Itraconazole의 P-glycoprotein 억제가 Fexofenadine의 체내동태에 미치는 효과

홍은석 仁濟大學校 2003 국내박사

목적 : 약물수송단백인 P-glycoprotein(Pgp)은 다양한 기질약물의 체내 분포에 관여하는 것으로 알려져 있다. Pgp 기능 저해제로 알려진 itaconazole이 Pgp 기질 약물인 fexofenadine의 약동학 및 약력학에 미치는 영향을 평가하고자 하였다. 더불어 Pgp 발현에 영향 미치는 MDRIC3435T 유전자 변이를 가진 피험자를 대상으로 하여 Pgp 저해제의 유전형에 따른 영향의 차이를 규명하고자 하였다. 방법 : PCR-RFLP 방법으로 HDRI 유전자형을 분석하여 총 12 명의 건강한 성인 피험자들을 선정하였다. MDRI C3435T 정상유전자 6명, T/T 6명 피험자들을 대상으로 위약 또는 itraconazole 200㎎ 투여 후 1시간 째에 fexofenadine 180 ㎎을 1회 경구투여한 후 24 시간까지의 혈액을 취하였다. 혈장내 fexofenadime의 농도를 고압액체크로마토그라피(HPLC)를 이용하여 측정하고 WinNonlin^(�) 을 이용하여 약동학적 경수를 구하여 약동학적 분석을 하였다. 한편, 약력학적 평가를 위하여 fexofenadine 투여 전후 histamine을 피내주사하고 4 시간 동안 투여부위 피부의 두드러기, 탱진(wheal) 및 발적(flare)의 크기를 측정하여 두 군 간의 결과를 비교 평가하였고, 중추신경계 부작용에 대한 평가로써 DSST(Digit Symbol Substitution Test)를 실시하였다. 결과 : Itraconazole과 같이 fexofenadine을 병용투여한 경우 단독으로 투여할 때에 비해 현저한 농도상승과 함께 AUC와 Cmax가 각각 2.1 배, 2.7배 상승한 반면, Cl/F와 Vdss/F는 2배이상 감소하여 현저한 생체이용률의 증대를 관찰할 수 있었다. 이런 fexofenadine 의 약동학적 변화는 약력학적 변화와 항히스타민 작용의 증대로 나타났다. 또한 itraconazole에 의한 fexofenadine의 체내 분포변화는 MDRI C3435T 에 대한 정상 유전자군에서 뿐만아니라 T/T 유전자 변이군에서도 관찰되었다. 한편, 유전자 MDRI C343ST의 유전형에 따른 두 군간의 fexofenadine의 약동학적 경수들은 유의한 차이는 보이지 않았으나, 약물의 흡수속도에 의해 결정되는 4-6시간 동만의 약물농도상에서 T/T군에서 정상유전자군에 비하여 큰 것으로 나타났고, itraconazole을 투여 한 후 두 군간의 비교에서는 AUCinf, Cl/F, Vdss/F 가 유의하게 차이를 보였다. 결론 : 본 연구의 결과로부터 itraconazole은 Pgp 의 강력한 기능저해제로 fexefenadine의 체내 분포 변화에 영향을 미칠 것으로 판단된다. 또한, MDRI C343ST 유전적 변이가 fexofenadine의 생체이용률을 증가시키며, MDRI C3435T 의 유전적 다형성이 fexofenadine 의 체내 분포의 개인차에 영향을 미칠 것으로 생각된다. Objectives P-glycoprotein(Pgp) is expected to be an important factor in the disposition of many drugs. The effect of itraconazole, a kind of azole antifungals and Pgp inhibitor, on the disposition of fexofenadine known P-glycoprotein substrate, was evaluated in 12 subjects whose genotype of MDRl C3435T allele was predetermined. Methods All subjects were given single oral dose of 180mg fexofenadine at 1 hour after single oral dose of 200mg itraconazole or placebo as placebo based double blind randomized crossover study. Blood samples were serially drawn and urine samples were collected upto 24 hours. Histamine induced wheal and flare sizes were also measured for 4 hours after fexofenadine dose to compare the pharmacodynamic effects. Concentrations of fexofenadine were measured with HPLC using fluorescence detector. Kinetic parameters were calculated by fitting the data to PK models using WinNonlin_(�). Results The pretreatment of itraconazole significantly increased the AUC and Cmax (2.1 and 2.7 fold, respectively) and decreased Cl/F (2.7 fold) of fexofenadine compared to pretreatment of placebo in subjects with both genotypes. In the phase of placebo pretreatment, mean concentrations in absorptive phase, the AUC and Cmax of subjects with MDRl 3435 T/T allele tended to be higher than those in subjects with C/C allele. Those differences were magnified in the phase of itraconazole pretreatment. The antihistamine effect of fexofenadine using histamine induced skin wheal and flare reaction tend to be increased after itraconazole pretreatment compared with placebo treatment. Conclusions These results suggest that the disposition and antihistamine effect of fexofenadine were influenced by co-administered itraconazole, a Pgp inhibitor, in addition to the moderate effect of MDRl C3435T genotype.

Formulation and evaluation of topical solutions containing itraconazole-phenol eutectic mixture

최나영 성균관대학교 일반대학원 2010 국내석사

이트라코나졸은 진균의 피부 감염에 의한 무좀을 치료하는 약물로, 현재 경구용 제제만이 사용되고 있다. 그러나 이트라코나졸을 경구로 투여할 경우, 생체 이용률이 낮고 그 개인차가 크며, 위장관 장애 부작용이 나타난다. 또한, 무좀이란 질병의 특성 상 감염 부위에만 약물이 고농도로 유지되는 것이 치료에 효과적이므로 경구용 제제 대신 외용제로 적용할 경우에 더 높은 치료 효과를 기대할 수 있다. 그러나 이트라코나졸은 피부 투과성이 낮기 때문에, 외용제로 만드는 데 어려움이 있다. 따라서 이트라코나졸의 녹는점을 낮추기 위해 이트라코나졸과 페놀의 공융 혼합물을 사용하고, 기존의 자료보다 고농도의 약물을 로딩하기 위하여 용액으로 제조하였다. 이 실험의 목적은 이트라코나졸과 페놀의 공융 혼합물을 함유한 외용액의 제조와 피부 투과, 침적 그리고 자극 시험을 이용한 평가이다. 피부 투과 실험은 무모 마우스에서 Franz 확산 셀을 이용하여 진행하였다. 이트라코나졸과 페놀의 공융비, 이트라코나졸과 피부 투과 촉진제, 점도 증강제의 농도를 변화시켜 가며 이트라코나졸의 피부 투과에 미치는 영향을 시험하였다. 이트라코나졸의 농도가 증가함에 따라 이트라코나졸의 투과량과 투과속도가 증가하였으나, 안정성 시험 결과에 따라 이트라코나졸의 농도는 5%로 선택하였다. 또한 피부투과 촉진제로 사용된 올레익 액시드는 처방에 첨가할 경우, 이트라코나졸의 투과속도가 유의적으로 증가하였고, 그 원인으로는 올레익 액시드가 피부 지질층의 상변화 온도를 낮춤으로써 지질 구조의 유동성을 증가시키는 것으로 사료된다. 또한, 처방에서 벤질 알코올의 함량이 증가하면 이트라코나졸 투과에의 지연 시간이 증가하고, HPMC 2910의 함량이 증가하면 외용액의 점도가 증가하고 그에 따라 이트라코나졸의 투과 속도는 유의적으로 감소하였다. 이는 점도가 낮을수록 피부층을 통과하여 수용체 상으로 투과되기 용이하기 때문이라 사료된다. 피부 투과 실험 결과, 최종 처방의 피부 투과량은 32.68 ± 4.39 &micro;g/cm2 이었다. 최종 처방과 거기서 페놀을 제외한 처방으로 Sprague-Dawley 쥐에서 피부 침적 실험을 실시하였다. 피부 침적 실험 결과, 각질층에서 두 처방 간에 유의적인 차이는 나타나지 않아서, (P > 0.05) 이트라코나졸의 침적에는 공융 혼합물이 영향을 미치지 않았음을 확인할 수 있었다. 그러나 각질층을 제외한 나머지 피부 층인 진피와 상피에서는 공융 혼합물을 이용한 처방에서 더 적은 양의 이트라코나졸이 침적된 것을 확인할 수 있었다. 이것은 공융 혼합물의 점도로 인하여 마치 reservoir처럼, 외용액에서의 이트라코나졸 방출이 조절된 것이라 사료된다. 또 시간이 지남에 따라 이트라코나졸의 침적량이 감소한 이유로는, 투과 속도가 대사 속도보다 감소한 것에 따른 결과라 사료된다. 피부 자극 실험의 경우, 뉴질랜드 토끼를 사용하여 진행되었는데, 그 결과 이트라코나졸과 페놀의 공융혼합물을 함유한 포뮬레이션에서 피부에 어떠한 자극도 나타나지 않았다. 따라서 이트라코나졸과 페놀의 공융 혼합물을 이용한 외용액의 경우, 이트라코나졸의 높은 피부 투과량과 피부 속도를 나타냈으며, 실제 적용을 위해서는 병리 부위에 적용하여 치료 효과를 확인하는 보충 실험이 필요하다고 생각된다. Itraconazole has been used to treat dermatophytosis, mycosis infections of the skin caused by parasitic fungi, but only in the form of oral dosage. However, the low and variable bioavailability, gastrointestinal adverse effect and requirement of high concentration at the infection area call for alternative form, topical dosage form. But, due to its low solubility and skin permeability, it is difficult to make an effective topical dosage form containing itraconazole. If the eutectic mixture is used to prepare topical solution, the solubility and the flux of the insoluble drug will be increased. Therefore, as using eutectic mixture containing itraconazole and phenol, this problem was proved at this study. The purpose of this study was to formulate the optimal topical solution containing itraconazole-phenol eutectic mixture and evaluate of permeation, deposition and irritation for topical skin delivery of itraconazole. The effect of formulations on the hairless mouse skin permeation was determined using Franz diffusion cells at 37℃. The ratio of itraconazole-phenol eutectic mixture and the concentrations of itraconazole, penetration enhancer and thickening agents effected not only the skin permeation rate of itraconazole but also the lag time. As the results, increasing the concentration of itraconazole also increased the amount of itraconazole permeated and the flux of itraconazole through excised hairless mouse skin. But, depending on the results of stability test, the concentration of itraconazole was chosen as 5%. And by adding oleic acid in the topical solution, the flux of itraconazole was significantly increased. It was considered that oleic acid decreased the phase transition temperatures of the skin lipids with a resultant increase in motional freedom or fluidity of theses structures. Also, by increasing benzyl alcohol in the topical solution, lag time of itraconazole permeated was significantly increased. But faster lag time is more efficient. And by increasing concentration of HPMC 2910 in the topical solution, the viscosity of topical solution was increased and thus the flux of itraconazole was significantly decreased. It was considered that topical solutions of lower viscosity were more effective to permeate through skin layer to receptor phase. As a result, cumulative amount of itraconazole permeated through excised hairless mouse was 32.68 ± 4.39 &micro;g/cm2 at optimal formulation. And the effect of the optimal formulation and the former formulation without phenol on the Sprague-Dawley rats’ skin deposition was determined. At skin deposition test, there was no significant difference (P > 0.05) between optimal formulation and the same formulation but phenol at stratum corneum. It means that the deposition of itraconazole is not affected by eutectic mixture. And the reason of decreasing the amount of itraconazole deposited as time goes, was that the flux of itraconazole permeated through SD rats’ skin also was decreased. However, the results of dermis and epidermis, There was no significant difference at 4hr (P > 0.05), but there were significant differences at both 8 and 12 hr (P < 0.05). In particular, the formulation containing itraconazole-phenol eutectic mixture was presented the less amount of itraconazole deposited. It was considered that eutectic mixture given viscosity, such as reservoir, may control the release of itraconazole in topical solutions. And the reason of decreasing the amount of itraconazole deposited as time goes, was that the flux of itraconazole permeated through SD rats’ skin also was decreased. So, the rate of skin permeation may be less than the rate of metabolism. The irritation test on New Zealand white rabbits was conducted. As the result, the topical solutions containing itraconazole-phenol eutectic mixture did not damage on the rabbits’ skin. Thus, this itraconazole topical solution containing itraconazole-phenol eutectic mixture may provide a useful topical delivery for itraconazole.

