Leuconostoc citreum을 利用한 마늘醱酵時 抗酸化活性, 抗菌活性 및 硫黃化合物의 生産特性

김수옥 건국대학교 대학원 2012 국내석사

본 연구는 마늘을 발효시켜 생리활성을 향상시키려는 목적으로 수행되었다. 우선 마늘발효에 관여하는 미생물을 탐색하였고 선발 균주를 이용한 마늘 발효과정 중 균체성장, 항균활성 및 항산화활성의 변화를 측정하였다. 그 결과들을 바탕으로 우수한 균주를 선발하고 마늘발효에 관한 최적조건을 조사하였다. 마늘발효에 관여하는 균을 분리하기 위해서 마늘을 유일한 탄소원과 질소원으로 하는 마늘배지(마늘, 300 g/L;/ CHO buffer : potassium phosphate, 0.1 g/L; magnesium sulfate, 0.01 g/L; sodium acetate, 1 g/L; sodium chloride, 1 g/L)를 사용하여 14개의 균을 선발하였다. 분리된 균은 다시 표본정규분포를 이용한 표준화 방법으로 생균수와 항산화활성이 모두 우수한 Leuconostoc citreum SK2589를 선발하였다. Leuconostoc citreum SK2589를 이용하여 마늘발효에 있어서 최적 조건을 탐색하였다. 조건 검토는 Taguchi design을 사용하였으며, 요인으로는 마늘함량, 배양시간, sucrose 및 glucose를 사용하였다. 그리고 요인에 대한 반응으로는 생균수, 항산화활성, 폴리페놀 및 플라보노이드를 평가하였다. 각 활성에 대해 신호대 잡음비를 이용하여 공통으로 표준화된 수치를 산출하였고, 그 중 마늘함량이3수준(60%)에서 가장 우수한 효과를 나타내었다. 그 외 배양시간은 2수준 (16시간)이 가장 좋았고, sucrose는 3수준(10g/L), glucose는 3수준(10g/L) 이 가장 우수하였다. 다음으로 보다 활성이 높은 균주를 선발하기 위해 앞서 분리한 14개 균을 포함하여 제1절 실험과 동일한 방법으로 83개의 균을 추가로 분리하여 총 97개의 균에 대하여 분석하였다. 그리고 Robust data selection을 이용하여 활성이 가장 우수한 Leuconostoc citreum SK2556을 선발하였다. Leuconostoc citreum SK2556 를 이용한 마늘발효 동안 생균수, 항균활성, 항산화활성, 폴리페놀, 플라보노이드 및 유황화합물의 특성에 대하여 분석하였다. 실험결과 마늘에 균을 접종하지 않은 대조구에 비교하여 Leuconostoc citreum SK2556로 접종하여 마늘을 발효하였을 때 발효20시간에 항산화활성, 폴리페놀, 플라보노이드 및 유황화합물의 생산에서 분석함량이 높게 나타났다. 그리고 발효 최적화를 위해 Leuconostoc citreum SK2556 의 성장과 항산화활성에 대한 배지성분들의 효과를 분석하였다. Molasses, sucrose, glucose, corn steep liquor, yeast extract 및 sodium acetate 를 배지성분 변수로 선택하였고, 변수들의 2가지 수준으로 배치된 9개의 실험수를 요인배치법인 Plackett-Burman 설계법으로 구성하였다. 균체량의 경우 6가지 요인에서 모두 부적효과를 나타냈다. 항산화활성 분석은 당밀요인 만이 정적효과를 나타냈다. 이는 Leuconostoc citreum SK2556 균주를 이용하여 마늘을 발효시킬 때 별도의 특별한 배지성분을 요하지 않았으며, 항산화활성을 향상시키는 데에는 당밀의 첨가가 효과적인 것으로 확인되었다. 또한 첨가되는 당밀의 수준이 20 g/L를 넘으면 균체 성장이 저해되었다. 마늘에 Leuconostoc citreum 을 접종하여 발효하면 기능성 사료첨가제로서 그 효과를 기대할 수 있을 것으로 판단된다. This study was conducted to select bacteria used for garlic fermentation. The culture conditions were determined for cell growth and biological functions such as antibacterial activity, antioxidant activity with measuring the contents of total polyphenol, total flavonoid, and sulfur compounds for the development of feed additive. In order to isolate garlic fermentation bacteria, garlic was used as a sole carbon and nitrogen sources in the medium containing garlic (300 g/L) in CHO buffer (potassium phosphate, 0.1 g/L; magnesium sulfate, 0.01 g/L; sodium acetate, 1 g/L; sodium chloride, 1 g/L). By using this garlic culture medium, fourteen bacteria were isolated. Leuconostoc citreum SK2589 was selected showing high viable cell counts and antioxidant activity. Taguchi Design was used for determining of the optimal fermentation condition in Leuconostoc citreum SK2589. Viable cell counts and antioxidant activity were measured with total contents of phenol and flavonoid. By using signal-to-noise ratio for each activity, common standardized figures were calculated. In the garlic level III (60%), the best effect was observed. Incubation time was the best at level II (16 hours) and both sucrose and glucose were the best at level IIIs (10 g/L). For the isolation of bacteria having more high biological activities, 97 bacteria were further tested by the same method as described above. Among the strains, Leuconostoc citreum SK2556 was selected from Robust data selection. In the experiment about garlic fermentation using Leuconostoc citreum SK2556, the antioxidnt activity, total contents of polyphenol and flavonoids and sulfur compounds were increased compared to the control (non inoculated garlic) at 20 hr incubation. For the optimization of fermentation, the effect of medium ingredients was evaluated on cell growth of Leuconostoc citreum SK2556 and antioxidant activity of fermented garlic. Molasses, sucrose, glucose, corn steep liquor, yeast extract and sodium acetate were selected as factors of medium ingredients. Nine runs of experiment with two level concentrations of six experiments were configured by Plackett Burman design. In cell growth, all six factors showed negative effects. Molasses showed a positive effect in the analysis of antioxidant activity. During the garlic fermentation by using Leuconostoc citreum SK2556, a special nutritional ingredient was not required. The addition level of molasses should be below 20 g / L because of the inhibition of cell growth. As a results, garlic fermented using Leuconostoc citreum will be used as functional feed additive.

