세포 분화유도제에 의한 HL-60세포 분화 유도중 H2B Histone gene발현에 관한 연구

박정동 충남대학교 1993 국내석사

TPA로 야기된 HL-60세포의 기질부착에 대한 Asadisulphide의 억제효과

박미아 忠南大學校 1995 국내석사

Fucoidan의 마우스 비장세포에서 세포사 유도 및 사람 백혈병 세포(HL-60) 에서의 항암 효과 연구

양혜열 제주대학교 일반대학원 2017 국내석사

Fucoidan은 갈조류에서 추출한 황화다당체이다. 항암효과와 소염효과등 여 러 효과들이 알려져 있다. Fucoidan은 비장세포를 자극시켜 면역증진에 영향 을 미치고, 고분자량을 가진 fucoidan이 보다 강력한 면역 자극 활성을 가진 다고 알려져 있다. 그러나 예비 실험 결과 fucoidan이 세포 독성 효과가 나 타날 수 있다고 생각되었다. 그리하여 4종류의 fucoidan을 가지고 실험을 실 시하였다. MTT assay를 사용하여 실험했을 때, fucoidan B가 fucoidan A에 비해 비장 세포의 활성도를 유의적으로 감소시키는 결과를 보였다. 유세포 분 석으로 비장 세포의 크기 감소를 알았고, 현미경 관찰로 비장 세포의 형태를 분석함으로써 fucoidan B를 처리한 세포에서 세포사를 확인 할 수 있었다. 또 한 세포사 중 초기 세포사를 유도하는 것을 확인하였고, 미토콘드리아 막전위 도 감소하였다. 따라서 면역세포에 독성을 미치는 fucoidan B가 암세포에서도 대사활성을 감소시켜 항암효과를 나타낼 수 있을지에 대해서 검증해보기로 했 다. HL-60 세포는 human leukemia 세포주이고, 마찬가지로 fucoidan B를 처리했다. Fucoidan B 처리로 인해 HL-60의 대사 활성이 감소되었고, 세포 의 형태도 차이가 있었다. Fucoidan 처리로 인해 일어난 세포사인지 검증하 기 위해 Annexin V/propidium iodide 염색을 하여 flow cytometry로 확인 해보았다. Fucoidan B는 지속적으로 HL-60 세포의 세포 자멸사를 포함한 세포사를 유도했다. 또한, 미토콘드리아의 막을 불안정하게 만들고 reactive oxygen species (ROS)의 생산을 변화시켰다. 기존 보고와는 다르게 fucoidan은 비장세포와 HL-60세포에서 세포독성을 보였다. 따라서 fucoidan이 HL-60 세포에 항암 활성을 가지고 있다고 판단 된다. 본 연구로 fucoidan이 면역 세포에 세포독성 효과를 가지며 나아가 백 혈병의 항암제로 사용될 수 있음을 기대한다. Fucoidan is a sulfated polysaccharide, purified from brown algae. It has been known to have multiple biological activities including anti-cancer and anti-inflammatory effects. Previous our reports demonstrated that fucoidan can stimulate splenocytes and especially high molecular weight fucoidan is responsible for the immunostimulatory activity. However, we recently found that the activity of fucoidan can be dependent on its individual batch or sources. 4 different fucoidans (fucoidan A, fucoidan B, high molecular weight fucoidan, low molecular weight fucoidan) were used for this study. MTT assay showed that fucoidan B significantly decreased the cellular activity of splenocytes compared to fucoidan A. Furthermore, fucoidan B consistently killed splenocytes based on the cell size by flow cytometry analysis and the morphology by an inverted microscope. fucoidan B decreased the MMP and induced the early apoptosis of splenocytes. So, we tried to examine whether fucoidan B, which is toxic to immune cells, could reduce the metabolic activity of cancer cells and show anticancer effects. We cultured HL-60 cells, a human leukemia cell line and treated with the same fucoidan. Fucoidan B. The metabolic activity of HL-60 cells was decreased by fucoidan. And also, the morphology of HL-60 treated by fucoidan was changed. To clarify whether the fucoidan’s effect was attributed to cell death, namely cytotoxicity, we analyzed the size and the level of Annexin V/propidium iodide staining of HL-60 cells by a flow cytometer. Fucoidan consistently induced the cell death including apoptosis of HL-60 cells. As potential mechanisms, fucoidan destabilized the mitochondrial membrane potential and altered the production of reactive oxygen species in HL-60 cells. Taken together, we suggest that different batches or origin of fucoidan may have differential activities on splenocytes, immunostimulatory and cytotoxic activity. Also, we suggest that fucoidan has anti-tumor activity on HL-60 cells via the destabilization of mitochondrial membrane potential. The present study demonstrates that fucoidan can be used as an anti-cancer agent for leukemia based on its mechanism.

