단백질의 유전자 서열은 NCBI 게놈 데이터베이스에서 얻었다. 첫 번째 단백질의 유전자 서열 길이는 1,044 bp이고, 두 번째 단백질의 유전자 서열 길이는 432 bp로 확인되었다. 두 단백질의 유전자 서열을 중합효소연쇄반응을 사용하여 증폭하고, pGEM T-easy 벡터에 삽입한 후 각각 NdeI/XhoI 및 NdeI/BamHI를 사용하여 pET-15b 발현 벡터에 클로닝하였다. 그런 다음 효율적인 단백질 생산을 위해 plasmid DNA를 E. coli BL21(DE3) pLysS 세포로 형질 전환하였다. isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)를 첨가하여 단백질 과잉 생산을 유도하였다. IPTG로 단백질 과생산을 유도하면 CDPs를 선택적으로 합성하여 시너지 효과를 높일 수 있을 것이라는 가설을 세웠다. 재조합 단백질을 이용한 이 전략은 동물용 항생제, 기능성 식품, 무독성 천연 식품 보존제 등에 다양하게 응용될 수 있을 것이다.

Leuconostoc mesenteroides 균주를 이용한 호상 마늘 발효물 제조와 특성

조재곤 경북대학교 농업개발대학원 2009 국내석사

Production of garlic yoghurt fermented by Leuc. mesenteroides in the presence of various functional ingredients was optimized. A mucilage producing lactic acid bacterium isolated from carrot juice was identified as Leuconostoc mesenteroides by API 50CHL kit and 16S rDNA sequencing. The mucilage in fermented garlic was highly produced at the concentration of 15% sucrose, resulting in higher consistency with 20~21.8 Pa·sn. sucrose, resulting in higher consistency with 20~21.8 Pa·sn. The garlic pre-treated with microwave showed the stability of garlic paste without phase separation and color change as well as increased acceptability without particular pungent flavor. The garlic paste treated by microwave-heating only contained 243 mg% alliin without allicin content. The consistency of fermented garlic was decreased by the addition of 15% (w/v) carrot juice and then increased after cold storage. In particular, carrot juice and wild strawberry powder enhanced the flavor in fermented garlic paste. The garlic paste fermented by Lactobacillus delbruekii showed the phase separation without mucilage production. The viable cell counts of fermented garlic paste showed 7.4 × 1010 ~ 7 × 109 CFU/mL and decreased after cold storage for 7 days indicating 1 × 1010 ~ 4 × 108 CFU/mL. The garlic paste fermented with 15% sucrose and 15% carrot juice showed 99.9% sugar conversion. The set-type garlic yoghurt was produced by Leuc. mesenteroides with the addition of sucrose. In particular, the addition of carrot juice enhanced the acceptability, nutritional value of fermented garlic paste. The fermented garlic paste with mucilage also enhanced the rheological and functional properties. 본 연구에서는 당근주스에서 분리한 Leuconostoc mesenteroides를 마늘에 열처리와 습식분쇄를 통하여 마늘의 단점을 제거시키고, 시판하는 당근 주스를 이용하여 점질물 다당류 생성에 대한 실험을 실시하였으며 다양한 기능성 소재를 첨가하여 기호성, 안정성 및 영양학적 가치를 높인 호상의 마늘발효물(요거트)의 최적생산방법을 확립하고자 하였다. 1. 당근 생즙에서 분리한 점질물 생성 젖산균은 API 50 CHL Kit와 16S rDNA sequencing 에 의해 Leuconostoc mesenteroides 균주로 동정하였다. 2. 점질물 다당류 생산을 위해 습식분쇄한 마늘에 첨가한 sucrose의 최적 농도는 15%(w/v)로 나타났으며, sucrose를 첨가하지 않은 발효물과 sucrose를 첨가할 경우의 점조도는 각각 1.03 - 1.26 Pa·sn 과 20 - 21.83 Pa·sn 을 나타내었다. 3. 마늘의 열처리 유・무를 비교하였을 때 microwave 처리한 마늘은 습식 후 층분리가 일어나지 않고 발효 후 색의 변화도 없었는 반면 microwave 처리하지 않은 마늘은 층분리가 쉽게 일어나고 발효 후의 색 변화와 마늘의 톡쏘는 냄새 때문에 사용이 어려웠다. 4. 마늘에 당근주스를 15%(w/v) 첨가한 경우 점성은 11.03 Pa·sn 로 감소시켰지만 냉장저장 후 다시 증가하는 현상을 보였다. 또한 당근주스는 남아있던 마늘 특유의 냄새를 완전히 제거하였고, 복분자 1%(v/v) 첨가 시에 점조도 값이 10.37 Pa․sn 로 나타났다. 5. 젖산균주로 Leuconostoc mesenteroides 대신에 Lactobacillus delbruekii를 사용한 경우를 대비하여 젖산균주에 따른 발효물의 점질성 및 조직감 차이를 확인한 결과 Lactobacillus delbruekii의 경우 발효는 진행되었으나 점도 형성에 아무런 영향을 주지 않았고 저장성 test시 바로 층분리가 일어나는 것을 알 수있었다. 6. 생균수 측정 결과 마늘 원액과 X 7.5로 희석한 발효물 각각 7.4 × 1010 CFU/mL, 7 × 109 CFU/mL로 높은 값을 나타냈다. 냉장저장 1주일 후는 전체적으로 감소하는 경향을 나타냈지만 1 × 1010 CFU/mL, 4 × 108 CFU/mL로 높게 나타났다. 7. 본 실험에서 사용한 40% 습식분쇄한 마늘의 alliin, allicin 분석 결과 알리신(allicin)은 불검출 되었으며, 유효성분인 알린(alliin)은 243.06mg/100g 함유된 것으로 나타났다. 8. 마늘 발효물의 당 분석 결과 sucrose15%, 당근주스 15% 첨가된 발효물의 당 전환률은 약 99.9% 로 실험에서 수행한 발효물에 첨가되는 sucrose는 발효 후 모두 전환되었다고 볼 수 있다. 본 실험의 연구 수행 결과, 당근주스가 첨가된 호상의 마늘 발효물에 sucrose를 첨가함으로써 점질물을 생성할 수 있었으며, 당근주스를 첨가하므로써 기호, 영양의 함량이 높은 마늘 발효물을 제조할 수 있게 되었다. 또한 최적 조건에서 생산된 마늘 발효물은 개선된 맛과 물성으로 인하여 기능성 및 안정성이 확보된 호상의 마늘 발효물을 제조할 수 있었다. 본 연구에서는 마늘을 이용하여 점질물 생성이 우수한 김치 젖산균(Leuc. mesenteroides)을 이용하고, 다양한 기능성 소재를 이용함으로써 기호성, 안정성 및 영양적 가치를 높인 마늘 발효물의 최적화 방안을 알아보았고, 이의 응용으로 다양한 과실 엑기스의 소재를 이용한 젖산발효를 통한 마늘 발효물을 제조하였다.

