간에서 LRH-1에 의한 PLIN5 유전자 발현 조절

뻔터 루비 계명대학교 대학원 2021 국내석사

간 수용체 동족체-1 (LRH-1)은 간에서 포도당, 담즙산 및 미토콘드리아 대사의 조절자로 알려져 있다. 그러나 지질 동원을 위한 LRH-1의 기능적 메커니즘은 잘 연구되어지지 않았다. 이 연구에서는 영양 결핍 상태에서 정상적인 간의 생리 상태를 유지하기 위해 지질 대사에 관여하는 LRH-1의 조절기능을 규명하였다. 정상 및 간 특이적 LRH-1 결핍 마우스를 식이하거나 24 시간 동안 금식하고 난 후에 간 및 혈청을 분리하였다. LRH-1의 표적인자를 규명하기 위해서 mRNA 발현 분석, 단백질의 발현 확인 및 조직병리학적 분석을 사용하였다. 먼저 일차 간세포를 분리한 후 지질의 면역염색을 수행한 결과, 금식하는 동안 결핍 마우스는 정상 마우스와 비교하여 간에서 중성지방이 더 축적됨을 확인하였다. 그리고 흥미롭게도 LRH-1이 결핍된 마우스의 간에서 perilipin 5 (PLIN5)의 발현이 감소하였고, 지방산 β-산화에 관여하는 유전자들이 감소됨을 확인하였다. 또한, LRH-1 활성물질인 dialauroylphosphatidylcholine을 처리하였을 때 인체 유래 간세포인 HepG2 세포에서 PLIN5의 발현이 증가됨을 알 수 있었다. PLIN5가 LRH-1의 새로운 표적 유전자인지를 검증하기 위해서 프로모터 분석과 염색질 면역항체침전법 분석을 통해 마우스 PLIN5 프로모터의 –1620 bp와–1614 bp 사이에 LRH-1가 결합하는 부위가 있음을 검증하였다. 또한, 금식된 정상 마우스의 일차 간세포는 금식된 LRH-1 결핍 마우스의 일차 간세포에 비해 지질 방울에서 PLIN5가 함께 발현되는 것을 확인하였다. 결론적으로, 이 연구에서 LRH-1은 세포의 에너지 요구에 따른 지방산 베타 산화를 유도하고, 혈중으로 중성지방 분비를 증가시키며, 금식에 의한 영양 결핍 시에 지질 축적으로부터 간을 보호하는 기능을 하고 있는 중요한 조절자임을 새롭게 밝혔다. The liver receptor homolog-1 (LRH-1) has emerged as a regulator of hepatic glucose, bile acid and mitochondrial metabolism. However, the functional mechanism of LRH-1 on lipid mobilization has not been addressed. This study investigated the regulatory function of LRH-1 in lipid metabolism during fasting. The wild type (WT) and LRH-1 liver specific knockout (LKO) mice were either fed or fasted for 24 h and the liver and serum were isolated. During fasting, LRH-1 LKO mice showed greater accumulation of triglycerides in the liver compared to WT mice. Interestingly, LRH-1 LKO liver decreased the perilipin 5 (PLIN5) expression and genes involved in β-oxidation. Additionally, the LRH-1 agonist dialauroylphosphatidylcholine also enhances the PLIN5 expression in human cultured HepG2 cells. To identify new target gene of LRH-1, these findings direct to analyze the PLIN5 promoter sequence which revealed -1620/-1614 to be a putative binding site of LRH-1. It was confirmed by promoter activity and chromatin immunoprecipitation assay. Moreover, fasted primary hepatocytes isolated from WT mice increased the co-localization of PLIN5 in lipid droplets (LDs) compared to fasted LKO primary hepatocytes. Overall, these findings suggest that PLIN5 may be a novel target of LRH-1 to mobilize the LDs and manage the cellular needs.