Development of Food-grade Vector for Constitutive and Inducible Gene Expression in Leuconostoc citreum

조승기 충북대학교 2015 국내박사

Leuconostoc속은 야채발효식품, 우유, 유제품, 그리고 와인에서 젖산, 알코올, 이산화탄소와 향기성분을 생성하는 이형젖산 발효를 하는 유산균으로서 효소나 백신 생산과 같은 운반 숙주세포로서의 생물공학적인 이용 가능성이 크게 기대되고 있다. 그러나 효율적인 유전적 도구 및 기술의 부족으로 대사공학을 이용한 분자생물학 및 유전학적 기초 연구 및 산업적 이용을 위한 균주의 개발이 많이 이루어지지 않고 있는 실정이다. 따라서 본 연구에서는 Leuconostoc의 식품 및 생물공학적 이용을 위한 항시 발현, 유도 발현, 식품용 벡터, 효율적인 분비 시스템을 구축하고자 하였다. 재조합 Leuconostoc균을 단백질, 효소와 같은 다양한 물질들을 생산할 수 있는 세포공장으로서 새롭게 이용하기 위해서는 우선 유산균의 안전한 사용을 위한 항시 발현 프로모터와 식품용 선발표지를 이용한 식품용 벡터가 필요하다. Leuconostoc속은 MRS에서 배양시켰을 때 Glucose와 Sucrose를 주 탄소원으로 이용하여 생육한다. 따라서 Leuconostoc속이 2개의 탄소원에서 생육에 미치는 항시발현유전자를 알아보았고, 두번째로 Leuconostoc속에 항시발현유전자의 프로모터 염기서열을 β-galactosidase (β-gal)유전자를 가지고 있는 벡터에 클로닝하여 단백질 발현양을 비교하여 항시발현벡터를 개발하고 이렇게 선발된 프로모터를 이용하여 식품용 선발표지에 미치는 영향을 알아보았다. Leuconostoc속은 Glucose와 Sucrose-MRS에서 Leum_710, 209, 1694, 866, 1326, 그리고 1506 유전자가 항시발현됨을 확인하였고, β-gal의 발현양을 높이기 위해서 항시발현 유전자의 프로모터들을 붙여 pEK32 벡터에 클로닝 후 Leuconostoc (L.) mesenteroides subsp. mesenteroides ATCC8293와 L. citreum CBNU2657균주에 도입하여 발현시킨 결과, 두 균주 모두에서 프로모터 710의 발현율이 1.37, 4.38units/mg으로 다른 프로모터서열보다 현저하게 증가하였음을 확인하였다. 이 프로모터를 이용하여 Lactobacillus plantarum 유래의 bile salt hydrolase (bsh)을 이용한 dominant 선발표지를 Leuconostoc속에 도입하여 bsh유전자를 발현시켰을 때, 재조합유산균은 0.3% bile salt (glycodeoxycholic acid sodium, GDCA) 에서 생육이 되지만 wild-type L. citreum은 0.3% GDCA에서 생장이 저해되어 재조합 유산균을 선발할 수 있다. 또한 NICE system으로 알려진 pNZ8008에서부터 repA와 repC 유전자를 pEK32벡터에 도입하여 Leuconostoc-Lactococcus 셔틀벡터인 pEK32rep을 구축 할 수 있었고, L. citreum CBNU2567속에 도입하였을 때 플라스미드 복제 수가 pEK32보다 두배 향상됨을 확인 하였다. 유산균에서 동형-이형 유전자를 발현하기 위한 발현벡터에는 복제될 유전자의 전사를 조절하기 위해서 적절한 프로모터가 존재한다. 만일 발현 벡터의 프로모터 strength가 강하고 유전자 발현이 매우 높으면, 생성된 단백질은 세포질 (cytoplasm)안에 축적되고 생물학적 활성이 없는 inclusion bodies를 생성하게 된다. 또한 몇몇의 단백질의 경우 고농도로 생성이 되면 오히려 세포에 독성을 나타낸다. 그로 인해 발현수준을 적절히 조절할 수 있는 유도 프로모터가 필요하다. Leuconostoc속에서 발현수준을 적절히 조절할 수 있는 유도 프로모터를 선발하기위해 transcriptomic과 secretomic분석으로 sucrose PTS (Leum_0288)와 levansucrase (Leum_1409, Leum 1411)유전자가 sucrose에 의해 조절되는 것을 알 수 있었다. 이들 3개의 유전자의 프로모터 염기서열을 이용하여 유도발현벡터를 제작하였고, L. citreum CBNU2567에 도입하여 발현시킨 결과 sucrose가 첨가된 MRS배지에 성공적으로 유도발현되는 것을 효소활성으로 확인하였다. 본 연구를 통하여 Leuconostoc속에서의 효율적인 항시발현 기법, 유도발현 기법, 식품용 선발표지기법 및 높은 자가복제 기법을 확립하였고 향상된 유전적 기법을 이용하여 산업적으로 이용가치가 높은 Leuconostoc속의 유전학적 연구와 대사공학 발전 및 산업적, 생물공학적 이용에 기여할 것으로 기대된다. Leuconostoc is a hetero-fermentative LAB that produces lactic acid, alcohol, CO2, and aromatic compounds, and plays an important role in maintaining the quality of fermenting vegetables, milk, dairy products, wines, and meats, and also has great potential in biotechnological applications such as enzyme and vaccine delivery systems. However, studies of metabolic engineering of Leuconostoc are still lacking because of insufficient development of useful molecular tools and techniques. This study was focused on development of systems for constitutive or inducible expression, food-grade and efficient secretion of Leuconostoc to improve its food and biotechnological application. For construction of food-grade vectors for Leuconostoc spp., constitutive promoters and food-grade selection marker are necessary. Transcriptomic analysis of L. mesenteroides ATCC 8293 revealed that