김치로부터 분리한 Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides가 생산하는 Bifidobacterium 성장 자극 물질의 분리 및 특성

권윤경 대구가톨릭대학교 대학원 2021 국내석사

Bifidobacterium is known as a beneficial bacteria in the human gut, and some strains of the genus Bifidobacterium are used as probiotics. The purpose of this study is to find out bifidogenic growth stimulator (BGS)-producing lactic acid bacteria (LAB) that stimulate the growth of Bifidobacterium. Seven hundred three strains, isolated from kimchi, were used BGS screening. We selected the K748 strain, which showed the highest BGS activity of 320 AU/ml. This strain was identified as Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides using 16s rDNA sequencing and carbohydrate fermentation test, and the strain was named as L. mesenteroides K748. Measurements of the growth and BGS activity of L. mesenteroides K748 in the MRS medium showed BGS activity from 12 hours after incubation and maintained maximum activity (320 AU/ml) after 15 hours. Thus, BGS production of L. mesenteroides K748 was begun after the stationary phase. When incubating B. longum, addition of L. mesenteroides K748 culture supernatant increased significantly the growth of B. longum. Also, ethyl acetate extract of L. mesenteroides K748 culture supernatant increased significantly the growth of B. longum. Based on this result, ethyl acetate extract was used for HPLC and LC-MS analysis. DHNA, known as one of the BGS, was used as a standard material. Through HPLC analysis, both of DHNA and ethyl acetate extract of L. mesenteroides K748 were confirmed peaks at retention time of 7.5 minutes. Through LC-MS analysis, the molecular weight of DHNA and ethyl acetate extract of L. mesenteroides K748 was found to be 204.1. Collectively, we confirmed that L. mesenteroides K748 produced DHNA which stimulates the growth of Bifidobacterium.