REGULATION OF OCT4 GENE EXPRESSION BY LIVER RECEPTOR HOMOLOG-1 IN HUMAN EMBRYONIC CARCINOMA CELLS

성보름 차의과학대학교 대학원 2013 국내석사

We demonstrate the regulation of OCT4 gene expression mediated by liver receptor homolog-1 (LRH-1) in human embryonic carcinoma cells. LRH-1 and OCT4 are co-expressed in undifferentiated NCCIT cells and decreased during retinoic acid-induced differentiation. Dose-dependent overexpression of LRH-1 transactivated the OCT4 promoter activity and its dominant negative form with a deletion of activation function-2 motif reduced the activity even in the presence of LRH-1. The OCT4 promoter contains potent three LRH-1 binding sites; one within conserved region (CR) 1 and two within CR2. Mutagenesis of each binding site affected the decrease in OCT4 promoter activity and the 2nd binding site mutant most significantly reduced the transcriptional activity, compared to that of 1st and 3rd binding site mutants, respectively. Simultaneous disruption of 2nd and 3rd binding sites led to significant down-regulation of the activity even in the presence of 1st binding site-containing CR1. Moreover, mutation of each binding element within native or exogenous minimal promoter-driven CR1 or CR2 also decreased the promoter activity to some different extent, suggesting that three binding elements may be implicated in the induction of the full-activity of OCT4 promoter. In vivo binding assay revealed the 2nd and 3rd binding motifs within CR2 were more enriched than the 1st one within CR1. Taken together, our study indicates that LRH-1 acts as a transcriptional activator in the regulation of OCT4 gene expression through the cooperative interaction with three binding sites directly or/and indirectly. OCT4는 세포분화와 배아세포 성장 조절에 필수적인 전사인자이다. mouse에서 OCT4 발현은 nuclear receptors (NRs)에 의해 직접적으로 조절 된다. NRs에는 steroidogenic factor (SF-1), retinoic acid receptors and retinoid X receptors, liver receptor homolog1 (LRH-1)이 포함 되어 있다. 최근 연구에서 human의 SF-1은 OCT4 promoter에 직접적으로 결합하여 OCT4발현을 증가시키며, mouse에서는 LRH-1이 OCT4 promoter에 직접적으로 결합하여 발현을 촉진 시킨다고 보고되었다. 이번 연구를 통해 우리는 사람 세포에서 LRH-1에 의한 OCT4 유전자 발현 조절 기작을 증명 하고자 하였다. LRH-1과 OCT4 유전자는 분화 되지 않은 NCCIT 세포에서 함께 발현 되었으며 retinoic acid에 의해 분화가 유도된 NCCIT 세포내에서 발현량이 함께 감소하였다. OCT4 promoter 활성은 LRH-1이 과발현 되었을 때 증가 하였으나, LRH-1 dominant negative form과 함께 발현 되었을 때는 감소하였다. 또한 mouse, bovine, human의 OCT4 promoter 서열을 비교 분석하여 유전학적으로 높은 유사성을 보이는 4개의 보존된 구역을 찾을 수 있었다. 그 중 첫 번째와 두 번째 보존된 구역에서는 LRH-1과 결합 할 가능성이 있는 3개의 부위가 존재 했다. 각각의 결합 부위는 site-directed mutagenesis를 통해 돌연변이체를 만들었다. 정상형의 OCT4 promoter와 각각의 결합부위 돌연변위체에 LRH-1을 과발현 시켰을 때 두 번째 LRH-1 결합부위 돌연변이체의 OCT4 promoter 활성이 첫 번째 세 번째 부위 돌연변이체와 비교하였을 때 가장 감소하였다. 첫 번째, 두 번째 보존된 구역을 따로 분리한 뒤 각각의 결합 부위 돌연변이체를 제작 하였다. 돌연변이체에 LRH-1을 과발현 시켰을 때 세 번째 결합부위 돌연변이체의 OCT4 promoter 활성이 가장 감소하였다. 두 번째 결합 부위가 전체 promoter에서 가장 중요하게 작용하는 요소이며 첫 번째와 세 번째 결합부위 역시 서로간의 영향을 주며 OCT4의 전사활성을 조절 한다는 것을 알 수 있었다. 또한 세포내에서의 LRH-1과 OCT4 promoter의 상호작용을 알아보기 위하여 실행한 염색질 면역 침강법에서 세 개의 LRH-1 결합부위 모두 LRH-1와 상호작용을 한다는 것을 알 수가 있었다. 특히 두 번째 LRH-1 결합부위가 다른 결합부위보다 가장 강한 상호작용을 하였다. 결론적으로, 본 연구를 통하여 우리는 LRH-1은 세포내에서 세 개의 결합 부위에 직접적으로 결합함으로써 OCT4유전자 전사 활성을 증폭시키며 발현을 조절한다는 것을 증명하였다. 핵심되는 말 : Human OCT4 promoter, LRH-1, 전사활성