genes of Leum_209, 710, 866, 1326, 1506, and 1694 were expressed most strongly and constitutively in both glucose- and sucrose-MRS media. For constitutive over-expression of β-galactosidase gene in L. mesenteroides and L. citreum, the 6 promoter sequences were fused to the promoterless β-gal gene from Lactobacillus plantarum to construct an E. coli-Leuconostoc shuttle vectors, pEK32progals, by using pLeuCM42. When 6 vectors were transformed into Leuconostoc spp. and the transformants were cultivated in glucose-MRS medium, total β-gal activities of L. mesenteroides in culture medium and cytoplasm were 1.37, 0.86, 0.81, 0.37, 0.90, and 0.04 units/mg for Leum_710, 209, 1694, 866, 1326, and 1506 promoter sequences, respectively, and in case of L. citreum the activities were 4.37, 2.21, and 1.47 units/mg for Leum_710, 1694, and 209 promoter sequences, respectively. To construct food-grade vector for Leuconostoc sp., a bsh gene from Lb. plantarum was cloned and expressed in the BSH-deficient host strain, L. citreum CBNU2567. As result, L. citreum harboring pEK32P710BSH could sustain its growth on the agar plate containing 0.3% bile salt and the resistance can be used as food-grade selection marker of transformant. In addition, when Leuconostoc-Lactococcus shuttle vector, pEK32rep, was constructed by subcloning of repA and repC genes from pNZ8008 into the pEK32 vector and transformed into L. citreum CBNU2567, the plasmid copy number of pEK32rep increased up to 2 folds compared to pEK32. This result implicates that incorporating dual origins in a vector may increase the copy numbers of plasmids in L. citreum. The dual-origin vector constructed in this study can be used in the future experiment with increased copy numbers in L. citreum after proving the replication mechanism as well as optimizing the plasmid size. Also, Transcriptomic and secretomic analyses of L. mesenteroides identified sucrose PTS (Leum_0288) gene and levansucrase (Leum_1409, Leum 1411) that were up-regulated by addition of sucrose in the MRS medium. Therefore, for inducible expression of β-galactosidase gene in L. mesenteroides and L. citreum, the 3 promoter sequences were fused to the promoterless β-gal gene from Lb. plantarum and shuttle vectors, pEK32progals, were constructed by using pLeuCM42 as E. coli-Leuconostoc shuttle vector. When 3 vectors were transformed into L. mesenteroides and L. citreum, and the transformants were cultivated in glucose- and sucrose-MRS medium, the total β-galactosidase activities of L. mesenteroides were 0.76 units/mg for Leum_1411 promoter, in L. citreum they were 1.39 and 1.33 units/mg for Leum_1409 and 1411 promoter, respectively. In L. citreum, the β-galactosidase activity was induced 3.3-fold by pEK32P1409gal and 2.7-fold by pEK32P1411gal, respectively. The pEK32P1411Amy vector showed high secretion activities in L. citreum, and its activities were 0.24 and 0.46 units/ml at 15 and 18h cultivation in sucrose medium, respectively. Overall, in this study, constitutive and inducible expression systems harboring food-grade selection marker, dual replication origin, and secretion gene were constructed as a platform tool for the functional genomic study and metabolic engineering of Leuconostoc spp.