분화 유도제에 따른 HL-60 세포의 표현형 및 기능 변화

최수경 梨花女子大學校 2000 국내박사

In this study N-N dimethylformamide (DMF) or all-trans retinoic acid (ATRA) is used to differentiate promyelocytic cell line HL-60 into granulocytes and 1α-25-dihydroxycholecalciferol (vitamin D3) into monocytes, respectively. And the expressions of immunoglobulin receptors FcγRI (CD64) and FcγRII (CD32), LPS receptor CD14, and adhesion molecules CD11c/CD18 on HL-60 cells were quantified and also the functional studies including respiratory burst, opsonophagocytic assay and apoptosis were performed. HL-60 cells (5×105 cells/mL) were cultured in RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and induced to differentiate by adding 0.8% DMF, 1 μM ATRA or 20 μg/mL vitamin D3. HL-60 cells were analyzed for phenotypic and functional differntiation before and 1, 2, 3, 4 and 5 days after the stimulation with each inducers. The results of phenotypic analysis showed that there were no significant differences in the expression of CD64 on HL-60 cells before and after the stimulation by DMF, ATRA or vitamin D3. The expression of CD32 on HL-60 cells increased significantly on the first day of stimulation by all three inducers, which shows that the FcγRII is the main receptor of immunoglobulins in mature granulocytes. There was no expression of CD14 before the induction of differentiation and it increased significantly on the day 3 by DMF and on the day 4 by ATRA induction. On the other hand, when induced by vitamin D3 the expression of CD14 increased significantly on the first day which shows that vitamin D3 differentiates HL-60 cells into monocytes in the earlier stages of differentiation. CD11c was not expressed on HL-60 cells before the induction of differentiation and the expression increased significantly on the first day of differentiation by all three inducers and increased continuously until the day 5. There were no significant differences in expression of CD11c by the three inducers. Seventy six percent of HL-60 cells already expressed CD18 before the induction of differentiation and the expression increased significantly by all three inducers. The results of respiratory burst showed significant increase in chemiluminescence on the day 3 and continuation of increase until the day 5 after indution of differentiation by DMF. Induction of differentiation by ATRA or vitamin