Liver receptor homolog-1에 의한 베테인호모시스테인 메틸전이효소 유전자 발현 조절 기전

한희경 계명대학교 대학원 2023 국내석사

간 수용체 동족체–1(Liver receptor homolog-1, LRH-1)은 장, 간 및 췌장에서 유전자 발현을 조절하는 세포 내 전사인자이며, 대사 항상성을 조절하는 중요한 고아 핵 수용체이다. 주로 지질과 콜레스테롤 대사에 관여하며, 금식 시 간에서 LRH-1 발현이 증가한다고 보고되어 있다. LRH-1의 표적인자들이 일부 규명되었으나 아직도 표적인자에 대한 발굴이 부족한 실정이다. 베테인 호모시스테인 S-메틸 전이효소(Betaine-homocysteine S-methyltransferase, BHMT)는 간에 존재하는 가장 풍부한 단백질 중 하나로써 호모시스테인 대사 조절에 관여한다. 또한 BHMT의 발현이 감소하였을 때 간에서 축적된 호모시스테인은 소포체 스트레스를 유발한다고 알려져 있다. 지금까지 간에서 BHMT 기능 연구는 되어 있으나, BHMT 발현 조절 기전은 거의 알려진 바가 없다. 따라서 이 연구에서는 LRH-1에 의한 BHMT의 발현 조절 기전을 규명하고 BHMT의 유전자 발현 감소에 의한 간 대사 기능에 미치는 영향을 밝히고자 한다. LRH-1 정상 및 LRH-1 결핍 마우스에서 간 조직 및 혈청을 분리하였고 QPCR, Western Blot 및 조직염색분석을 통하여 LRH-1 표적인자를 규명하였다. 금식한 정상 마우스의 간에서 LRH-1과 함께 BHMT의 유전자 발현이 증가하였으나, LRH-1 결핍 마우스에서는 BHMT 유전자 발현이 증가하지 않았다. 또한 헤마톡실린-에오신 염색을 통해 금식한 LRH-1 결핍 마우스의 간에서 중성지방이 더 축적되는 것을 확인하였고, 활성산소종에 의해 증가되는 지질과산화물의 함량을 측정한 결과, 금식 상태의 LRH-1 결핍 마우스에서 많이 증가된 것을 보았다. BHMT가 LRH-1에 의해 조절되는지 확인하기 위해 HepG2 세포에 LRH-1을 과발현한 결과 BHMT의 발현이 유의하게 증가하였다. 추가적으로 LRH-1에 의해 BHMT의 발현이 직접적으로 조절되는지 확인하기 위하여 프로모터 활성도 분석을 한 결과, BHMT 프로모터의 +131∼+137 bp 사이에 LRH-1이 결합하는 부위가 있음을 검증하였다. 이러한 연구결과는 금식 시 간에서 LRH-1의 활성으로 인한 BHMT의 발현 증가가 활성산소종을 억제하고 소포체 스트레스를 감소시킴으로써 중성지방 축적을 개선하는 것에 도움이 될 것이라고 제시하였다. Liver receptor homolog-1 (LRH-1) is an orphan nuclear receptor. It is primarily involved in lipid and cholesterol metabolism, and previous study confirmed that LRH-1 expression was increased in the liver during fasting. Betaine-homocysteine S-methyltransferase (BHMT), one of the most abundant proteins in the liver, is involved inn the regulation of homocysteine metabolism. Furthermore, it is known that decreased BHMT gene expression leads to homocysteine accumulation in the liver, which can induce endoplasmic reticulum (ER) stress. In this study, the mechanism of controlling the expression of BHMT by LRH-1 was identified, and the effect of BHMT deficiency on metabolic function was revealed in the liver. During fasting, both BHMT and LRH-1 gene expression increasedin the liver of normal mice, but BHMT gene expression was decreased in LRH-1 deficient mice. In addition, the lipid peroxide content in the liver tissues of LRH-1 deficient mice was increased. Promoter activity analysis confirmed the binding of LRH-1 to a specific site at +131 ∼ +137 bp of the BHMT promoter. In conclusion, this study suggested that LRH-1-mediated increase in BHMT gene expression alleviates triglyceride accumulation by suppressing reactive oxygen species levels and reducing ER stress.