Itraconazole ameliorates chlorhexidine gluconate-induced peritoneal fibrosis in mice

김진숙 경희대학교 대학원 2018 국내박사

목적: 복막경화증은 복막투석환자에서 투석의 실패 및 높은 사망률과 연관된 심각한 합병증 중 하나이다. 하지만 아직 명확한 메커니즘이 밝혀지지 않았고 질병 특이적인 치료 방법이 확립되어 있지 않아 추가 연구가 필요한 분야이다. 최근 Sonic hedgehog (Shh) 신호전달체계가 조직의 섬유화에 관여하고 있다는 것이 보고 되었으며, 이 신호전달체계를 억제하는 약물이 항섬유화 치료 분야에서 각광을 받고 있다. 항진균제로 널리 알려져 있는 이트라코나졸 (itraconazole) 또한 Shh 신호전달체계를 억제하는 효과를 가지는 것으로 알려져 있다. 본 실험에서는 Shh 신호전달체계가 복막경화증의 발생에 관여하는지와 이트라코나졸 이 복막경화증에 어떠한 효과를 가지는지에 대해 복막경화증 마우스모델과 인간복막중피세포 (human peritoneal mesothelial cells)를 사용하여 연구하였다. 방법: 동물실험에는 C57BL/6 마우스가 사용되었으며, 복막경화는 0.1 % 클로로헥시딘 글루코네이트 (chlorhexidine gluconate, CG)를 격일로 4주 동안 복강 내 주사하여 유발되었다. 치료그룹은 매일 itraconazole 20mg/Kg을 복강 내 주사하였고, 대조그룹은 식염수 (saline)를 복강내 주사하였다. 동물들은 총 4개의 그룹으로 나뉘어 졌으며 (saline 그룹, saline + itraconazole 그룹, CG 그룹, CG + itraconazole 그룹), 복막의 조직학적 변화와 복막 내 Shh 신호전달체계의 발현, 경화증 관련 인자들의 발현을 관찰하였다. 세포실험은 인간복막중피세포를 사용하여 진행되었다. 세포들은 이트라코나졸의 부재 혹은 존재 하에 Shh 단백질과 함께 배양되었으며, 세포의 형태학적 변화와 Shh 신호전달체계의 중요 요소 발현을 관찰하였다. 결과: CG로 복막경화를 유도한 그룹에서 유의한 복막두께의 증가가 관찰되었으며 (80.4 ± 35.6 µm), itraconazole 치료는 복막두께를 유의하게 감소시켰다 (28.2 ± 20.6 µm, p < 0.001). Shh 신호전달체계의 중요 요소인 Shh, patched (PTCH), smoothened (SMO), glioma-associated oncogene transcription factor 1 (GLI1)의 유전자 발현은 CG 그룹의 복막조직에서 상승하였다가 CG + Itraconazole 그룹의 복막조직에서는 유의하게 감소함이 확인 되었다. CG의 복강 내 투여는 α-smooth muscle actin, type I collagen, transforming growth factor-β1과 같은 경화증 관련 인자의 발현을 증가시켰으며, 이트라코나졸 치료는 이를 억제시켰다. 인간복막중피세포에서는 Shh 단백질의 자극으로 SMO와 GLI1의 발현이 증가하였으며, 이는 동물모델에서의 결과와 유사하게 이트라코나졸 치료로 유의하게 감소함이 확인되었다. 결론: 본 연구는 Shh 신호전달체계가 복막경화증의 발생에 관여함을 확인한 첫 번째 연구로, 이트라코나졸 치료가 Shh 신호전달을 조절하여 복막경화증에 대하여 보호효과를 가진다는 것을 같이 확인하였다. 이러한 결과들은 Shh 신호전달체계의 억제가 복막경화증의 잠재적 치료 방안이 될 수 있음을 시사한다. Background Peritoneal fibrosis is a devastating complication of peritoneal dialysis (PD), and one of the important causes which lead to discontinuation of PD. However, the precise mechanism is unclear and specific treatment has not yet been established. Recent evidence suggests that Sonic hedgehog (Shh) signaling pathway is involved in tissue fibrogenesis, and drugs which inhibit this pathway are emerging in the field of anti-fibrosis therapy. Itraconazole, an anti-fungal agent, is recently also recognized as an inhibitor of Shh signaling pathway. The present study investigated whether Shh signaling pathway was involved in the development of peritoneal fibrosis, and examined the effects of itraconazole on peritoneal fibrosis using a mouse model and human peritoneal mesothelial cells (HPMCs). Methods Male C57BL/6 mice were used in this study. Peritoneal fibrosis was induced by intraperitoneal (IP) injection of 0.1% chlorhexidine gluconate (CG) solution every other day for 4 weeks, with or without itraconazole treatment (20mg/kg, IP injection on a daily basis). Isotonic saline was administered intraperitoneally to the control group. The mice were divided into four groups: saline group, saline plus itraconazole group, CG group, and CG plus itraconazole group. Histological changes, expression of fibrosis markers and main components of Shh signaling pathway were evaluated upon peritoneal tissues. In vitro study also performed using HPMCs. The cells were incubated with recombinant human Shh protein in the absence or presence of itraconazole. Morphological changes and components of Shh signaling pathway expression in HPMCs were determined. Results Peritoneal thickening was evident in the CG group and was significantly decreased by administration of itraconazole (80.4 ± 35.6 µm vs. 28.2 ± 20.6 µm, p < 0.001). The expression of Shh signaling pathway components including Shh, patched (PTCH), smoothened (SMO), and glioma-associated oncogene transcription factor 1 (GLI1) was upregulated in the CG group and suppressed by itraconazole treatment. Peritoneal injection of CG solution increased the expression of fibrosis markers such as α-smooth muscle actin (α-SMA), type I collagen, and transforming growth factor-β1 (TGF-β1) in peritoneal tissues, and itraconazole treatment significantly decreased these expressions. In HPMCs, recombinant Shh protein activated SMO and GLI1 expression and itraconazole treatment attenuated the Shh protein-mediated induction of SMO and GLI1. Conclusion This study provides the first evidence that the Shh signaling pathway is implicated in peritoneal fibrosis. It is also demonstrated that itraconazole treatment has protective effects on peritoneal fibrosis through regulating the Shh signaling. These findings suggest that the blockage of the Shh signaling pathway might be a potential therapeutic strategy for peritoneal fibrosis