D3 showed singnificant increase of chemiluminescence on the day 4. Differentiation by ATRA or vitamin D3 showed significantly higher level of respiratory burst than DMF. Opsonophagocytic assay using 19F S. pneumoniae killing assay showed 49.7% of opsonophagocytic titer before the differentiation induction of HL-60 cells. On the days 1 and 2 HL-60 cells stimulated by DMF showed significantly higher opsonophagocytic titer than by the other two inducers. However, by the day 5 the titer increased to over 90% by all three inducers and there were no significant differences in opsonophagocytic titer among the inducers. Apoptotic cell fraction of HL-60 cells before the differentiation was 1.8% and it increased to 20% on the day 5 by DMF or ATRA stimulations. On the other hand, induction by vitamin D3 showed no increase of apoptotic cell fraction until the day 4 and slightly increased to 3.6% on the day 5 which is still much lower than the fractions by DMF or ATRA stimulations. The correlation coefficiency between CD32, CD14, CD11c and CD18 and opsonophagocytic assay showed the high correlation between DMF induced phenotypes and opsonophagocytic titer and particularly CD11c showed high correlation with opsonophagocytotic activity. In summary, the study of phenotypic and functional assays and apoptosis by inducing differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cell line using various chemical and physiological mediators such as DMF, ATRA or vitamin D3 facilitates an understanding of myeloid cell differentiation as well as the variable expression of surface markers on myeloid leukemia cells. The level of differentiation of HL-60 cells varied depending on the inducer used. Especially induction by DMF showed early differentiation of HL-60 cells to more mature cells in just two days. And during vitamin D3 stimulation the apoptotic cell fraction was significantly lower than the other inducers, therefore it may be presumed that the quality of the differentiated cells would be much better than when induced by the other two inducers. The results of this study could be used as bases for the further studies using HL-60 cell line. 본 연구에서는 HL-60 세포를 과립구로 분화시키는 N-N- dimethylformamide (DMF) 및 all-trans retinoic acid (ATRA)와 주로 단구로 분화시키는 1α-25-dihydroxycholecalciferol (vitamin D3)을 HL-60 세포에 첨가하여 배양하면서 분화단계에 따라 면역글로불린 수용체인 FcγI (CD64), FcγII (CD32)와 lipopolysaccaride (LPS) 수용체인 CD14 및 유착분자인 CD11c/CD18의 발현 정도를 조사하고, 아울러 이러한 분화과정 동안에 세포의 opsonophagocytic activity, respiratory burst의 기능적 변화와 apoptosis를 측정하였다. 