김치에서 분리된 Leuconostoc mesenteroides 균주의 안전성 관련 유전체적 특성 분석

김민경 동덕여자대학교 일반대학원 2026 국내석사

발효식품에 적용 가능한 안전한 종균 후보를 선발하기 위해 김치에서 분리한 Leuconostoc mesenteroides 257개 균주를 대상으로 항생제 감수성 평가를 수행하였다. 항생제의 종류 및 cut-off value는 EFSA 가이드라인에 따라 설정하였으며, 그 결과 모든 균주는 ampicillin, chloramphenicol, clindamycin, erythromycin, gentamicin 및 tetracycline에 대해 감수성을 나타냈다. 반면, kanamycin과 streptomycin에 대해서는 각각 257개 균주(100%)와 249개 균주(96.9%)가 EFSA에서 제시한 cut-off value(kanamycin 16 mg/L, streptomycin 64 mg/L)를 초과하는 MIC 값을 보였다. 이에 kanamycin 및 streptomycin 내성이 Leu. mesenteroides의 내재형(intrinsic) 특성인지 여부를 확인하기 위해, 두 항생제에 대해 동시에 높은 MIC 값을 보인 균주 DMLM18과 낮은 MIC 값을 보인 대조 균주 DMLM17을 선별하여 전장유전체 분석을 수행하였다. 그 결과, kanamycin 내성과 관련된 것으로 알려진 aminoglycoside 6′-N-acetyltransferase (aacA) 유전자는 core 유전자로 확인된 반면, streptomycin 내성과 관련된 streptomycin 3″-adenylyltransferase (aadA) 유전자는 균주 특이적(accessory) 유전자로 확인되었다. 또한 aminoglycoside 계열 항생제 내성에 관여하는 것으로 보고된 core 유전자인 16S rRNA, rpsL, gidB 유전자 서열에서 내성과 연관된 변이가 추가적으로 확인되었다. 이러한 유전체 분석 결과를 EFSA의 항생제 감수성 평가 가이드라인에 근거하여 해석함으로써, 각 내성 관련 유전자가 내재형 인자인지 혹은 획득형 인자인지를 종합적으로 판단하였다. To identify safe starter culture candidates for fermented foods, antimicrobial susceptibility was evaluated in 257 Leuconostoc mesenteroides strains isolated from kimchi. The antimicrobial agents tested and their corresponding cut-off values were determined in accordance with the European Food Safety Authority (EFSA) guidelines. As a result, all strains were susceptible to ampicillin, chloramphenicol, clindamycin, erythromycin, gentamicin, and tetracycline. In contrast, 257 strains (100%) and 249 strains (96.9%) exhibited minimum inhibitory concentrations (MICs) exceeding the EFSA cut-off values for kanamycin (16 mg/L) and streptomycin (64 mg/L), respectively. To determine whether resistance to kanamycin and streptomycin represents an intrinsic characteristic of Leu. mesenteroides, whole-genome sequencing was performed on strain DMLM18, which showed simultaneously high MICs for both antibiotics, and on strain DMLM17, which exhibited low MICs and served as a reference strain. Comparative genomic analysis revealed that the aminoglycoside 6′-N-acetyltransferase gene (aacA), which has been associated with kanamycin resistance, was identified as a core gene. In contrast, the streptomycin 3″-adenylyltransferase gene (aadA), known to contribute to streptomycin resistance, was identified as a strain-specific accessory gene. In addition, sequence variations associated with aminoglycoside resistance were identified in core genes encoding 16S rRNA, rpsL, and gidB. Based on these genomic findings and EFSA antimicrobial susceptibility assessment criteria, each resistance-associated determinant was further classified as either intrinsic or acquired. To identify safe starter culture candidates for fermented foods, antimicrobial susceptibility was evaluated in 257 Leuconostoc mesenteroides strains isolated from kimchi. The antimicrobial agents tested and their corresponding cut-off values were determined in accordance with the European Food Safety Authority (EFSA) guidelines. As a result, all strains were susceptible to ampicillin, chloramphenicol, clindamycin, erythromycin, gentamicin, and tetracycline. In contrast, 257 strains (100%) and 249 strains (96.9%) exhibited minimum inhibitory concentrations (MICs) exceeding the EFSA cut-off values for kanamycin (16 mg/L) and streptomycin (64 mg/L), respectively. To determine whether resistance to kanamycin and streptomycin represents an intrinsic characteristic of Leu. mesenteroides, whole-genome sequencing was performed on strain DMLM18, which showed simultaneously high MICs for both antibiotics, and on strain DMLM17, which exhibited low MICs and served as a reference strain. Comparative genomic analysis revealed that the aminoglycoside 6′-N-acetyltransferase gene (aacA), which has been associated with kanamycin resistance, was identified as a core gene. In contrast, the streptomycin 3″-adenylyltransferase gene (aadA), known to contribute to streptomycin resistance, was identified as a strain-specific accessory gene. In addition, sequence variations associated with aminoglycoside resistance were identified in core genes encoding 16S rRNA, rpsL, and gidB. Based on these genomic findings and EFSA antimicrobial susceptibility assessment criteria, each resistance-associated determinant was further classified as either intrinsic or acquired.