간에서 Liver receptor homolog-1에 의한 Cystathionine g-lyase 조절 기전

박수영 계명대학교 대학원 2024 국내석사

Liver receptor homolog-1(LRH-1)은 고아핵수용체 계열의 전사인자로 주로 간, 췌장 그리고 난소에서 많이 발현되고, 담즙산 합성과 콜레스테롤 역수송에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 특히 간에서는 포도당, 담즙산 및 미토콘드리아 대사의 조절자로 알려져 있다. 황화수소는 가장 최근에 발견된 신경전달물질로 세포 보호, 염증, 혈관 기능, 신경 기능, 미토콘드리아 기능, 에너지대사 및 노화에서 중요한 역할을 한다. 황화수소는 cystein, cystathionine, homocysteine 경로의 효소 중 cystathionine g-layse(CTH), cystathionine b-synthase와 3-mecaptopyruvate sulfurtransferase에 의해 촉매되는 반응에서 역 황화 경로를 통하여 생성된다. CTH는 주로 간, 혈관계 및 췌장에서 발현된다고 알려져 있으며, 황화수소 생성에 크게 기여한다. 하지만 CTH의 발현조절 기전에 대해서는 아직 보고된 바가 없다. 따라서 이 연구에서는 LRH-1에 의한 CTH의 발현조절 기전을 규명하고, 황화수소 생성이 간의 중성지방 축적에 미치는 영향을 밝히고자 하였다. 이전 RNA-seq 자료를 바탕으로 CTH 프로모터에 LRH-1 결합이 가능한 유전자 염기서열이 있음을 발견하였다. 인간 간암 세포주 HEK-293T 세포에 LRH-1을 과발현 유도 후 활성물질인 DLPC를 처리하였을 때 CTH의 프로모터 활성이 증가하는 것을 확인하였다. 그래서 CTH가 LRH-1의 표적 유전자임을 검증하기 위해 정상 및 간 특이적 LRH-1 결핍 마우스에 식이 또는 24 시간 금식 후 간 및 혈청을 분리하였다. 조직병리학적, mRNA 발현, 단백질 발현량을 분석한 결과, 선행연구에서 밝혀진 것과 같이 간 내 지질축적이 증가 되었고, CTH는 24시간 금식한 정상 마우스에서 발현이 증가하였으나, LRH-1이 결핍된 마우스에서는 증가하지 않았다. CTH가 황화수소 생성에 관여하는 효소이므로 황화수소의 활성을 정상 식이 또는 24 시간 금식한 마우스에서 각각 측정해 보았더니 금식한 정상 마우스에서만 황화수소의 생성이 증가하였고, LRH-1이 결핍된 마우스에서는 증가하지 않았다. 결론적으로 이 연구를 통하여 CTH가 LRH-1의 표적 유전자임을 규명하였으며, LRH-1 결핍에서 CTH 발현이 감소함으로써 황화수소의 생성이 감소하여 간 내 중성지방 축적이 가속화되는 기전을 규명하였다. Liver receptor homolog-1 (LRH-1) is a widely expressed transcription factor belonging to the family of orphan nuclear receptors. It plays a crucial role in bile acid synthesis and cholesterol reverse transport in the liver and pancreas. Hydrogen sulfide involved in cell protection, inflammation, vascular function, nerve function and mitochondrial function, is generated through areverse sulfur reaction catalyzed by enzymes like cystathione -layse (CTH), cystathione -synthase, and 3-mecaptopyruvate sulfur transferase. However, the regulatory mechanism governing CTH expression remains unknown. This study aimed to investigate how LHR-1 controls CTH expression and the impact of hydrogen sulfide on the hepatic accumulation of neutral fat. CTH expression was significantly increased by 24-hour fasting in normal mice. To assess hydrogen sulfide activity, mice were measured for hydrogen sulfide production under non-fasting or 24-hour fasting conditions, and it was confirmed that hydrogen sulfide production was significantly reduced in LRH-1 LKO mice than in WT mice. In conclusion, this study supports the notion that CTH is a target gene for LRH-1 and that LRH-1 deficiency leads to reduced hydrogen sulfide production by downregulating CTH expression. This decrease in hydrogen sulfide production impairs fatty acid oxidation, resulting in the accelerated accumulation of triglycerides in the liver.