연구방법은 HL-60 세포를 10% 우태아혈청이 함유된 RPMI 1640 배지에 5×105 cells/mL의 농도로 맞추어 각각 0.8% DMF, 1 μM ATRA 및 20 μg/mL vitamin D3를 첨가하여 배양하면서 분화유도 전과 분화유도 1, 2, 3, 4 및 5일째에 세포의 표현형 분석 및 기능 시험을 시행하였다. 연구 결과는 다음과 같았다. DMF, ATRA 및 vitamin D3에 의한 HL-60 세포의 분화 유도 시 CD64 발현은 자극 전에 비해 자극 후에 의미있는 변화를 나타내지 않았으며, 각 분화 유도제에 따른 CD64 발현의 차이도 보이지 않았다. CD32는 분화 유도 전에 비해 세 가지 분화 유도제에 의해 1일째부터 의미있는 증가 소견을 보여 FcγII 가 성숙한 중성구의 주된 수용체임과 부합하는 소견을 나타내었다. CD14는 분화 유도 전에는 발현되지 않다가 HL-60 세포를 주로 과립구로 분화시키는 DMF와 ATRA에 의해서는 3, 4일째에 의미있는 증가를 보인 반면, 단구로 분화시키는 vitamin D3에 의해서는 1일째부터 급격한 발현 증가를 보여 vitamin D3가 HL-60 세포를 단구로 초기부터 분화시킴을 알 수 있었다. 분화 유도 전에는 거의 발현되지 않던 CD11c는 세 가지 자극제에 의해 자극 후 1일째에 세 군 모두에서 의미있는 발현 증가를 나타내어 5일째까지 계속 증가하는 소견을 나타내었고, 세 가지 자극제에 의한 날짜별 CD11c의 발현의 의미있는 차이를 보이지 않았다. CD18은 분화 유도 전 76.5%의 높은 발현 정도를 보였고 DMF, ATRA 및 vitamin D3에 의해서 표현이 증가하였으며 각 자극제에 따라 표현의 증가에 차이는 있었다. DMF, ATRA 및 vitamin D3 자극에 의한 HL-60 세포의 기능 변화 중 respiratory burst의 측정 결과, 자극 전에 비해 DMF에 의해서는 자극 3일째에 의미있는 증가를 보였고 계속 증가하였다. ATRA에 의해서는 4일째에 급격한 증가를 보였으며, vitamin D3에 의해서는 이보다는 낮으나 역시 4일째에 의미있는 증가 소견을 나타내었다. Respiratory burst의 정도는 ATRA와 vitamin D3로 자극했을 때 DMF에 의한 자극 시 보다 훨씬 더 증가하는 소견을 나타내었다. 19F S. pneumoniae에 대한 opsonophagocytic activity를 HL-60 세포의 분화 정도에 따라 측정한 결과, 분화 유도전에는 opsonophagocytic titer가 49.7%로 나타났고 자극 1, 2일째에는 DMF로 분화시킬 때가 ATRA나 vitamin D3에 비해 의미있게 높은 소견을 보였으나, 5일째에는 모두 90% 이상의 opsonophagocytic titer를 나타내어 별 차이를 보이지 않았다. Apoptotic fraction은 HL-60 세포를 분화시키기 전에 1.8%였고, DMF와 ATRA에 의해서는 5일째에 20%까지 증가한 반면, vitamin D3에 의해서는 4일째까지 apoptotic cell의 증가를 보이지 않다가 5일째에 약간 증가하는 소견을 보여 apoptosis는 DMF나 ATRA로 자극했을 때보다 vitamin D3로 자극 시 월등히 낮음을 관찰할 수 있었다. CD32, CD14, CD11c, CD18의 발현정도와 opsonophagocytic activity와의 상관관계는 DMF로 자극했을 때 가장 좋은 것으로 나타났으며, 또한 CD11c가 opsonophagocytic activity와 상관관계가 높은 소견을 보였다. HL-60 세포를 DMF, ATRA 및 vitamin D3로 자극했을 때 각 분화 유도제에 따라 HL-60 세포의 분화 정도에 차이가 있음을 다양한 세포막 수용체와 유착분자들의 발현 정도의 차이를 보아 알 수 있었으며, 또한 자극제에 의한 분화유도 과정이 정상 백혈구 분화과정과 항상 일치하는 것은 아니라는 사실을 알 수 있었다. 특히 DMF에 의해 분화 유도시키는 경우 2일 간의 짧은 기간 동안에 HL-60 세포가 충분히 분화되는 사실을 확인할 수 있었고, vitamin D3의 경우 세포의 apoptosis 정도가 현저히 낮으므로 세포의 질은 가장 좋을 것으로 생각된다. 향후 항 폐구균 항체의 기능 시험에 사용되는 opsonophagocytic assay를 비롯한 HL-60 세포를 재료로 하는 여러 가지 실험에 본 연구의 결과가 적용될 수 있으리라 생각된다.