소아 조혈모세포 이식에서 Cyclosporine과 Itraconazole의 약물상호작용 평가

高宗希 숙명여자대학교 임상약학대학원 2006 국내석사

Pharmacokinetic and pharmacodynamic drug interactions during concomitant intravenous administration of CsA and itraconazole in 26 pediatric hematopoietic stem cell tansplant recipients aged 1.1 years to 18.5 years (median 8.4 years). All the patients allocated into either CsA-ITRA group, in which CsA and itraconazole were concomitant administered or ITRA group, in which itraconazole was administered without CsA, CsA administration was started from the day before stem cell infusion at 3mg/kg per day by intravenous, then dose was titrated to a level of 150 to 250ng/mL. And itraconazole was administered from D+1 to D+2 at dose of 2.5mg/kg/ dose twice per day as a loading dose, then at dose 2.5mg/kg per day to D+14. Whole blood CsA trough concentrations were measured by radioimmunoassay(RIA) from regular blood sampling and plasma itraconazole and OH-itraconazole concentrations were measured by high performance liquid chromatography (HPLC) from blood samples taken on days D+2, +5, +7, +10 and +14. The first mean CsA steady state trough blood concentration (Sampling No.1) measured on D-0, before administration of itraconazole was 157.38 ng/ml (42-376 ng/ml), and then the second value was 268.94 ng/ml (126-696 ng/ml) from Sampling No.2, increasing significantly by 70% from the D-0 value. 17-67% of CsA dose reduction was made after itraconazole administration. On D+2 right after itraconazole loading dose was administered to pediatric HSCT recipients, the mean plasma trough concentrations of itraconazole and OH-itraconazole were 525.28±476.68 ng/ml and 742.68±710.40 ng/ml, while on D+7 the values were 324.24±299.55 ng/ml and 782.21±711.38 ng/ml, respectively. There was no significant difference between CsA-ITRA and ITRA groups regarding itraconazole and OH-itraconazole plasma trough concentrations measured up to D+14 This result could imply that the significant drug interactions occur within 2 days (48 hours) of intravenous administration of itraconazole and CsA to pediatric HSCT recipients and CsA administration did not affect plasma concentrations of itraconazole or OH-itraconazole. There was no significant correlation between aGVHD occurrence, renal toxicity, other CNS adverse events such as seizure, convulsion and itraconazole or OH-itraconazole plasma concentrations, except hypertension, headache and PRES in CsA-ITRA group. Focusing on liver toxicity and itraconazole infusion related GI adverse event like nausea and vomiting, there was no significant difference in regards to nausea and vomiting between the two groups and incidence of liver toxicity was significantly higher in CsA-ITRA group compared to ITRA group. There was significant correlation of nausea and vomiting, hypertension, headache, PRES to itraconazole and OH-itraconazole plasma concentrations. 목적: 고용량 화학요법 후 조혈모 세포이식을 받은 환자에게 GVHD(Graft Versus Host Disease)와 기회성 진균감염의 예방 및 치료의 목적으로 투여하는 cyclosporine(CsA)과 itraconazole의 약물 상호작용을 약물 혈중농도측정과 약효 유효성 및 부작용의 평가를 통해 고찰하고자 본 연구를 시행하였다. 대상 및 방법: 2004년 5월부터 2005년 12월까지 연세의료원 소아과에서 조혈모 세포이식을 시행 후 itraconazole을 단독 혹은 CsA과 병용 투여 받은 환자 26명을 대상으로 하였다. 여자 환자는 10명, 남자 환자는 16명 이었으며, 이들의 연령은 1.1-18.5세 (정중 8.4세)였다. 환자들은 CsA와 itraconazole을 함께 투여 받은 CsA-ITRA그룹과 itraconazole을 단독으로 투여 받은 ITRA그룹으로 나뉘었고, CsA는 조혈모세포 이식 당일 하루 전날부터 투여를 시작하였으며, 이식일 다음날부터 itraconazole 투여를 시작하였다. CsA을 함께 투여 받은 CsA-ITRA그룹에서 RIA (radioimmunoassay)방법을 통하여, 이식당일과 이후 일주일에 최소 2회, 혹은 CsA의 용량을 변경한 경우 각각 CsA의 혈중농도 측정을 반복하였다. 이와 함께 itraconazole투여 이후에 조절된 CsA 투여용량을 함께 측정하였다. 두 그룹 모두에서 Itraconazole은 HPLC (high performance liquid chromatography)방법을 통하여 2일간의 부화용량 투여 이후인 D+2를 시작으로 D+5, +7, +10 그리고 D+14에 혈중농도를 측정하였다. 약력학적 평가 항목으로 GVHD의 발생 유무, 발열의 유무 및 지속 기간, Candida antigen결과 혹은 진균 배양을 통한 기회성 진균감염발생을 평가하였으며, 약물에 의해 발생할 수 있는 부작용인 고혈압, 두통, 경련, PRES와 같은 중추신경계 부작용과 신독성, 간독성 및 itraconazole의 주입관련 부작용인 오심, 구토의 발생을 함께 측정하였다. 결과: Itraconazole의 투여를 전후로 CsA의 평균 혈중 trough 농도는 각각 157.38 ng/ml (42-376 ng/ml)와 268.94 ng/ml (126-696 ng/ml)로 측정되었으며, 통계학적으로 유의하게 70%의 상승률을 보였다. 이식 후 14일까지, 6명의 환자에게서 CsA의 용량 조절이 있었으며, 투여용량은 17-67% 범위로 감량되었다. 부하용량 투여 이후 측정된 itraconazole과 OH-itraconazole의 평균 혈중 trough 농도는 각각 433.88±478.56 ng/ml 과 747.20±790.47 ng/ml 이였으며, 이를 포함하여 D+14까지 측정된 itraconazole과 OH-itraconazole의 두 그룹간 평균 혈중 trough 농도차이는 CsA의 투여 유무에 따라 통계학적으로 유의하지 않았다. CsA-ITRA그룹에서 aGVHD 및 약물투여에 의한 중추신경계 부작용인 경련의 발생은 itraconazole 및 OH-itraconazole의 평균 혈중 trough 농도와 통계학적으로 유의한 연관성이 없었다. Candida antigen검사 및 진균 배양을 통한 진균감염의 결과 역시 두 그룹간의 차이가 없었으며, 이는 신독성 및 itraconazole투여에 의한 주입관련 부작용인 오심, 구토의 발생에서고 동일하였다. 간독성, CsA투여에 의한 부작용인 고혈압, 두통, PRES의 발생 및 itraconazole투여에 의한 주입관련 부작용인 오심, 구토가 발생한 환자들에게서 itraconazole 및 OH-itraconazole의 평균 혈중 trough 농도는 다른 환자들보다 통계학적으로 유의하게 높았다. 결론: CYP 3A4를 매개로 한 약물상호 작용으로 조혈모세포를 이식 받은 소아환자들에게서 itraconazole의 투여로 함께 투여되는 CsA의 대사가 저해되며, 혈중농도가 상승하는 것으로 고찰되었다. 조혈모세포 이식 전 처치와 다양한 약물의 투여로 CsA과 itraconazole의 약물 상호작용을 좀 더 정확하게 평가하는 것에 많은 어려움이 있지만, 본 연구의 결과를 바탕으로 조혈모세포 이식을 받는 소아환자들에게 두 약물의 병용 투여하는 경우, 약물의 적절한 유효성을 획득하고, 약물에 의한 부작용을 예방하기 위하여 CsA의 투여용량조절 및 적절한 약물 투여간격에 대한 적절한 가이드가 마련되어야 할 것이다.