Cas9-sgRNA 리보핵산단백질복합체를 이용한 류코노스톡 시트륨 유전체 편집기술 개발

김슬아 충북대학교 2022 국내박사

Lactic acid bacteria (LAB) have been used as starters or probiotics for foods fermentation and cell factories for bioresource production. Leuconostoc citreum is a gram positive, facultative anaerobic, and hetero-fermentative LAB frequently found in fermented vegetables, and has been used as a starter culture in kimchi fermentation. To improve their probiotic properties, removal of undesired characteristics and addition of new desirable properties by efficient genome engineering tool is necessary for probiotics or industrial use. Recently, the CRISPR-Cas9 system which is bacterial defense mechanism against virus infection has been widely used as a powerful genome editing tools in various cell types such as animal, plant, fungi, and yeast. Delivery of Cas9 by ribonucleoprotein complexes (RNP), in which recombinant Cas9 protein preassembled with sgRNA, are preferable methods due to easy production, low off-target effect, and no requirement of vector system. Although RNP system have been used for various eukaryotes cells, no studies have been applied to LAB due to limitations such as complex cell wall structure, intracellular nucleases, and lack of recombinase. Therefore, the aim of this study is development of efficient genome editing system in L. citreum using Cas9-sgRNA ribonucleoprotein complexes. To achieve the goal, RNP concentration and electroporation conditions were optimized for introducing RNP into L. citreum, and thiolated DNA and RecT recombinase originated from Lactobacillus plantarum WCFS1 were employed to increase the repair efficiency. In addition, to support above experiments, complete genome sequences of L. citreum EFEL2700 was analyzed and species/strain-specific monitoring technique using real-time qPCR was established. In chapter 2, the complete genome sequence of L. citreum EFEL2700 was analyzed by Illumina and Pacbio sequencing. As results, this strain has 1 chromosome and 4 plasmids (total 1,923,830 bp) with a G + C content of 39.0% and high homology (≥ 99%) in ANI value to the reference strain L. citreum KM 20. The KEGG analysis of metabolic pathways showed a typical hetero-type lactic acid fermentation with biosynthetic route for coenzyme A, and terpenoid backbone including isoflavonoid and riboflavin. No core genes for primary metabolism were present in plasmid 4 and it could be eliminated to create an efficient host for gene transformation. In chapter 3, species/strain-specific quantitative PCR for Leuconostoc spp. were developed and they were applied for identification and enumeration of starter culture in fermented food. As results, primers, NlacF and NlacR, for detecting L. lactis strains were developed based on pan-genome analysis. PCR analysis against genomic DNA of various LAB exhibited the primer set made a specific binding with genomic DNA of L. lactis species. The qPCR with these primers was proved to enumerate accurate population of L. lactis during kimchi fermentation. In addition, three primer sets for detecting L. mesenteroides DRC1506 were developed based on pan-genome analysis. PCR analysis against genomic DNA of various LAB exhibited the primer set made a specific binding with genomic DNA of L. mesenteroides DRC1506 strains. The qPCR method was proved to count the L. mesenteroides DRC1506 during kimchi fermentation. In chapter 4, genome editing of L. citreum via Cas9-sgRNA ribonucleoprotein complexes with RecT was conducted. For this, dextransucrase gene was selected as a target DNA and pre-assembled RNP complexes with RecT were introduced to L. citreum by electroporation. As result, dextran-free colonies were successfully obtained on sucrose agar medium, and it was found that single nucleotide deletion occurred resulting in gene knock-out by a frame shift. To increase the mutation efficiency, thiolated donor DNA and RecT recombinase were employed and the efficiency was increased up to 3.9%. In chapter 5, characteristics of L. citreum Δdsr mutant obtained in the above chapter were analyzed and its fermentation profile was investigated during dongchimi fermentation. As result, the cell growth rate and pH change of the mutant were not significantly different (p < 0·05) compared to the wild type during fermentation. When the mutant strain was inoculated as a starter in dongchimi, the mutant slowly metabolized sucrose resulting in significant reduction (6.5-folds) of dextran production compared to the wild type during fermentation. NMR analysis revealed that the polymer produced by the mutant was alternan having α-(1→3) (39.5%) or α-(1→6)-linkage (60.5%) possibly synthesized by alternansucrase. Meanwhile, viable cell counts and pH change were not significantly different (p < 0·05) compared to the wild type. In conclusion, for the first time in LAB, dextransucrase gene in L. citreum EFEL2700 was deleted by electroporation of Cas9-sgRNA ribonucleoprotein complexes and the knock-out efficiency was increased up to 3.9% by employing both thiolated donor DNA and RecT recombinase. As a universal genome engineering tool customized for LAB, this RNP complex method can be applicable to other LAB such as Bifidobacterium, Lactobacillus, and Lactococcus beyond the genus barrier. In addition, the DNA-free tools used in this study can be regarded as non-LMO technology, when no exogenous DNA were used.