권백의 Caspase-3 활성화를 통한 HL-60 세포에서 세포사멸 유도효과

남항우 圓光大學校 2003 국내박사

한의학에서 암을 비롯한 모든 질병은 인체를 정체관적(整體觀的) 개념에서 정기(正氣)와 사기(邪氣)의 성쇠에 의하여 발생된다고 인식하므로, 암의 치료 또한 증형에 따라 건비익기(建脾益氣), 자보간신(滋補肝腎) 등의 부정법(扶正法)과 활혈화어(活血化瘀), 화담연견(化痰軟堅) 등의 거사법(祛邪法), 그리고 동시에 부정법과 거사법을 응용한 부정거사법(扶正祛邪法)이 이용된다. 이 중 활혈화어법은 적극적인 치료방식으로 어혈(瘀血)과 종양의 밀접한 관련성 때문에 많이 응용되는 치법이다. 권백(卷柏)은 부처손과에 속하는 다년생 초본인 부처손의 전초로 수렴지혈(收斂止血), 활혈 거어(活血祛瘀)의 효능이 있어 오장사기(五臟邪氣), 음중한열통(陰中寒熱痛), 징하(징하), 혈폐(血閉), 절자(絶子), 해역(咳逆), 탈항(脫肛), 임결(淋結), 두중풍현(頭中風眩), 강익정(强益精) 등의 치료에 활용되었다. 이에 저자는 수렴지혈(收斂止血), 활혈거어(活血祛瘀)의 효능이 있는 권백의 항암효과를 규명하고자 혈액암세포주인 HL-60세포를 이용하여 MTT assay, LDH activity, DNA fragmentation 등을 관찰하였다. MTT assay 결과, 권백은 dose-dependent하게 cell viability를 감소시켰으며, LDH activity의 증가 유의성은 인정되지 않았다. 또한 형태학적 관찰에서 세포크기의 축소와 apoptotic body가 관찰되었으며 Hoechst 33342 stain과 전기영동 관찰에서 nuclear fragmentation이 관찰되었고, apoptosis에 관여하는 caspase-3 activation의 증가, PARP cleavage의 증가, Bcl-2 발현감소 등의 소견이 관찰되었다. 이상의 실험관찰 결과, 권백은 HL-60세포에서 apoptosis를 유도하는 유의한 결과를 얻었기 에 보고하는 바이다. The Selaginella Tamariscina is widely used in the traditional oriental herbal medicine for its anti-inflammatory, antioxidant effects. The effects of aqueous extracts of Selaginella Tamariscina on the viability and induction of apoptotic cell death were investigated in HL-60 cells. The cell viability after treating with extract of Selaginella Tamariscina was quantified by MTT assay and trypan bleu exclusion method. The results showed that could inhibit the proliferation of HL-60 cells and caused a 40% inhibition of HL-60 cells at concentrations of 400 ㎍/ml. The cancericidic effect of Selaginella Tamariscina was mediated by apoptosis. Thus, HL-60 cells exposed to Selaginella Tamariscina displayed the DNA fragmentation ladder and nucleus chromatin condensation characteristic for apoptosis. The enzyme activity of caspase-3 and actived caspase-3 protein were markedly increased in HL-60 cells treated with the extract of Selaginella Tamariscina. In addition, the extract of Selaginella Tamariscina induced cleavage of PARP, a known substrate for caspase-3. The expression of Bcl-2, anti-apoptotic protein, was decreased by treatment of the aqueous extract of Selaginella Tamariscina in a dose-dependent manner. And the expression of pro-apoptotic Bax protein was increased. In conclusion, our results suggest that the extract of Selaginella Tamariscina may induce the apoptotic death of HL-60 cells via activation of caspase-3, cleavage of PARP protein, depletion of cellular ATP levels and Bcl-2 degradation.