간에서 Liver Receptor Homolog-1에 의한 Aldehyde Dehydrogenase 1B1 조절 기전

서민희 계명대학교 대학원 2024 국내석사

에탄올이 유입되면 간에서 다양한 효소 활성에 의해 해독작용을 거친다. 그 중 알데하이드 탈수소효소가 제대로 작용하지 않으면 간 세포에서 독성물질인 아세트알데하이드의 지속적인 축적으로 인해 악화되어 알코올성 지방간염에서 더 나아가 간암까지 진행될 수 있다. 이전 연구에서 에탄올의 과도한 섭취에 의해 지질축적이 간 조직에서 일어남을 확인하였다. 간 수용체 동족체–1(liver receptor homolog-1, LRH-1)은 핵 수용체 NR5A 구성원으로 간, 장 및 췌장 등에서 발현된다. LRH-1은 지질, 담즙산 및 포도당 대사에 관여하는 조절인자이지만 에탄올 대사에서의 역할은 명확하지 않다. 따라서 이번 연구는 에탄올에 의한 지질축적과 LRH-1의 관계성을 확인해 보고자 하였다. 먼저 간의 에탄올 대사에서 LRH-1의 기능을 밝히기 위해 LRH-1f/f 및 간 특이적 LRH-1f/cre+ 마우스에 3주간 에탄올 액상 식이를 진행하여 분석해 본 결과, LRH-1f/cre+ 마우스에서 간 내 지질 축적이 되었고, 간 무게, 중성지방 및 총 콜레스테롤 함량이 증가한 것을 볼 수 있었다. 혈청으로 간 손상도 및 아세트알데하이드 함량을 측정해 본 결과 또한 에탄올 함유 식이를 한 LRH-1f/cre+ 마우스에서 높은 수치를 보였다. 에탄올 대사에서 LRH-1의 표적인자를 탐색하기 위해 RNA-Sequencings 분석을 하였다. 그 결과, 대조군과 에탄올군에서 알데하이드 탈수소효소 1B1(aldehyde dehydrogenase 1B1, ALDH1B1)이 에탄올 대사에 유의성을 가지고 있으며, 이와 관련된 유전자가 지방산 대사 및 간질환에 연관이 있음을 확인하였다. 이를 검증하기 위해 에탄올 대사 관련 유전자의 발현을 살펴본 결과, LRH-1이 결핍되었을 때 ALDH1B1의 mRNA 및 단백질 발현이 확연하게 감소하는 것을 확인하였다. 그리고 ALDH1B1이 LRH-1의 표적인자인지 확인하기 위해 HepG2 세포에 LRH-1을 과발현한 결과, ALDH1B1의 발현이 증가하였으며, ChIP-Sequencing 자료를 통해 ALDH1B1 프로모터 영역에서 LRH-1 결합 부위 피크를 확인하였다. 결론적으로 이 연구를 통하여 LRH-1 결핍되면 ALDH1B1 발현이 감소하여 아세트알데하이드가 축적되고 간 내 중성지방 축적이 가속화됨을 확인하였다. Ethanol is detoxified in the liver by various enzymes. Previous studies confirm that ethanol intake causes liver lipid accumulation. The Liver receptor homolog-1 (LRH-1) is involved in the regulation of lipid and bile acid metabolism, but its role in ethanol metabolism is not clear. Therefore, this study aimed to explore the relation between ethanol-induced lipid accumulation and LRH-1. To understand LRH-1's role in liver ethanol metabolism, LRH-1f/f and liver-specific LRH-1f/cre+ mice conducted a liquid ethanol diet for three weeks. The results showed that LRH-1f/cre+ mice exhibited increased indicated by higher liver weight, neutral fat, and total cholesterol levels. Measurement of serum liver damage and acetaldehyde levels increased in LRH-1f/cre+ mice fed an ethanol diet. To explore LRH-1 target in ethanol metabolism, RNA-Sequencing analysis was conducted. The results showed that Aldehyde dehydrogenase 1B1 (ALDH1B1) was related to ethanol metabolism. When LRH-1 was deficient, ethanol metabolism genes exhibited a significant decrease in ALDH1B1 expression. Additionally, LRH-1 overexpression in HepG2 cells resulted in increased ALDH1B1 expression, and ChIP-Sequencing data confirmed the binding peaks of LRH-1 in the ALDH1B1 promoter. In conclusion, this study confirms that depletion of LRH-1 leads to decreased expression of ALDH1B1, resulting in the accumulation of acetaldehyde and accelerated intrahepatic fat accumulation.