폐이식 환자의 itraconazole과 voriconazole 투여 시 tacrolimus와의 상호작용 연구

정유진 연세대학교 대학원 2016 국내석사

본 연구는IAP 를 예방 또는 치료를 위해 항진균제를 투여 받는 폐이식 환자에서 itraconazole 또는 voriconazole처방 시 tacrolimus의 약물농도 변화를 비교하고, 이들과의 상호작용 정도를 확인하여 폐이식 환자의 tacrolimus의 농도변화 예측에 실마리를 제공함으로써 폐이식 환자에서 안전하고 효과적인 진균감염의 예방과 치료 약물요법 제안에 기여하고자 수행되었다. 2012년 9월 1일 ~ 2015년 5월 31일, 33개월 동안 연세대학교 세브란스병원에 입원한 전체 환자 중 Electronic medical record (EMR)에 폐이식 진단명(Z94.2)이 입력된 환자를 대상으로 후향적 관찰 연구를 진행하였다. Tacrolimus를 복용하는 폐이식 환자에게 입원 기간 동안 7일 이상 itraconazole 또는 voriconazole이 처방된 두 군으로 나누어, 항진균제 투여 기간 동안 환자의 체중과 하루 tacrolimus의 용량 대비 tacrolimus의 평균 혈중 농도를 1차 결과로 정하고, 총 tacrolimus의 혈중농도 검사 횟수 대비 목표 농도(5 ~ 15 ng/mL)를 벗어나는 tacrolimus의 혈중농도 결과 횟수 비율을 2차 결과로 분석하였다. Itraconazole 사용 환자군과 voriconazole 사용 환자군에서 tacrolimus의 일 평균 용량은 1.77 ± 1.03 mg/d vs. 2.39 ± 2.76 mg (p= 0.293), 환자의 체중 대비 tacrolimus 일 평균 용량 차이는 0.03 ± 0.02 mg/kg/d vs. 0.05 ± 0.06 mg/kg/d였다(p=0.281). Tacrolimus의 평균 혈중 농도는 10.49 ± 2.35 ng/mL vs. 10.95 ± 2.98 ng/mL 이었으며(p=0.456), 환자의 체중과 일 평균 용량 대비 tacrolimus 평균 혈중 농도는 472.14 ± 342.21 (ng/mL)/(mg/kg/d) vs. 767.60 ± 1209.65 (ng/mL)/(mg/kg/d) 였다(p=0.250). 총 tacrolimus 혈중농도 검사 횟수 대비 목표농도인 5 ~ 15 ng/mL 내인 백분율로 환산한 비율은 17.97 ± 13.33% vs. 24.40 ± 18.48% 였다(p=0.129). Tacrolimus를 투여 받는 폐이식 환자에게 itraconazole과 voriconazole 의 투여 기간 동안 환자의 체중과 하루 tacrolimus의 용량 대비 tacrolimus의 혈중 농도와 총 tacrolimus의 혈중농도 검사 횟수 대비 목표 농도(5 ~ 15 ng/mL)를 벗어나는 tacrolimus의 혈중농도 결과 횟수 비율은 통계적인 차이가 없었다. 하지만 voriconazole을 투여 받던 몇몇 환자들에게 특이점들이 발견되어 추후 대규모, 다기관의 전향적인 연구가 필요하며 tacrolimus 농도뿐만 아니라 voriconazole의 농도를 관찰함으로써 안전하고 효과적인 진균감염의 예방과 치료 약물요법이 이루어져야 한다. This study was performed to compare the changes in the blood concentrations of tacrolimus when either itraconazole or voriconazole is together with tacrolimus to prevent or treat IAP in patients with lung transplants. Therefore we can compare the degree of drug-drug interactions between tacrolimus and itraconazole against tacrolimus and voriconazole. Patients who were admitted at Yonsei University Severance Hospital and had lung transplants coded as ‘Z94.2’ on Electronic Medical Record from September 2012 to May 2015 were analyzed retrospectively. The patients were divided into two groups-one is tacrolimus with itraconazole and the other is tacrolimus with voriconazole. Patients who took itraconazole or voriconazole for at least 7 days during tacrolimus administration were included. The primary outcome was comparing the mean tacrolimus concentration over the dose of tacrolimus per kg of body weight per day ((ng/mL)/(mg/kg/d)) when co-administered with either itraconazole or voriconazole. The secondary outcome was comparing the ratio of the number of results when tacrolimus blood concentrations are out of the target ranges (5~15 ng/mL) to the total number of tacrolimus blood concentration results. Mean tacrolimus dose per day between itraconazole group vs. voriconazole group was 77 ± 1.03 mg/d vs. 2.39 ± 2.76 mg (p= 0.293), mean tacrolimus dose per weight per day was 0.03 ± 0.02 mg/kg/d vs. 0.05 ± 0.06 mg/kg/d (p=0.281). Mean tacrolimus concentration was 10.49 ± 2.35 ng/mL vs. 10.95 ± 2.98 ng/mL (p=0.456), mean concentration of tacrolimus over the dose of tacrolimus per weight per day was 472.14 ± 342.21 (ng/mL)/(mg/kg/d) vs. 767.60 ± 1209.65 (ng/mL)/(mg/kg/d)(p=0.250). The ratio ofthe number of the results out of target tacrolimus concentrations to the total number of tacrolimus concentration results was 17.97 ± 13.33% vs. 24.40 ± 18.48% (p=0.129). There were no significant differences between itraconzaole and voriconazole to have influences on mean concentrations of tacrolimus over tacrolimus dose per weight per day. However there were a few singularities in some patients taking voriconazole. Therefore, further study is necessary in order to perform a multicenter, large scale and prospective study. Safer and more effective drug management to prevent and treat fungal infections should be done by therapeutic drug monitoring not only of tacrolimus but of itraconazole and voriconazole in lung transplant patients.

초임계 이산화탄소를 이용한 난용성 약물 Itraconazole의 HP-β-CD와의 포접복합체에 관한 연구

김정규 水原大學校 大學院 2004 국내석사

친환경적인 초임계 유체 역용매 공정을 이용하여 itraconazole과 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin(HP-β-CD)의 포접 복합체를 형성하는 미세입자를 제조하였다. 난용성 약물인 itraconazole과 포접체 형성을 위한 HP-β-CD와의 몰비는 1:1~1:3의 범위에서 변화시켰으며, itraconazole과 HP-β-CD를 용해시킬 용매로 methylene chloride와 ethanol을 3:7 부피 비로 사용하였다. 반응기는 자체 제작한 것으로 실험온도 35~65℃, 실험압력 83~140bar의 압력조건에서 CO_(2)의 유속을 20 L/min, 용액의 투입유속을 0.5 mL/min으로 고정하여 수행하였다. 제조된 분체상태의 포접체 입자는 SEM을 이용하여 입자의 모양과 크기를 보았으며, DSC 및 XRD 분석을 통하여 고체상태 포접체의 특성분석을 하였다. 제조되어진 포접체는 HPLC를 이용하여 pH 1.2의 수용액 상에서 용해도 및 용출시험 제1법인 용출시험을 수행하였다. 용출시험은 대한약전에서 제시하는 회전검체통법에 준하여 37℃, 100rpm의 조건으로 정해진 시간에 용출 시험한 용액을 채취하여 HPLC 분석하여 용출 특성을 검토하였다. DSC 및 XRD를 통해 약물 itraconazole이 HP-β-CD와 포접체를 이루면서 원료물질 itraconaozole이 나타내는 10~30˚의 2θ 범위에서 예민한 itraconazole의 XRD 결정성피크와 168℃에서의 DSC 흡열피크가 모두 감소 또는 소멸되어, 포접체를 형성하지 못한 물리적 혼합물과는 달리 HP-β-CD와 매우 유사한 경향의 비정질의 포접체를 확인할 수 있었다. 단순 물리적인 혼합에 의해서는 일부 부서진 itraconazole의 입자가 HP-β-CD 표면상에 부착된 형상을 보인 반면, 초임계 공정으로 재결정한 입자는 크기가 대부분 50~100nm로 매우 작은 입자로 구성 되어짐을 확인할 수 있었다. pH 1.2 용액에서 itraconazole 원재료의 용해도가 3.7㎍/mL의 낮은 용해도를 나타낸데 비해 물리적 혼합물의 경우 67.4㎍/mL, SAS공정을 이용한 포접체의 경우에는 341.1㎍/mL까지 용해도를 보여 원재료 itraconazole보다 물리적 혼합물이 약 18배 SAS공정을 이용한 포접체의 경우 약 92배까지 용해도가 증가하였다. 또한, 포접율에서는 초임계 실험조건 35℃, 140bar에서 포접율이 가장 높게 나타났고, 포접율이 높은 실험조건일수록 용해도도 증가함을 알 수 있었다. Itraconazole과 HP-β-CD의 몰비 1:2 조건에서 초임계 실험조건 35℃ 140bar에서 가장 높은 용출율을 나타냈고, 몰비 변화를 주었을 때는 HP-β-CD의 몰비가 증가할수록 얻어진 분체의 수용액상에서의 용출율이 증가하였으며 itraconazole과 HP-β-CD의 몰비 1:3 초임계 실험조건에서 가장 높은 용출율을 보였다. 시판제제와 비교할 때, 초기시간 20분 동안의 용출율은 초임계 실험조건 35℃, 140bar 몰비 1:3의 용출율이 약 80%인데 반해, 시판제제의 용출율은 약 18% 정도로 나타나, 수용액상에서 매우 낮은 용출율을 나타내는 난용성물질인 itraconazole을 초임계 공정을 통하여 HP-β-CD와 효율적으로 포접체를 이루어 용출율이 향상되었음을 확인할 수 있었으며, 기존의 시간소비성 다단계의 포접공정을 대체할 수 있음을 확인할 수 있었다. Microparticles of an inclusion complex of itraconazole and 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin(HP-β-CD) were prepared using an environmentally-benign supercritical anti-solvent (SAS) process. The molar ratio of itraconazole and HP-β-CD varied in a range of 1:1~1:3 for complexation. Methylene chloride and ethanol of 3:7 volume ratio were used to dissolve itraconazole and HP-β-CD simultaneously. The effects of process conditions on the complexation were investigated in the temperature range of 35~65℃, at pressures ranging from 83 to 140 bar, at CO_(2) flow rate of 20 L/min, and at solution flow rate of 0.5 mL/min for our SAS process reactor. In order to evaluate the degree of complexation, the thermal behavior of solid microparticulate complexes was investigated using differential scanning calorimetry. The shape and size of the complexes were examined using scanning electron microscopy. The solubility of microparticulate complexes was investigated in a buffer solution of pH 1.2 using high performance liquid chromatography. Their dissolution rates were obtained through HPLC assay of sample solutions at 37℃ and 100 rpm in a buffer solution of pH 1.2 using basket method, which is standardized in Korean pharmacopoeia. The decrease or disappearance of the crystalline peaks(10˚~30˚) and exothermic peak(168℃) of itraconazole confirmed the inclusion complexation of itraconazole with HP-β-CD. In physical mixtures, itraconazole particles were found to adsorb on the surface of HP-β-CD. On the other hand, the SAS processed microparticles were observed to have small sizes of 50-100nm. The solubility of the untreated itraconazole and the physical mixture of itraconazole/HP-β-CD are 3.7 ㎍/mL and 67.4 ㎍/mL, respectively, in a buffer solution of pH 1.2. However, the SAS-processed microparticles showed higher values of solubility up to 341.1 ㎍/mL. The enhancement of drug solubility by SAS processing amounted to 92 times that of raw itraconazole material. The complexation ratio and in water solubility increased with increasing pressure and CO_(2) density at a constant temperature. Furthermore, the enhancement in water solubility appeared with the increase of temperature at a constant CO_(2) density of 0.5g/㎤. The highest complexation and solubility were obtained for a SAS sample produced at 35℃ and 140 bar. For different molar ratios of itracconazole/HP-β-CD, the solubility and dissolution rate in an aqueous medium were found to increase with HP-β-CD content. The highest solubility and dissolution rate were observed for 1:3 molar ratio at 35℃ and 140 bar Compared with on-the-market product, the initial dissolution rate of our SAS-processed samples was about 80%, while the dissolution rate of the commercially available drug is about 18% in initial 20 minutes. Our experimental results confirmed that the SAS process is a promising alternative to conventional multi-step process for the preparation of inclusion complexes of water-insoluble drug and cyclodextrin.