Functional study of Lactobacillus sakei and Leuconostoc mesenteroides isolated from Kimchi

박자민 성균관대학교 일반대학원 2015 국내석사

The Kimchi samples were acquired from Seoul, Gwangju, Andong, Suncheon, and Damyang. From Kimchi liquid sampled from each Kimchi, 114 strains were separated from Lactibacillus sakei and 98 strains were separated from Leuconostoc mesenteroides. Several experiments were held in steps with the separated strains, and the outstanding ones were selected among the strains. The first experiment was held to find if the separated strains grow well in a condition similar with human body. So the testing environment was set as 37℃ and oxygen-free. In the experiment with Lactobacillus sakei, 3 strains could not grow at 37℃, and 19 strains could not grow in oxygen-free circumstance. In the experiment with Leuconostoc mesenteroides, 4 strains could not grow at 37℃ while all strains grew in oxygen-free circumstance. The selected strains underwent tests to figure out antioxidant, antitumor effect, and anti-inflammatory. The result of antioxidant test did not show any significant difference with the test result of LGG strains that were used as control strains. Yet, most of the strains showed more than 60% of the free radical scavenging ability. In the antitumor effect test, the strains were found to hinder the cell lines growth in HT-29, MCF 7, and HeLa cell line. Lastly, in the anti-inflammatory test using RAW 264.7 cell line, Lactobacillus sakei and Leuconostoc mesenteroides were found to be effective at lowering nitric oxide. After selecting 10 strains from each species that have outstanding vitality through the previous experiments. As the RAPD test was intended to identify the dissimilarity of DNA sequence, the selected strains present different DNA sequence even though their species are same. In the antibacterial activity test, the degree of vitality was identified by the size of inhibition zone that forms by agar-well diffusion. Lactobacillus sakei was found to have good antibacterial activity. The degree of adipocyte differentiation was identified through Oil-red-O staining that comes out after differentiating Lactobacillus sakei and Leuconostoc mesenteroides together during the adipocyte differentiation process of C3H10T1/2 cell line. In the experiment with Lactobacillus sakei, the differentiation of AM2 and ADM14 strains was controlled the most. In the experiment with Leuconostoc mesenteroides, the differentiation of S-YRWM27 and S-YRWM28 strains was controlled the most. AM2 and ADM14 decreased the expression of the genes compared with the controls. The growth curve of the 4 strains was studied at 15℃, 20℃, 30℃, and 37℃. Since ADM14 showed outstanding growth at every temperature, ADM14 is expected to have highest industrial use availability.

Characterization of pFMBL1, a small cryptic plasmid from Leuconostoc mesenteroides SY2, and its use as a cloning vector