양파 발효를 위한 균주의 동정 및 배양 최적화에 관한 연구

장우경 건국대학교 일반대학원 2010 국내석사

양파발효에 관여하는 세균을 분리하기 위하여 양파즙에 LB, MRS, PD 그리고 YM 배지를 각각 첨가하였다. 접종액으로 토양을 사용하였으며 토양을 첨가한 처리구와 첨가하지 않은 처리구로 나누어서 발효를 진행하였다. 배양 후에 발효된 양파는 첨가된 배지의 종류에 따라서 동일한 평판배지에 도말하였고, 세균을 분리하였다. 분리된 세균들에 대하여 전분분해효소, 단백질분해효소, 섬유소 분해효소 그리고 지방분해효소의 활성을 측정하였다. 또한 항균활성, 항산화활성 그리고 항생제 내성 등을 분석하였다. 토양을 첨가한 처리구에서는 10개의 세균이 분리되었고, 토양을 첨가하지 않은 처리구에서는 52개의 세균을 분리하였다. 토양을 첨가한 처리구에서 분리된 세균들 중에서 5종, 토양을 첨가하지 않은 처리구에서 10종의 세균을 선별하였으며, 항산화활성과 항균활성을 평가하였다. 우수한 세균을 선발하기 위하여 선발된 세균들의 활성결과를 통하여 상대적 활성지수를 산출하였고 7종의 세균을 선발하였다. 선발된 세균들의 항산화활성, 항균활성 그리고 성장성을 평가하였고 최종적으로 SK1990을 선발하였다. 추가로 SK1984 균주를 선발하였는데, 이 세균은 상대적 활성지수는 낮았으나 16S ribosomal RNA 유전자 염기서열과 BLAST를 이용한 NCBI genebank의 유사성 검색결과 Leuconostoc sp.로 나타났으며, 이 균주는 김치와 같은 식물발효에 있어 중요한 균으로 알려져 있어 선발하게 되었다. 보다 정확한 동정을 위하여 SK1984와 SK1990의 16S ribosomal RNA 유전자를 이용하여 분류학적 거리분석을 수행하였으며 그 결과 SK1984는 Leuconostoc citreum으로 SK1990은 Lactobacillus plantarum으로 동정되었다. Leuconostoc citreum SK1984의 성장과 항산화활성에 대한 배지성분들의 효과를 분석하였다. Sucrose, glucose, maltose, yeast extract, sodium acetate 그리고 양파즙을 배지성분 변수로 선택하였고, 변수들의 2가지 수준으로 배치된 12개의 실험수를 Plackett Burman 설계법으로 구성하였다. 각각의 실험들은 30→에서 20시간동안 배양한 후에 생균수를 측정하였으며 배양상등액의 항산화활성은 DPPH법을 이용하여 평가하였다. 성장에 대한 주효과로서 긍정적인 효과를 나타낸 것은 sucrose와 sodium acetate로 나타났고 당밀은 항산화활성에 대한 주 효과 변수로 나타났다. 비록 통계적 유의성은 없었으나 양파 또한 성장과 항산화활성에 있어 긍정적인 효과를 나타내었다. 흥미롭게도 sucrose와 sodium acetate의 경우에는 성장에 대한 긍정정인 효과와는 반대로 항산화활성에 대하여서는 유의적으로 부정적인 효과를 나타내었다. 그러한 성장과 항산화활성간의 상관관계는 발견되지 않았다(P=0.335). Lactobacillus plantarum SK1990의 양파발효를 최적화하기 위하여 가능한 양파즙 첨가량을 결정하였다. 양파즙의 첨가수주는 20%에서 60%로 증가하였으며 기초배지로는 5배 희석된 MRS 배지를 사용하였고 Lactobacillus plantarum SK1990의 성장을 조사하였다. 60%까지 양파즙의 첨가량을 증가시켜도 성장에 대한 저해효과는 나타나지 않았으며 양파즙의 첨가량이 증가함에 따라서 균체 생성율도 증가하였다. 탄소원과 질소원 그리고 양파즙들이 성장과 항산화효과에 미치는 효과를 알아보기 위하여 양파즙의 농도를 2 수준(40%, 60%), 질소원으로 yeast extract도 2수준(1, 5 g/L) 그리고 탄소원으로 sucrose는 3수준(5, 15, 30 g/L)으로 하여 완전요인배치법으로 실험을 설계하였다. 양파즙과 yeast extract의 첨가량이 증가함에 따라서 항산화활성과 세포성장은 증가하였으나 두 성분간의 상관관계를 나타나지 않았다. 반면에 sucrose의 경우에는 15 g/L 수준이 넘어가면서부터 성장과 항산화활성이 감소하였다. 이러한 결과를 이용하여 양파즙은 60%, yeast extract는 5 g/L 그리고 sucrose는 15 g/L로 하는 최적배지를 선발하였고 5 L jar fermentor를 이용하여 발효시킨 결과 배양 12시간만에 1.0˚109 cfu/㎖의 성장을 나타내었으며 60%의 항산화활성이 배양 전반에 걸쳐 유지되었다. To isolate the bacteria useful for the fermentation of onion juice LB, MRS, PD and YM broth were added into onion juice, individually. As an inoculant, soil was also added to onion juice to find useful strain and natural incubation was occurred without any inoculation. After incubation, onion cultures were spread on the same selected agar medium to isolate bacteria. Amylase, protease, cellulose and lipase activities were estimated for the isolates. Antibacterial activity, antioxidant activity and antibiotics resistance spectrum were also analyzed. In soil inoculation treatment, 10 strains were isolated and from the natural incubation without inculation 52 strains were isolated. Finally 5 strains from soil inoculation and 10 strains from the natural incubation were selected after estimation and the antioxidant and antibacterial activities. With the results of activities of isolates, relative activity index was evaluated to select superior strain and 7 strains were selected. Antioxidant, antibacterial activities and growth performance of selected 7 strains were analyzed and SK1990 was finally selected. In addition, SK1984 was also selected though it showed low score in relative activity index because it was identified as Leuconostoc sp. from the analysis of 16S ribosomal RNA gene sequence and BLAST search in NCBI genebank. Leuconostoc sp. have been regarded as major strain involved in the fermentation of vegetable such as Kim-Chi. For more accurate identification, the evolutional distance of SK1984 and SK1990 were analyzed and as a result, SK1984 and SK1990 were identified as Leuconostoc citreum and Lactobacillus plantarum, respectively. The effect of medium ingredients on the growth and antioxidant activity of Leuconostoc citreum SK1984 was evaluated. Sucrose, glucose, maltose, yeast extract, sodium acetate and onion juice were selected as factors of medium ingredients and twelve runs of experiment with two levels concentrations of six ingredients were configured by Plackett Burman design. Viable cell counts of each runs were tested after 20 hrs incubation at 30→ for analysis of the effects on cell yields and free radical scavenging activities of the supernatant of each runs were estimated by DPPH decolorization method. For the effective ingredients on cell yields, sucrose and sodium acetate were found and molasses was on antioxidant activity. Although there were no significances, onion juice also showed positive effect on both of cell yields and antioxidant activity. Interestingly, in contrast to their effects on growth, sucrose and sodium acetate represented significantly negative effects on antioxidant activity. However, no significant correlation was found between growth and antioxidant activity (P=0.335). To optimize the condition for onion fermentation with Lactobacillus plantarum SK1990, available addition levels of onion juice were estimated. Addition level of onion juice was increased from 20% to 60% in MRS medium which was 5 fold diluted and the growth of Lactobacillus plantarum SK1990 was tested. Until 60%, the inhibition of growth was not found and increased cell yields were found according to the increment of onion juice. To evaluate the effect of carbon, nitrogen and onion juice levels on the growth and antioxidant activity, 2 levels of onion juice (40%, 60%), 2 levels of yeast extract as nitrogen source (1, 5 g/L) and 3 levels of sucrose as carbon source (5, 15, 30 g/L) were assigned to full factorial design. As the levels of onion juice and yeast extract were increased, the antioxidant activity and cell yields were increased without any interaction between both medium ingredients. However, in sucrose, the rate of increment was declined above 15 g/L level. With these results, 60% of onion juice, 5 g/L of yeast extract and 15 g/L of sucrose were selected as optimal media composition and it was verified by 5 L jar fermentation. 1.0˚109 cfu/㎖ of cell yields was obtained within 12 hours of fermentation and 60% of antioxidant activity was maintained during overall period of fermentation.