Inhibitory effect of itraconazole on laser-induced choroidal neovascularization in rats

배정훈 Graduate School, Yonsei University 2016 국내박사

나이관련 황반변성은 선진국의 노인 인구에서 실명을 유발하는 주요 질환이며, 맥락막신생혈관(choroidal neovascularization, CNV)은 나이관련 황반변성 환자에서 심한 시력 저하를 일으키는 가장 흔한 원인이다. 레이저광응고술, 광역학요법, 그리고 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF) 억제 약물의 유리체내 주사와 같은 기존의 치료법은 시력의 향상에 있어 그 효과가 제한적이다. 대부분의 환자들은 재발로 인한 반복적인 치료를 받게 되는데, 다수의 유리체내 주사는 심각한 합병증을 유발할 수 있으며, 치료 비용도 많은 부담이 된다. 이트라코나졸은 상대적으로 안전한 항진균제이며, 항혈관신생 효과를 가지고 있다. 최근의 연구에 의하면, 이트라코나졸은 설치류 실험과 인간의 내피세포를 이용한 in vitro 실험에서 종양 연관 혈관신생을 강하고, 선택적으로 억제하는 것으로 나타나, 임상적으로 병적인 신생혈관을 치료하는 데 효과가 있을 것으로 생각된다. 이에 본 연구에서는 쥐에서 레이저로 유도된 CNV에 대한 이트라코나졸의 항혈관신생 효과에 대해 알아보고자 하였다. CNV를 유도하기 위해 수컷 Brown Norway rat의 양안 시신경 주위에 6개의 레이저 응고반을 만든 뒤 우안에는 1 μg/10 μl의 이트라코나졸, 좌안에는 동일한 양의 balanced salt solution (BSS)을 유리체내로 주입하였다. 레이저유도 14일 후, 비정상적인 혈관 누출을 조사하기 위해 형광안저혈관조영술을 시행하였고, CNV의 크기를 비교하기 위해 망막색소상피-맥락막 조직을 Alexa Fluor 488-conjugated isolectin B4를 이용하여 염색한 후 형광현미경으로 관찰하였다. RT-PCR과 Western blot을 통해 VEGF 수용체 2의 mRNA와 단백질, Akt와 ERK의 인산화에 대해 분석하였고, 망막 내의 VEGF 농도 측정을 위해 ELISA를 시행하였다. 유리체내 이트라코나졸은 BSS 투여군에 비해 CNV의 혈관누출과 크기를 유의하게 감소시켰다 (P = 0.002 for CNV 누출, P < 0.001 for CNV 크기). 또한, RT-PCR에서 이트라코나졸을 투여한 눈의 VEGF 수용체 2의 mRNA 발현이 BSS를 투여한 눈보다 유의하게 낮게 나타났고 (P < 0.001), Western blot에서는 레이저유도 14일 후 이트라코나졸을 투여한 눈에서 VEGF 수용체 2의 감소가 두드러졌다. ELISA를 이용하여 측정한 VEGF의 농도를 보면 이트라코나졸 투여군에서 801.7 ± 187.5 pg/mg으로 BSS 투여군의 988.0 ± 232.8 pg/mg 보다 유의하게 낮게 나타났다 (P = 0.043). 하지만, 레이저유도 14일 후 측정한 Akt와 ERK의 인산화는 두 군간에 유의한 차이를 보이지 않았다 (P = 0.258 for p-Akt, P = 0.730 for p-ERK). 본 연구에서 유리체내 이트라코나졸은 쥐에서 레이저로 유도된 CNV의 생성을 유의하게 억제하였으며, 이러한 항혈관신생 효과는 VEGF 수용체 2의 감소와 VEGF의 활성 억제를 통해 이루어지는 것으로 보인다. 즉, 이트라코나졸은 CNV의 치료에 적절한 대안이 될 수 있으며, 다른 치료와 병행하여 부가적인 치료법으로서도 활용 가능할 것으로 기대된다. Age-related macular degeneration (AMD) is the leading cause of blindness in older people in developed countries. Severe vision loss in patients with AMD is commonly due to choroidal neovascularization (CNV). Current CNV treatments, such as laser photocoagulation, photodynamic therapy, and intravitreal injection of anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) drugs, have limited efficacy in improving vision. Patients often require repeated treatment because of recurrence. Multiple intraocular injections are associated with serious complications and high treatment costs. Itraconazole, a relatively safe antifungal drug, has anti-angiogenic effects. In recent studies, itraconazole showed potent and selective inhibition of tumor-associated angiogenesis in murine models and in vitro assays using human endothelial cells. Itraconazole dose-dependently inhibited angiogenesis, suggesting it may be useful in treating pathological angiogenesis. The aim of this study was to evaluate the anti-angiogenic effect of itraconazole on laser-induced CNV in rats. Six laser burns were induced in the peripapillary area of each eye of male, adult Brown Norway rats (200-250 g) to cause CNV. Right eyes were administered intravitreal injections of 1 μg/10 μl itraconazole; left eyes received 10 μl balanced salt solution (BSS) as controls. On day 14 after laser induction, fluorescein angiography (FA) was used to assess abnormal vascular leakage. Flattened retinal pigment epithelium (RPE)-choroid tissue complex was stained with Alexa Fluor 488-conjugated isolectin B4 to measure the CNV areas with an image analysis program. VEGF receptor 2 (VEGFR2) mRNA and protein expression and phosphorylation of Akt and ERK were determined by quantitative RT-PCR or Western blot. The VEGF concentration in the retina was analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Intravitreal itraconazole significantly reduced leakage from CNV as assessed by FA and CNV area on flat mounts of the RPE-choroid complex when compared with intravitreal BSS on day 14 after laser induction (P = 0.002 for CNV leakage, P < 0.001 for CNV area). Quantitative RT-PCR showed significantly lower expression of VEGFR2 mRNA in RPE-choroid complexes from itraconazole-injected eyes than from BSS-injected eyes (P < 0.001). Western blots indicated that VEGFR2 was downregulated after 14 days of itraconazole treatment. ELISA assay showed a significant difference in VEGF concentration between itraconazole- and BSS-injected eyes (801.7 ± 187.5 vs. 988.0 ± 232.8 pg/mg total protein; P = 0.043). However, phosphorylation of Akt and ERK showed no significant differences between groups at day 14 after laser induction (P = 0.258 for p-Akt, P = 0.730 for p-ERK). In conclusion, this study demonstrated that intravitreal itraconazole significantly inhibited the development of laser-induced CNV in rats. Itraconazole had anti-angiogenic activity by reducing VEGFR2 expression and inhibiting VEGF activity. Itraconazole may prove beneficial for treating CNV as an alternative or adjunct to other therapies.