Development and Application of Mass Spectrometry-Based Proteomics For: I. Structural Proteomic Guided Investigation of SARS-CoV-2 Polyproteins and Non-Structural Proteins & II. Extending Chemoproteomic Approaches to Decipher the Regulatory Network of LRH-1

Courouble, Valentine V The Scripps Research Institute ProQuest Dissertati 2023 해외박사(DDOD)

Mass spectrometry (MS) is a central analytical technique used to study proteins and biomolecules. It measures mass-to-charge ratio of ions to identify and quantify molecules in simple and complex mixtures. Technological advancement in instrumentation, sample preparation methodologies, and data analysis workflows continue to push the capabilities of MS to answer more complicated questions and vice versa. The work presented in this dissertation applies and extends MS-based technologies across multiple facets of the proteomics landscape including structural proteomic to elucidate the structure of SARSCoV-2 related proteins in Project 1 and chemoproteomic to develop novel methodologies to extend our understanding of the regulatory mechanisms of the nuclear receptor (NR) liver receptor homolog-1 (LRH-1) in Project 2.Structural proteomics uses MS-based methodologies to characterize protein structure. Specifically, it captures the structural plasticity inherent to proteins in solution. In Project 1 we utilized hydrogen deuterium exchange MS and crosslinking MS as complementary techniques to interrogate the published heterotetrameric crystal structures of the SARSCoV-2 nsp7:nsp8 complex. This work revealed that SARS-CoV-2 nsp7 and nsp8 do not assemble into a hexadecameric structure as implied by the SARS-CoV nsp7:nsp8 crystal structure, rather they dissociate into a stable dimeric unit that binds to nsp12 in the replication transcription complex without significantly altering nsp7-nsp8 interactions. Subsequently, we generated the first three-dimensional models of the nsp7-10/11 polyproteins and revealed that the nsp7-10/11 structure in complex with Mpro strongly resembles the unbound polyprotein, such that both polyprotein conformation and junction accessibility determine the preference and order of Mpro-mediated cleavages.Chemoproteomic techniques monitor proteome-wide small molecule-protein interactions. Despite advancements in the chemoproteomic field, proteomic analysis of NRs remains a challenge as NRs are relatively low abundant and can be tightly bound to chromatin. In Project 2, our work generated novel probes to capture endogenous LRH-1 and LRH-1 transcriptional complexes to extend our understanding of LRH-1 regulatory mechanisms. Additionally, we made efforts towards the identification of the molecular target of SR1848, to understand how SR1848 represses LRH-1 activity. This led to the discovery of a novel LRH-1 coregulator, peptidyl-prolyl cis-trans isomerases B (PPIB), that we hypothesize regulates LRH-1 trafficking.