Characterization of the fermentation starter and probiotic candidate strain Leuconostoc citreum DMLC16

이수민 동덕여자대학교 일반대학원 2025 국내석사

To select novel starter culture candidates, antibiotic susceptibility, hemolytic activity, and technological properties related to fermentation of 46 Leuconostoc citreum isolates from kimchi were evaluated. All strains were susceptible to clindamycin and erythromycin, while varying levels of resistance were observed to ampicillin, chloramphenicol, gentamicin, streptomycin, and tetracycline. Notably, all strains exhibited resistant to kanamycin, as assessed using the European Food Safety Authority breakpoint values for Leuconostoc species. However, PCR analysis did not detect any resistance genes associated with these six antibiotics in any strain. None of the strains demonstrated clear α- or β-hemolytic activity. All strains showed growth on media supplemented with 6% NaCl and exhibited protease and acid-producing activity on the presence 6% and 3% NaCl, respectively. Based on these criteria, five strains—AK5T17, AK5T19, AK10M04, DMLC16, and YK10T20—were selected as starter candidates. Among themm, L. citreum DMLC16 was identified as the most promising strain due to its superior protease and acid production. Furthermore, DMLC16 exhibited enhanced acid tolerance, bile salt resistance, and intestinal adhesion ability compared to type strain KACC 11860T. It also exhibited broad-spectrum antibacterial activity against foodborne pathogens and spoilage organisms, including Bacillus cereus, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Alcaligenes xylosoxidans, Flavobacterium sp., and Salmonella enterica. In addition, antifungal activity was observed against Clonostachys rosea, Epicoccum nigrum, and Penicillium citrinum. Whole-genome analysis of DMLC16 confirmed its safety by revealing the absence of toxin genes and acquired antibiotic resistance genes. The genome also contained genes associated with enzymatic activity, salt tolerance, and survival under harsh conditions such as gastric acidity. Although specific bacteriocin genes could not be identified, genes involved in the production of antimicrobial substances were present. Collectively, these findings support the safe and effective use of L. citreum strain DMLC16 as a starter candidate in fermented food production. Moreover, its complete genome sequence provides valuable insights into the genetic basis of probiotic potential and facilitates future evaluations of its functionality in food industry applications. 김치에서 분리한 46개의 Leuconostoc citreum 균주를 대상으로 새로운 종균 후보를 선정하기 위해 항생제 감수성, 용혈 활성, 발효와 관련된 기술적 특성을 평가하였다. 모든 균주는 클린다마이신과 에리트로마이신에 감수성을 보였으며, 암피실린, 클로람페니콜, 겐타마이신, 스트렙토마이신, 테트라사이클린에 대해서는 균주별로 다양한 수준의 내성이 관찰되었다. 특히, 모든 균주는 Leuconostoc 종에 대한 유럽식품안전청의 기준값에 따랐을 때 가나마이신에 내성을 나타냈다. 그러나 이들 6종의 항생제 관련 내성 유전자는 어떤 균주에서도 PCR 분석을 통해 검출되지 않았다. 또한, 어느 균주에서도 명확한 α- 또는 β-용혈 활성이 관찰되지 않았다. 모든 균주는 6% NaCl이 포함된 배지에서 생장이 가능하였고, 6% 및 3% NaCl 환경에서 각각 단백질분해효소 활성과 산 생성 능력을 보였다. 이러한 기준을 바탕으로 AK5T17, AK5T19, AK10M04, DMLC16, YK10T20의 5개 균주가 종균 후보로 선정되었으며, 이 중 DMLC16은 우수한 단백질분해 효소 및 산 생성 능력으로 가장 유망한 균주로 평가되었다. 더불어 DMLC16은 표준 균주인 KACC 11860ᵀ와 비교해 내산성, 내담즙성, 장내 부착 능력이 뛰어났으며, Bacillus cereus, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Alcaligenes xylosoxidans, Flavobacterium sp., Salmonella enterica를 포함한 식중독균 및 부패균에 대해 광범위한 항균 활성을 나타냈다. 또한 Clonostachys rosea, Epicoccum nigrum, Penicillium citrinum에 대한 항진균 활성도 확인되었다. DMLC16의 유전체 분석 결과, 독소 유전자와 획득된 항생제 내성 유전자가 존재하지 않아 안전성이 확인되었으며, 효소 활성, 염내성, 위산 같은 극한 환경에서의 생존에 관여하는 유전자들도 확인되었다. 비록 특정 박테리오신 유전자는 확인되지 않았으나, 항균 물질 생산에 관련된 유전자들이 존재하였다. 이러한 결과는 Leuconostoc citreum DMLC16 균주가 발효식품 생산에 있어 안전하고 효과적인 종균으로 활용될 수 있음을 뒷받침하며, 해당 균주의 유전체 정보는 프로바이오틱 특성의 유전적 기반을 이해하고 식품 산업에서의 기능성 평가를 가능하게 하는 유용한 자료가 될 것이다.