Prediction of CYP3A mediated drug-drug interaction using the endogenous metabolic markers and physiologically based pharmacokinetic model

이소영 서울대학교 대학원 2021 국내박사

Introduction: Cytochrome P450 3A (CYP3A) is a phase I drug-metabolizing enzyme that accounts for the metabolism of drugs and endogenous substances in the gut and liver. By developing biomarkers for CYP3A activity, it is possible to predict new drug entities’ potential of modulating CYP3A activity in the early clinical stage. Because, previously identified markers were only evaluated for hepatic CYP3A activity with midazolam probe, identifying whether it reflects intestinal CYP3A activity and assessing in other CYP3A-mediated drug-drug interaction (DDI) will enhance the utility of the CYP3A markers. Physiologically based pharmacokinetic (PBPK) model is one of the emerging tools to predict pharmacokinetic (PK) changes considering the mechanism underlying physiology and drug interaction quantitatively. It allows not only to predict potential PK differences in various CYP3A activities and disease states, but also to estimate CYP3A inhibition on various DDI scenarios. Therefore, the study aimed to evaluate whether endogenous CYP3A activity reflects intestinal CYP3A activity, and assess whether those markers predict DDI between other CYP3A substrate (sildenafil) and two inhibitors with a different mechanism of CYP3A suppression. We further developed a PBPK model to simulate clinical trials to interpret the DDI results comprehensively with multidirectional approaches involving PK, endogenous metabolic marker, PBPK modeling. Methods: To evaluate endogenous metabolites for assessing intestinal CYP3A activity, an open-label, three-period, six-treatment, one-sequence clinical trial was performed in 16 healthy Korean males. In the control phase, all subjects received a single dose of intravenous (IV) and oral midazolam (1 mg and 5 mg, respectively). Clarithromycin (500 mg) was administered twice daily for 4 days to inhibit hepatic and intestinal CYP3A, and 500 mL of grapefruit juice was given to inhibit intestinal CYP3A. To assess utility of markers in other CYP3A-mediated DDI, an open-label, one-sequence, one-period, two-treatment parallel study was conducted in 32 healthy Korean subjects. Each of 16 subjects were randomly assigned to the clarithromycin and itraconazole groups. Both groups received a single dose of sildenafil 25 mg as a control, and either clarithromycin 250 mg or itraconazole 100 mg was administered four times to inhibit CYP3A activity. Full PBPK models of CYP3A substrate (sildenafil, N-desmethyl sildenafil) and CYP3A inhibitor (clarithromycin, itraconazole) were constructed using physiological parameters including in-vitro, in-vivo study results from literature and several parameters were estimated using clinical studies results. The virtual clinical trial was simulated with the same observed DDI schedule using the final model. Results: In the midazolam study, clarithromycin significantly inhibited total CYP3A activity, and the clearance of IV and apparent clearance of oral midazolam decreased by 0.15- and 0.32-fold, respectively. Grapefruit juice only reduced the apparent clearance of oral midazolam by 0.84-fold, which indicates a slight inhibition of intestinal CYP3A activity. Urinary markers, including 6β-OH-cortisol/cortisol and 6β-OH-cortisone/cortisone, were significantly decreased 0.5-fold after clarithromycin administration but not after grapefruit juice. The fold changes in 6β-OH-cortisol/cortisol and 6β-OH-cortisone/cortisone did not correlate to changes in intestinal availability but did correlate to hepatic availability. In the DDI study, pharmacokinetics of sildenafil showed the similar magnitude of inhibitory effects of the two inhibitors (clarithromycin and itraconazole) on total CYP3A activity; both inhibitors similarly increased systemic exposure of sildenafil by 2-fold. Urinary 6β-OH-cortisone/cortisone and plasma 4β-OH-cholesterol were significantly decreased after clarithromycin administration but not after itraconazole. A significant correlation between sildenafil CL/F and metabolic markers of CYP3A activity was observed after clarithromycin administration. The constructed PBPK model of sildenafil, N-desmethyl sildenafil, clarithromycin, itraconazole was well predict the observed DDI scenario. Although predicted maximum hepatic intrinsic clearance (CLint) of sildenafil was more reduced by itraconazole, CLint was highly fluctuated compared to clarithromycin. Moreover, the median fraction metabolized by liver CYP3A4 in relation to systemic clearance of sildenafil was decreased approximately 16% after clarithromycin, while only 6% after itraconazole. The p-gp mediated CLint of sildenafil and Ki of p-gp for clarithromycin and itraconazole have no impact on AUC of sildenafil after concomitant administration of either clarithromycin or itraconazole. Conclusions: Our results suggest the limitation of steroid-based endogenous markers because these markers are not feasible to predict intestinal CYP3A activities. The DDI study between sildenafil with clarithromycin and itraconazole, suggested that those endogenous metabolic markers well reflected the mechanism-based CYP3A inhibition of clarithromycin but not for competitive CYP3A inhibition of itraconazole. The PBPK model confirmed that the observed pharmacokinetic interactions between sildenafil and CYP3A inhibitors were not due to transporter-mediated interaction. The endogenous metabolic markers may be utilized to predict potential hepatic CYP3A inhibition with moderate to strong alteration, but there are limitations in predicting intestinal CYP3A mediated DDI. The PBPK model is useful to predict and interpret observed DDI results with underlying mechanistic understanding. 서론: Cytochrome P450 3A (CYP3A)는 간과 장에서 약물 및 내인성 물질 대사에 관여하는 phase I 약물 대사 효소이다. CYP3A 활성에 대한 바이오마커를 개발한다면, 초기 임상 단계에서 개발하는 약물이 잠재적으로 CYP3A 활성을 변화시키는지 예측할 수 있다. 이전에 확인된 마커들은 midazolam을 이용하여 간의 CYP3A 활성에 대해서만 평가되었기 때문에, 본 연구에서는 이들 마커가 장의 CYP3A 활성도 반영하는지 확인하고, 다른 CYP3A 매개 약물-약물상호작용을 평가하는데 유용한지 확인하고자 하였다. 생리학 기반 약물동태 모델링(PBPK)은 기전적으로 생리학 및 약물의 상호작용을 고려하여 약물의 약동학 변화를 정량적으로 예측할 수 있는 도구 중 하나이다. 이 방법을 이용하면 다양한 CYP3A 활성 및 질환 상태 뿐만 아니라 다양한 약물-약물 상호작용 시나리오에서 잠재적인 약동학 차이를 예측할 수 있다. 따라서 본 연구에서는 내인성 대사체 마커가 장의 CYP3A 활성을 반영하는지 평가하고, 이들 마커가 CYP3A의 기질인 sildenafil과 서로 다른 CYP3A 억제 기전을 갖는 두 개의 CYP3A 저해제를 병용한 약물-약물 상호작용을 예측하는지 확인하고자 한다. 또한 PBPK 모델을 이용하여 약물-약물 상호작용 임상시험 결과를 복합적으로 해석하고자 하였다. 방법: 내인성 대사체 마커가 장 CYP3A 활성을 반영하는지 평가하기 위해, 공개, 3군, 6치료군, 1 순서군 임상시험을 16명의 건강한 한국인 남성에서 수행하였다. 대조군에 모든 대상자는 정맥주사 (IV) 및 경구 midazolam (각각 1 mg 및 5 mg)을 단회 투여 받았다. Clarithromycin 500 mg은 1일 2회 용법으로 4일간 투여하여 간 및 장 CYP3A 활성을 억제하였고, 500 mL의 자몽주스를 투여하여 장 CYP3A 활성만 억제하였다. CYP3A 매개 약물-약물 상호작용을 예측하는데 마커들이 유용한지 확인하기 위하여, 공개, 2치료군, 1 순서군, 평행 설계 임상시험을 32명의 건강한 한국인 남성에서 수행하였다. 각 16명 씩 무작위로 clarithromycin 그룹과 itraconazole 그룹에 배정되었다. 두 그룹은 모두 대조군으로 sildenafil 25 mg을 단회 투여 받았고, CYP3A 활성을 억제하기 위해 그룹에 따라 clarithromycin 250 mg 또는 itraconazole 100 mg 을 4회 투여 받았다. CYP3A 기질인 sildenafil과 CYP3A 저해제인 clarithromycin, itraconazole에 대하여 문헌의 in-vitro, in-vivo 연구 결과를 포함한 생리학적 파라미터를 이용하여 PBPK 모델을 구축하였고, 일부 파라미터들은 임상시험 결과들을 이용하여 추정하였다. 최종 모델을 이용하여 관찰된 약물-약물상호작용 연구와 동일한 일정의 가상의 임상시험을 시뮬레이션 하였다. 결과: midazolam을 이용한 연구에서 clarithromycin은 전체 CYP3A 활성을 유의하게 억제하였고, IV 및 경구 투여 시 midazolam의 청소율은 각각 0. 15배, 0.32배 감소하였다. 자몽주스는 midazolam의 겉보기 청소율만 0.84 배 감소시켜, 장 CYP3A 활성을 약하게 감소시킨 것을 확인하였다. 소변 마커인 6β-OH-cortisol/cortisol 및 6β-OH-cortisone/cortisone은 clarithromycin 투여 후 유의하게 0.5 배 감소하였으나, 자몽주스 투여 후 변화하지 않았다. 6β-OH-cortisol/cortisol 및 6β-OH-cortisone/cortisone의 변화 정도는 장 생체이용률과 상관관계를 보이지 않았으나, 간 생체이용률과는 상관관계를 보였다. 약물-약물 상호작용 연구에서 sildenafil의 약동학은 두개의 CYP3A 저해제 (clarithromycin, itraconazole) 병용 투여 후 비슷하게 변화하여 두 CYP3A 저해제는 유사한 정도로 CYP3A를 억제하였다. 두 저해제는 sildenafil의 전신 노출을 유사하게 2배 가량 증가하였고, 소변 6β-OH-cortisone/cortisone 및 혈장 4β-OH-cholesterol 은 clarithromycin 투여 후에만 유의하게 감소하였다. Sildenafil의 겉보기 청소율과 CYP3A 활성에 대한 대사체 마커 간에는 clarithromycin 그룹에서만 유의한 상관관계를 확인하였다. 예측된 sildenafil의 최대 간 고유 청소율(CLint)은 itraconazole 투여 후 더 감소하였지만, clarithromycin에 비해 CLint의 변화율이 매우 컸다. 또한, sildenafil의 systemic clearance와 관련하여 간 CYP3A4에 의해 대사되는 비율은 clarithromycin 투여 후 약 16% 감소한 반면, itraconazole 투여 후 에는 약 6%만 감소하였다. Sildenafil의 p-gp 매개 CLint 및 clarithromycin 및 itraconazole의 p-gp에 대한 Ki 값은 clarithromycin 또는 itraconazole 투여 후 sildenafil의 AUC에 영향을 미치지 않았다. 결론: 본 연구에서는 스테로이드 기반 내인성 대사체 마커가 장 CYP3A 활성을 예측하는 것에 한계점이 있음을 확인하였다. Sildenafil과 clarithromycin 및 itraconazole 간의 약물-약물 상호작용 결과를 통해, 내인성 대사체 마커가 clarithromycin과 같은 mechanism 기반 CYP3A 억제에는 잘 예측하지만 itraconazole 과 같은 경쟁적 CYP3A 억제시에는 잘 예측하지 못하는 것을 확인하였다. PBPK 모델을 이용하여 관찰된 sildenafil과 CYP3A 억제제 간의 약동학적 상호작용이 수송체 매개 상호작용에 의한 것은 아님을 확인하였다. 본 내인성 대사 마커들을 이용하여 잠재적으로 간 CYP3A 활성에 중등도에서 강하게 영향을 주는 약물에 대해서 예측하도록 활용할 수 있으나, 장 CYP3A 매개 약물-약물 상호작용에 대한 예측력에는 한계를 가진다. PBPK 모델은 기전적인 이해를 통해 관찰된 DDI 결과를 해석하고 예측하는데 활용 할 수 있다.