정선주 경상대학교 대학원 2006 국내석사

A 4661 bp cryptic plasmid pFMBL1 was isolated from Leuconostoc mesenteroides SY2 and characterized. The nucleotide sequence analysis revealed two open reading frames, ORF1 and ORF2. The ORF2 was 453 bp in size and showed 58% homology with the putative replication initiation protein of Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides Y110 cryptic plasmid, pTXL1. The pFMBL1 harbors a minimal replicon localized on a 3551bp fragment. A cloning vector for Leuconostoc was developed on the basis of the pFMBL1 minimal replicon, into which were inserted an erythromycin resistance gene as a marker and Escherichia coli ColE1 replication origin. This cloning vector is named pSJ33E. The pSJ33E was not detected single-stranded intermediate and was very stable without antibiotic selection still 2 weeks. Therefore, we expected that the pSJ33E is replicated in theta mechanism. About 565 nucleotides transcribed from ORF2 confirmed as result that northern blot analysis of pSJ33E. Leuconostoc 속은 식품 산업에 공통적으로 사용되는 이상발효 균이다. 김치 공장에서 생산되는 김치의 양이 계속적으로 증가하고 이런 경향은 김치의 질을 일정하게 유지하게 하는 여러 가지 요인들에 대한 연구를 필요로 하게 하였다. 치즈와 요구르트와 같은 많은 다른 발효 식품과 같이 김치의 질은 유산균에 의한 유산 발효에 의해 크게 좌우된다. 이 논문에서는 Leuconostoc의 특성과 유산발효에 관련하는 여러 효소들의 유전자를 연구하기 위한 기본적인 실험으로 유전자 조작의 기본이 되는 vector를 제조하였고, 그 실험 결과는 다음과 같다. 김치로부터 분리한 Leuconostoc mesenteroides SY2의 cryptic plasmid인 pFMBL1을 분리하여 특성을 조사하였다. 염기서열 분석 결과 이 pFMBL1의 전체 DNA 길이는 4661 bp였고, 2개의 open reading frame과 6개의 inverted repeat을 가지고 있었다. ORF1은 768 bp의 크기를 가지며 Bacillus subtilis의 기능을 알 수 없는 단백질과 28% 상동성을 보였고, ORF2는 453 bp의 크기를 가지며 L. mesenteroides subsp. mesenteroides Y110의 cryptic plasmid인 pTXL1의 복제단백질로 추정되는 단백질과 58% 상동성을 보였다. pFMBL1의 최소복제단위는 ORF1, 2를 포함한 3551 bp였고, 이 최소 복제 단위와 pBluescriptⅡ SK(+)를 연결하여 클로닝 벡터의 기본 골격인 pSJ33을 제작하였다. pSJ33에 선택 마커로 erythromycin 저항 유전자를 도입하여 크기가 약 7.7 kb인 pSJ33E를 제작하였고, pSJ33E에서 ampicillin 저항 유전자를 제거하여 크기가 약 6.5 kb인 pSJE를 제작하였다. pSJ33E는 single strand DNA가 검출되지 않아서 rolling circle type의 복제가 아닌 theta type의 복제를 하는 것으로 추정된다. pFMBL1의 ORF2에서 약 580 bp의 전사체가 검출되었고, 항생제가 없는 배지에서 15일 배양 후에도 약 90%이상의 안정성을 보여 항생제의 첨가 없이도 일정기간 동안 L. mesenteroides에서 외래 유전자의 발현을 유도 할 수 있을 것으로 기대된다

GC-MS 법을 이용한 Leuconostoc mesenteroides 내의 아미노산 프로파일 분석 연구

박아름 아주대학교 2012 국내석사

기체크로마토그래피-질량분석법의 선택적인 이온 모드를 이용하여 N-Ethoxycarbonyl/tert-butyldimethylsilyl(EOC/TBDMS) 유도체로써 Leuconostoc mesenteroides 균주에서의 단백질성과 비단백질성 아미노산의 동시 프로파일 분석을 위한 효율적인 방법이 개발 되었다. 본 연구에서는 29 종의 아미노산에 대하여 염기성 수용액 (pH12) 상태에서 아미노기와 티올기를 메틸렌클로라이드층에 들어있는 ethyl chloroformate와 반응시켜 EOC 유도체화 한 다음, 10% 황산으로 pH를 산성으로 조절한 후, diethyl ether와 ethyl acetate를 이용하여 추출하고, 질소 기류 하에서 완전히 건조시켰다. 그리고 남아 있는 활성 수소를 직접 기체크로마토그래프-질량분석기로 분석하기 위해 TBDMS 유도체화 하였다. 최적의 조건에서, 분석법에 대한 타당성 검증결과 0.02-5.0 g/L 범위에서 r=0.999 이상으로 좋은 직선성을 나타냈고, 정밀도 (% RSD)는 14.2 이하였고, 정확도 (% RE)는 -13.9~11.1로 나타났다. 최종적으로 본 아미노산 프로파일링 분석법을 Leuconostoc mesenteroides의 균주와 배지에 적용해 본 결과, 총 19 종의 단백질성 아미노산과 10 종의 비 단백질성 아미노산이 검출 되었다. 그러므로, 본 연구에서 개발된 분석 방법은 다양한 미생물 균주와 배지에서 아미노산의 프로파일 분석에 유용하게 사용될 것으로 사료된다.