Leuconostoc citreum GR1의 발효조건 최적 및 안정화에 관한 연구

문신혜 목포대학교 대학원 2013 국내석사

종균용 김치를 제조를 하기 위해서는 종균이 대량배양 되어야 한다. 대량배양을 하기 위해서는 최적 배지조성의 개발이 중요하다. 유산균의 새로운 배지를 개발하기 위한 기본적인 요소는 배추추출액, 탄소원, 질소원, 미네랄 성분이다. 최적배지 조성은 배추추출액 잎 30%, maltose 2%, yeast extract 0.25%, 2X salt stock(sodium acetate 2%, disodium phosphate 0.8%, sodium citrate 0.8%, ammonium sulfate 0.8%)으로 나타났다. 새롭게 개발된 배지의 이름은 MFL로 명명하였다. Leuconostoc citreum GR1을 30℃에서 24시간 배양하면 MRS 배지에서는 3.41×109 CFU/mL MFL 배지에서는 7.49×109 CFU/mL의 생균수를 보였다. MFL 배지에서 배양하면 MRS배지에서 배양했을 때 보다 2.14배 더 높은 성장을 보였다. 또한 최적화 배지의 Scale-up을 위해 5 L 발효조를 이용하여 2 L의 조업부피로 Leuconostoc citreum GR1을 배양하였다. 교반속도는 50 RPM에서 높은 생균수 8.60×109 CFU/mL를 나타내었다. 배지의 pH 조절은 pH-stat mode로 작동되었다. 균체 성장의 가장 최적의 pH는 NaOH 용액을 이용한 6.8로 결정하였다. 이러한 조건으로 20시간 배양 후 1.14×109 CFU/mL의 cell 성장을 하였다. Inducer는 Leuconostoc citreum GR1의 항균 활동의 활성을 위해 첨가되었다. Inducer는 10,000~11,000 psi에서 microfluidizer를 이용하여 35회 파쇄 된 Lactobacillus planatrum 464의 whole cell을 이용하였다. Bacillus subtilis에 대하여 유도된 Leuconostoc citreum GR1의 항균 활성은 유도되지 않은 Leuconostoc citreum GR1의 항균 활성 보다 16.7배 더 높았다. 또한 cell 성장도 0.1%로 inducer를 첨가하였을 때 1.1배 더 증가하였다. Cell은 농축시켰고 균체의 안정을 위해 안정제를 첨가하였다. 안정제로 MFL배지를 선택하였고 0℃, 4 ℃에서 저장하였다. 이러한 조건으로 cell은 4주 동안 약 90%의 생존율을 유지할 수 있었다. In order to settle starter kimchi manufacturing process, starter should be cultured in large-scale. For the large-scale cultivation, it is important to develop optimal medium compositions. The base materials for a newly developed medium of lactic acid bacteria is composed of Chinese cabbage extracts, carbon, nitrogen and minerals. The Optimal composition of medium was 30% leaf(Chinese cabbage extracts), 2% maltose, 0.25% yeast extract and 2X salt stock(2% sodium acetate, 0.8% disodium phosphate, 0.8% sodium citrate, 0.8% ammonium sulfate). The newly developed medium was named MFL(Medium for lactic acid bacteria). After culture for 24hr at 30℃, CFU/ml of Leuconostoc citreum GR1 in MRS and MFL was 3.41×109 and 7.49×109, respectively. CFU/ml of MFL medium exhibited 2.14 times higher than that of MRS medium. For scale-up of optimized medium, cell growth of Leuconostoc citreum GR1 was tested in 2 L working volume using 5 L jar fermentor at 30℃. At 50 RPM of stirring velocity, viable cell counts was 8.60×109 CFU/mL. The medium’s pH was controlled in pH-stat mode. The most proper pH in cell growth control was determined to 6.8 using NaOH solution. Under those conditions, Cell was grown up to 1.14×109 CFU/ml after 20hr of cultivation. Inducer was added for activation of antimicrobial activity of Leuconostoc citreum GR1. Inducer was whole cell of Lactobacillus planatrum 464 which was disrupted by 35 cycles of microfluidizer at 10,000~11,000 psi. Anti-bacterial activity of induced Leuconostoc citreum GR1 against Bacillus subtilis was 16.7 times higher than that of non-induced Leuconostoc citreum GR1. Also cell growth was increased 1.1 times in the presence of 0.1% of inducer solution. Cell was concentrated. And it was added stabilizer for stability of the biomass. MFL medium was added as a stabilizer. and those were stored at 0 ℃, 4 ℃. Under those conditions, cell could survive in the ratio of about 90% for 4 weeks.

류코노스톡 속의 당전이효소 활성 비교 및 통계적 방법을 이용한 류코노스톡 시트리윰의 배양조건 최적화 : Comparison of Glycosyltransferase Activities of Leuconostoc spp. and Statistical Optimization of Fermentation Parameters of Leuconostoc citreum