Enhanced transdermal delivery of donepezil by fatty acids and enhanced topical delivery of itraconazole using polymeric micelles

최준호 서울대학교 대학원 2012 국내박사

피부를 통한 약물 흡수는 간에서의 초회통과효과를 회피하며 위장관 부작용을 없애고, 장시간 투여할 수 있으며, 부작용이 나타나면 즉시 투여를 중지할 수 있다는 장점이 있다. 그러나, 피부는 몸 안으로 이물이 침입하는 것을 방지하는 장벽의 역할을 하므로, 약물의 피부 투과성은 경피 투여를 목적으로 하는 약물 전달시스템 개발에 있어서 중요한 인자가 되며, 약물의 피부 투과성을 개선하기 위한 흡수 촉진제 또는 약물 전달체에 대한 다양한 연구가 수행되고 있다. 본 연구에서는 도네페질 경피흡수에 미치는 흡수 촉진제인 지방산(Part Ⅰ)의 영향과 이트라코나졸의 국소적용에 미치는 고분자미셀(Part Ⅱ) 제형의 영향을 평가하고자 하였다. Part Ⅰ. Effect of fatty acids on the transdermal delivery of donepezil: in vitro and in vivo evaluation 본 연구는 알츠하이머 치료제인 도네페질(DP)의 경피흡수에 미치는 도네페질의 물성 (즉, free base form: DPB, 염산염: DPH)과 지방산의 영향 (즉, 사슬의 길이, 이중결합 수, 지방산의 농도)을 평가하고자 하였다. DPB와 DPH를 1 퍼센트(w/v)의 지방산을 함유한 propylene glycol에 가용화시킨 후, hairless mouse와 human cadaver skin을 이용하여 피부 투과 실험을 수행하였다. 실험 결과, hairless mouse의 피부를 투과하는 DP의 경피흡수속도는 염 형성 유무와 상관없이 지방산의 탄소 길이가 증가함에 따라 포물선의 관계를 나타냈다. 지방산의 이중결합 수와 농도의 영향에 대한 실험결과를 종합하여 평가하였을 때, DPB에는 oleic acid, DPH에는 palmitoleic acid가 경피흡수 촉진 효과가 가장 우수한 것으로 나타났다. 또한, human cadaver skin에서 평가한 DPB와 DPH의 경피흡수속도는 hairless mouse skin에서 평가한 값과 좋은 상관관계를 나타냈다. in vitro 실험결과에 근거하여, DPB 경우, 1% (w/v)의 oleic acid를, DPH의 경우는 1% (w/v)의 palmotoleic acid를 포함하는 처방에 대하여 in vivo 동물실험을 수행하였다. Rat 의 복부 피부에 각각의 DP 제형을 투여했을 때, oleic acid를 사용한 DPB 처방에서 52.21±2.09 ng/mL의 최고혈중농도를 보이며, 48시간 동안 정상상태의 혈중농도를 유지하였다. 이러한 결과는 지방산이 DP의 경피흡수를 증진시키며, 임상을 목적으로 한 새로운 경피흡수제제가 개발될 수 있는 가능성을 시사하였다. Part Ⅱ. Preparation and characterization of polymeric micelles for topical delivery of itraconazole 본 연구의 목적은 이트라코나졸의 경피흡수 전달체로서 amphiphilic copolymer인 PEO-PCL-PEO와 PEO-PPO-PEO를 평가하는 것이다. Chain length에 따른 4개의 다른 PEO-PCL-PEO와, Poloxamer 188인 PEO-PPO-PEO를 사용하여 고분자미셀을 제조하였고, 미셀 크기와 약물함량, 봉입효율, 방출 거동 및 경피흡수를 평가하였다. Amphiphilic copolymer는 0.014~0.040wt% 범위의 낮은 CMC 값을 보이며 효율적으로 미셀을 형성하였다. Tween-80은 이트라코나졸이 봉입된 고분자미셀의 크기와 봉입효율 및 약물함량을 각각 1.38~1.64배, 2.02~2.70배, 1.86~2.35배 유의적으로 증가시켰다. 또한, PEO-PCL-PEO 미셀의 경우, CL/EO 비율이 증가함에 따라 미셀 크기와 봉입효율 및 약물함량이 함께 증가하는 경향을 보였다. PEO-PCL-PEO 미셀에서 이트라코나졸의 방출속도와 방출량은 CL/EO 비율이 감소함에 따라 증가하였다. 이는 PEO-PCL-PEO 미셀에서 CL/EO 비율이 증가함에 따라 소수성 약물인 이트라코나졸과 고분자 미셀의 hydrophobic core 간의 상호작용이 증가하기 때문일 것으로 생각된다. 이러한 결과들은 고분자미셀이 이트라코나졸을 봉입하고, 방출을 조절하며, 피부로 흡수를 용이케 한다는 것을 시사하였다. There has been an increased interest in the drug administration via the skin for both local therapeutic effects on diseased skin (topical delivery) as well as for systemic effect (transdermal delivery). The skin as a site of drug delivery has a number of significant advantages over many other routes of drug administration, including the ability to avoid hepatic first-pass metabolism and gastrointestinal drug absorption difficulties, provide a sustained release of drug at the site of application and rapid termination of drug effect by removal of the application. Because the outer most layer of skin acts as a barrier preventing toxic chemical and other materials from penetrating deeper into the skin, skin permeability is an important factor in the development of drug delivery systems via skin. Therefore, numerous attempts have been made for assessing the effect of penetration enhancers and carrier/vesicle based approaches. The objective of this study was to assess the effect of fatty acids as a penetration enhancer on the transdermal delivery of donepezil (Part Ⅰ) and the effect of polymeric micelles as a carrier/vesicle based approach on the topical delivery of itraconazole (Part Ⅱ). Part Ⅰ. Effect of fatty acids on the transdermal delivery of donepezil: in vitro and in vivo evaluation The effect of fatty acids on the skin permeation of donepezil base (DPB) and its hydrochloride salt (DPH) were studied in vitro using hairless mouse and human cadaver skin. DPB and DPH were solubilized in propylene glycol (PG) containing 1% (w/v) fatty acid, after which the in vitro permeation through hairless mouse skin and human cadaver skin were evaluated using Keshary-Chien diffusion cells. The optimized formulation obtained from the in vitro study was then tested in rats for an in vivo pharmacokinetic study. The relative in vitro skin permeation rate of donepezil (DP) through the hairless mouse skin showed a parabolic relationship with increased carbon length of the fatty acid enhancers. Among the fatty acids tested, oleic acid for DPB and palmitoleic acid for DPH showed the highest enhancing effect, respectively. Both the permeation rates of DPB and DPH evaluated in human cadaver skin were in good correlation with those in hairless mouse skin, regardless of the presence of fatty acids. This suggests that the mouse skin model serves as a useful in vitro system that satisfactorily represents the characteristics of the human skin. Moreover, based on the in vitro results, the optimal formulation that could maintain the human plasma concentration of 50 ng/mL was determined to be 10 mg DP with 1% (w/v) enhancer. When the DP transdermal formulations were applied to the abdominal skin of rats (2.14 cm2), the Css was maintained for 48 h, among which the highest value of 52.21±2.09 ng/mL was achieved with the DPB formulation using oleic acid. These results showed that fatty acids could enhance the transdermal delivery of DP and suggested the feasibility of developing a novel transdermal delivery system for clinical use. Part Ⅱ. Preparation and characterization of polymeric micelles for topical delivery of itraconazole The aim of this study is to evaluate the capability of a series of amphiphilic copolymers (PEO-PCL-PEO and PEO-PPO-PEO) as a carrier for enhancing skin absorption of itraconazole. Four different PEO-PCL-PEO polymers with various chain lengths and Poloxamer 188 (i.e., PEO-PPO-PEO) were used. Micelle formulations were evaluated by their size, encapsulation efficiency (EE), loading content (LC), release behavior, and skin permeation/deposition profiles. It was shown that these amphiphilic copolymers efficiently form micelles with a low CMC value in the range of 0.014~0.040% (w/w). In presence of Tween-80, itraconazole loading into the triblock copolymer micelles showed a dramatic increase in their size (1.38~1.64-fold), EE (2.02~2.70-fold) and LC (1.86~2.35-fold), respectively. Moreover, an increasing trend in the particle size, EE, and LC of the PEO-PCL-PEO micelles was observed with the increase of CL/EO ratio. In vitro release rate and amount of itraconazole from PEO-PCL-PEO micelles decreased as the CL/EO ratio increased, probably due to the higher interaction between hydrophobic itraconazole and hydrophobic core of micelles. Moreover, in vitro skin permeation and deposition of itraconazole also decreased with the increase in CL/EO ratio. These results showed that polymeric micelles composed of amphiphilic PEO-PCL-PEO copolymers significantly increased skin permeation and deposition of itraconazole, and thus could be a useful carrier of topical delivery of itraconazole.

The Characterization of the insA gene encoding INSIG a component of the ergosterol dependent oxygen-sensing pathway in Aspergillus nidulans : Aspergillus nidulans에서 ergosterol 의존적 산소인식 경로의 구성성분인 INSIG를 암호화하는 insA의 기능 분석

친바야 배재대학교 대학원 2008 국내석사

Mammal에서 콜레스테롤과 지방산 합성은 막에 결합되어 있는 전사인자인 SREBPs (Sterol Regulatory Element Binding Proteins)에 의해서 조절된다. SREBPs의 활성화는 세포내의 스테롤농도에 의해 조절된다. SREBP는 합성된 후 즉시 SCAP (SREBP Cleavage-Activating Protein)과 결합한다. SCAP은 스테롤 인식 부위를 지니는 막 단백질로서 SREBP와 INSIG(Insulin-Induced Gene)와 결합한다. 스테롤의 고갈은 SCAP의 구조적 변화를 일으켜 INSIG에서 SCAP의 분리를 유도한다. SREBP와 SCAP의 결합체는 ER에서 Golgi로 이동하고 SREBP는 protease 1과 2에 의해 잘리게 되는데, 잘려진 SREBP의 N-terminal 부분은 핵으로 들어가 lipid 합성에 필요한 유전자들의 발현을 유도하게 된다. 그러나 스테롤이 축척되게 되면 스테롤과 결합된 SCAP은 INSIG와 결합하게 되고 SREBP는 ER에 머물게 된다. Schizosaccharomyces pombe의 ergosterol 합성에 관련된 연구를 보면 mammalian의 SREBP pathway와 유사한 경로에 의해 작용함을 알 수 있다. 또한 이러한 시스템은 ergosterol합성에서 뿐만 아니라 산소 인식과 저산소에서 유도되는 유전자의 발현을 위해서도 필요함을 알 수 있다. SREBP와 이의 negative 조절자인 INSIG의 유사 단백질을 Aspergillus nidulans에서 찾을 수 있었으며, 이는 각각 hitA와 insA라 밝혀졌다. 선행 연구에서 hitA가 ergosterol 합성과 저 산소 조건에서 성장하는데 있어 필수적인 유전자임을 확인한 바 있다. hitA null mutant는 저산소 조건(1% 02)에서 성장하지 못하며, ergosterol 합성에 수반되는 lanosterol 14-alpha demethylase의 억제물질인 itraconazole에 민감성을 보였다. 본 연구에서는 mammalian INSIG의 A. nidulans homolog인 insA를 cloning하여 분석하였다. InsA와 human INSIG의 아미노산 유사성은 높으며, insA null mutant는 일반적인 산소 조건이나 저산소 조건에서 야생주와 다른 표현형을 보이지 않았다. 반면 alcA promoter조절 하에 InsA를 과대발현시키면 itraconazole에 높은 민감성을 보이는데 이는 HitA의 활성이 억제되고 있음을 의미한다. 이러한 InsA 과대발현 균주에서 itraconazole 민감성은 HitA와 HitA N-terminal region을 각각 InsA와 동시에 과대발현 시켰을 때 회복되는 것을 확인할 수 있었다. 반면 HitA C-terminal region은 InsA와 동시에 과대발현을 시켜도 itraconazole에서 야생주처럼 회복되지 않았다. 저산소 조건과 itraconazole를 처리했을 시 hitA의 발현은 상당히 증가하는 반면, insA의 발현은 감소하는 것을 확인하였다. 반면 InsA의 과대발현 시에 hitA의 발현이 억제되는 것을 알 수 있었다. 나아가 insA null mutant에서 hitA의 발현이 공기 중에서나 저산소 조건 시에서 동일한 발현정도를 나타내어 변화를 보이지 않음을 Northern 분석을 통해 확인 할 수 있었다. 이러한 결과는 InsA가 mammal에서와 유사하게 HitA의 활성에 negative하게 작용함을 의미한다. 더불어 A. nidulans에서 HitA 단백질은 hitA 유전자의 발현에 있어 자가조절 (auto-regulation)을 할 것이라 예상할 수 있다. Cholesterol and fatty acid synthesis in mammals are controlled by Sterol Regulatory Element Binding Proteins (SREBPs), a family of membrane-tethered transcription factors. Activation of SREBPs is regulated by sterol concentration within the cell. SREBP interacts with SREBP Cleavage-Activating Protein (SCAP), immediately after synthesized. SCAP is a membrane protein containing the sterol-sensing domain and associated with SREBP and Insulin-Induced Gene (INSIG). Sterol depletion caused conformational change of SCAP resulting to dissociation of SCAP from INSIG. Then, SREBP-SCAP complex moves from endoplasmic reticulum (ER) to golgi, where SREBP was cleaved by site-specific protease 1 and 2. The cleaved N-terminus of SREBP is translocated to the nucleus and activates genes which are necessary in lipid biosynthesis. If sterol is accumulated, the sterol-bound SCAP forms a tight complex with endoplasmic resident protein INSIG, so that SREBP stays in ER. The studies identified that ergosterol synthesis of Schizosaccharomyces pombe but not in S. cerevisiase is also regulated by a mammalian SREBP pathway like regulatory system. Moreover this system is not only responsible for ergosterol synthesis but also necessary for oxygen sensing and hypoxic gene expressions. The homologs of the mammalian SREBP-1 and its negative regulator INSIG-1 were also found in a genetic model organism Aspergillus nidulans, and named hitA and insA, respectively. Our previous study determined that hitA is essential for both ergosterol synthesis and hypoxic growth. hitA null mutant did not grow in hypoxic environment (1% O2) and exhibited high sensitivity to itraconazole, an inhibitor of lanosterol 14-alpha demethylase involved in the ergosterol synthesis. In this study, an A. nidulans INSIG-1 homolog, insA was cloned and analysed. InsA showed high amino acid similarities to human INSIG-1. Null mutants of insA showed no significant phenotypic difference compared to its wild-type in both normoxia and hypoxia. In contrast, over-expression of InsA under the control of inducible promoter alcA caused cells to show high sensitivity to itraconazole, indicating that activation of HitA was prevented. Such an inhibition in the InsA over-expressed strains was rescued by co-overexpression with HitA or the HitA N-terminus but not with the C-terminus of HitA turning back into the wild-type phenotype in the presence of itraconazole. In hypoxia and in the presence of itraconazole, hitA transcription was considerably induced, while the level of insA transcripts was reduced compared to that shown in normoxia and cultures without itraconazole. However, such a transcription induction of hitA was prevented when InsA was over-expressed. Furthermore, in insA null mutants the level of hitA transcripts in normoxia was enhanced similar to that in hypoxia showing no difference by Northern analysis. These results implied that InsA playes a negative role on the HitA activation similarly shown in mammals. In addition, an auto-regulation of HitA was predictable in A. nidulans.