이민성 충북대학교 2008 국내석사

Leuconostoc spp. are the major lactic acid bacteria in various fermented foods and they are added as a starter in the commercial kimchi product in Korea. The dextransucrase and levansucrase elaborated from this bacterium are used to synthesize dextran, levan and prebiotic oligosaccharides. Most of Leuconostoc spp. are known to produce dextransucrase and levansucrase together. The objectives of this study were to select dextransucrase overproducing leuconostoc strain by monitoring both enzyme synthesis levels using synchronized assaying method, and to find an optimum conditions for its maximum biomass, maximum dextransucrase and minimum organic acid synthesis by using central composite design of fermentation conditions and response surface methodology (RSM) of experimental results. When five species of Leuconostoc were cultured in sucrose medium, both dextransucrase and levansucrase were produced. The DNS method which was often used for glycosyltransferase assay, was not proper for measurement of each enzyme activity in culture medium. Instead of it, HPLC analysis was proven to be a better method for this purpose. Out of 5 species, Ln. mesenteroides subsp. mesenterides and Ln. citreum HJ-P4 were determined as major dextransucrase producers showing the maximum dextransucrase activities with 3.7 units/mL and 3.0 units/mL, respectively. The other strains produced both enzymes but with insignificant levels. Response surface methodology(RSM), which includes factorial designs and regression analysis, can better deal with multifactor experiments. For over-production of biomass and dextransucrase by using Ln. citreum HJ-P4 (KACC91035), the effects of environmental conditions were elucidated and optimal condition was obtained against sucrose concentration, pH, and dissolved oxygen (DO) concentration by means of RSM. Dry cell weight (DCW) increased linearly with increase in the concentration of sucrose, pH and DO. Medium level of sucrose, low level of pH, and high level of DO resulted in higher dextransucrase yields. Polynomial equations were calculated by RSM program for cell mass, dextransucrase activity and total acids production. Using RSM we have obtained maximizing DCW production of 6.93g/L and dextransucrase production of 4.90units/mL. Leuconostoc spp.는 김치발효 초기에 관여하는 주요 발효균의 하나로서 앞으로 전통적인 식품산업이나 생물공학분야에서 폭넓은 이용이 기대되는 균주이다. Leuconostoc spp.는 기질로 sucrose를 사용 시 glucansucrase의 일종인 dextransucrase를 생산하게 되는데 이는 기능성 식품에서 사용되고 있는 이소말토올리고당을 생산하는데 이용되고 있다. 따라서 Leuconostoc spp.중 cell mass와 dextransucrase를 많이 생산하는 균주를 선별하고, 통계적인 방법인 response surface methodology를 적용하여 sucrose, pH 및 용존산소의 영향을 조사하는 발효조건 최적화 작업을 수행 하였다. 본 연구에서 효소활성 측정방법으로 환원당 정량 방법인 DNS방법을 이용하고자 하였으나 Leuconostoc 에서는 dextransucrase뿐만 아니라 levansucrase도 생산되는 것을 알게 되어 enzyme activity측정을 다시 확립하고자 하였다. 측정 방법은 HPLC로 측정하여 fructose, glucose 피크를 각각 측정하여 enzyme activity를 측정한 결과 Ln. citreum HJ-P4에서 dextransucrase 3.02units/mL, levansucrase 1.20units/mL로 높은 생산성과 안정성을 가지고 있는 결과를 보였다. 동 균주를 가지고 반응표면분석법을 통해 고농도 균체량 생산 및 dextransucrase 생산의 배양조건을 최적화하였다. 반응표면 분석법 설계를 이용하여 균체량 생산에 관한 3개의 중요 인자의 최적 조건을 조사한 결과, sucrose 4.99%, pH 6.39 및 용존산소 농도 57.25%로 나타났다. 예측결과 7.42g/L로서 실험결과 6.93g/L와 매우 유사하였다. Dextransucrase 활성의 최적 조건은 sucrose 4.33g/L, pH 5.0 및 용존산소 농도 50.00%로 나타났다. 예측결과 5.50unit/mL이 나왔지만 실험결과 (3.25units/mL)와 차이가 있었고 나와 이는 효소의 안정성에 문제가 있다고 판단하여 배지내에 tween 80을 0.5% 첨가하였더니 약 5.0units/mL으로 매우 유사한 결과를 나타낼 수 있었다. Levansucrase 활성의 최적조건은 sucrose 7.0, pH 6.72 및 용존산소 농도 27.5%이었다. 예측되는 값은 2.37units/mL로 dextransucrase 조건과는 상반되는 결과를 보이고 있다. 이는 한 효소만을 얻고자 할 때 매우 유용한 결과임에 틀림없다. Ln. citreum HJ-P4의 균체량을 얻는데 저해하는 유기산의 최소조건을 예측해본 결과 sucrose 1.0%, pH 7.0 및 용존산소 농도 0%일때 0.17mM로 매우 낮은 유기산을 생성하는 것을 알 수 있었고 이는 고농도 균체배양 조건으로 이용 될 수 있다. 본 연구는 Leuconostoc spp. 에서 발현되는 효소활성 측정 방법 확립 및 선별된 Ln. citreum HJ-P4를 반응표면 분석법을 이용하여 최적의 배양조건을 확립한 결과이다. Leuconostoc spp. 의 고농도 균체량 및 효소를 얻는데 매우 유용하게 이용될 것이다.

The Role of Proline-Containing Cyclic Dipeptides in the Culture Filtrate of Leuconostoc citreum LabMP-A03

성혜리 을지대학교 대학원 2025 국내석사

Construction of engineered leuconostoc citreum strain for degradation of uric acid

이예림 가톨릭대학교 대학원 2023 국내석사

체내 과도한 요산의 축적은 서구화된 식사가 만연해진 현대 사회의 건강 문제가 되었다. 높은 요산 수치는 고요산혈증과 통풍을 유발한다. 통풍은 특히 관절 주변의 통증, 붓기, 발진, 그리고 무력감을 일으킨다. 요산의 체외 배출이 어려운 것은 체내에 요산산화효소가 없기 때문이다. 이종 기원의 요산 분해 경로를 구축하기 위해 본 연구는 요산산화효소 활성이 있는 재조합 Leuconostoc citreum 균주를 제작하였다. 재조합 L. citreum 균주(Lc/pucLM)는 Bacillus subtilis subsp. spizizenii 유래 요산 산화효소(PucL)와 5-하이드록시아이소유레이트 가수분해 효소(PucM)를 발현하도록 설계되었다. Lc/pucLM 재조합 균주는 요산이 포함된 한천 배지에서 제거환(clear zone)을 나타내었다. Lc/pucLM균주에서 발현된 PucL과 PucM 단백질은 SDS-PAGE로 증명되었다. Lc/pucLM의 최대 효소 활성은 51.4 U/mg of protein으로 측정되었다. Lc/pucLM은 향후 추가적인 연구를 통해 높은 요산 수치를 완화시키기 위한 치료용 프로바이오틱스로 경구 투여에 이용될 수 있을 것으로 예상된다. Excess uric acid is a health concern in a modern society where westernized diet is becoming more prevalent. High level of uric acid in human body can cause hyperuricemia and gout. Gout especially causes pain around joints, swelling, redness, and tenderness. The difficulty of uric acid excretion is attributed to the absence of uricase in human. To reduce uric acid accumulation in the body, probiotics harboring uric acid degradation metabolism can be used as therapeutics. In this study, the recombinant Leuconostoc citreum strain overexpressing the heterologous uricase enzyme that degrades uric acid was constructed. Specifically, the uricase (PucL) and 5-hydroxyisourate hydrolase (PucM) from Bacillus subtilis subsp. spizizenii were introduced into the L. citreum strain which was isolated from Kimchi. The resulting L. citreum strain (Lc/pucLM) exhibited clear zone on agar medium containing uric acid which suggests uricase activity. The heterologous expressions of uricase (PucL) and 5-hydroxyisourate hydrolase (PucM) in the Lc/pucLM strain were confirmed by the SDS-PAGE analysis. The maximum uricase activity of the Lc/pucLM strain was 51.4 U/mg of protein. The Lc/pucLM strain may be further utilized as therapeutic engineered probiotics to alleviate high uric acid level in human body if further pre-clinical and clinical studies confirm the effectiveness of this strain in managing hyperuricemia and gout.

탈지분유 첨가가 김치 유래 Leuconostoc citreum 으로 제조한 발효쌀반죽과 절편의 특성에 미치는 영향

백선영 연세대학교 대학원 2011 국내석사