사람 백혈병성 세포주로부터 수지상세포로의 분화 유도

이대희 고신대학교 대학원 2001 국내박사

목적: 사람의 백혈병 치료에 있어서 전통적인 항암제 사용에 따른 부작용을 감소시키고 보다 효율적인 치료법을 개발하기 위한 연구의 일환으로 시작된 분화유도요법(differention therapy)에서 all-trans-retinoic acid (ATRA)가 acute promyelocytic leukemia의 완해를 유도하기는 하지만 ATRA로 지속적인 치료를 받던 대부분의 환자들에게서 acute promyelocytic leukemia가 재발되었으며 ATRA에 저항성인 백혈병으로 발전했다는 보고가 있었다. 이러한 ATRA에 저항성인 백혈병 세포로부터 수지상세포로의 분화를 유도하여 환자의 T-세포성 면역을 강화시키는 입양면역요법(adoptive immunotherapy)을 실제 임상에 적용시키기 위한 전단계 연구로서 사람의 백혈병성 세포주로부터 수지상세포(dendritic cells)로의 분화 유도 기술을 개발하고 그 분화 기전을 연구하였다. 방법: 본 연구는 먼저 백혈병성 세포의 분화 정도를 측정하기 위한 척도로서 세포 내 myeloblastin (mbn, proteinase-3, PR-3)의 표현을 보기 위하여 사람의 전혈에서 proteinase-3를 분리해서 가토에 접종하여 항 PR-3 항체를 생산하였다. 분화유도요법에서 백혈병 세포의 분화 정도와 상관성이 있다고 보고된 mbn mRNA의 특성을 조사하기 위해서 정상인과 백혈병 환자의 전혈에서 total RNA를 분리한 후 RT-PCR을 하여 mbn mRNA 의 발현을 검사하였다. acute promyelocytic leukemia 세포 기원의 HL-60 세포에 대해서 ATRA, dimethylsulfoxide (DMSO), phorbol 12-myristate-13- acetate (PMA)로 유도분화를 시켰으며 total RNA와 단백질을 분리한 후 RT-PCR을 하여 mbn mRNA 의 발현을 검사하고 정제한 항 mbn 항체를 사용한 ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)로 mbn 단백질의 발현을 측정하였다. 완해 유도 후 입양면역요법을 위한 수지상세포의 분화 유도를 위해 HL-60, NC-37, RPMI 7666, K-562 세포들에 대해 calcium ionophore (CI), Flt3-ligand (FL), PMA를 처리한 RPMI 1640 배지에서 배양시킨 후 모두 수거해서 이들 각각의 세포들에 대해서 Wright 염색법에 의한 형태학적 검사를 하고 total RNA를 분리해서 RT-PCR을 하여 세포 내 수지상세포의 분화와 관련된 전사산물(transcripts)의 발현을 검사하였다. 결과: 급성골수구성백혈병(AML) 환자와 다발성골수종(MM) 환자 그리고 정상인의 말초 혈액에서 mbn mRNA의 발현을 검사한 결과 급성골수구성백혈병(AML) 환자와 다발성골수종(MM) 환자의 말초혈백혈구에서만 mbn mRNA가 발현되었고 정상인의 말초혈구세포에서는 mbn 유전자의 전사는 일어나지 않았다. 그러므로 mbn mRNA의 발현을 혈구세포의 분화 정도를 측정하는 지표로 쓸 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. HL-60 세포에서 ATRA, DMSO, PMA에 의한 mbn mRNA 발현의 조절에 있어서 PMA는 mbn mRNA 발현을 강하게 억제하였다. 그러나 ATRA와 DMSO에 의한 mbn mRNA 발현의 억제는 불완전하였다. HL-60와 acute myelocytic leukemia(AML) 환자의 말초혈백혈구 세포를 ATRA, DMSO, cholecalciferol을 사용하여 유도 분화시킨 결과 대조군과 동일하게 모든 세포에서 mbn mRNA가 발현되어서 이들 분화 유도제에 의한 세포 분화는 불완전하였다. 항암화학요법과 all-trans-retinoic acid 투여를 받은 AML 환자의 말초혈백혈구에는 IL-15 mRNA의 발현이 억제되었다. 백혈병성 세포주로부터 수지상세포로의 분화유도를 한 결과 HL-60 세포주에서는 PMA를 사용해서 긴 세포질 돌기를 가진 수지상세포 표현형으로 분화유도를 시킬수 있었고 RPMI 7666 세포주로부터는 FL을 사용해서 긴 세포질 돌기를 가진 수지상세포 표현형으로 분화유도를 시킬수 있었으며 그리고 NC-37 세포주에서는 PMA와 FL을 사용해서 veiled cell 형태의 수지상세포 표현형으로 분화유도를 시킬수 있었다. 본 실험에서 CI에 의한 HL-60, NC-37, RPMI 7666, K-562 세포의 수지상세포로의 분화는 일어나지 않았다. 결론: all-trans-retinoic acid에 저항성인 백혈병을 치유하기 위한 입양면역요법을 개발하기 위하여 사람의 백혈병성 세포주로부터 수지상세포로의 분화유도를 연구한 결과 HL-60 세포주에서는 PMA를, RPMI 7666 세포주로부터는 FL을, 그리고 NC-37 세포주에서는 PMA와 FL을 사용해서 수지상세포 표현형으로 분화유도를 시킬수 있었다. 이러한 분화 유도는 diacylglycerol(DAG)의 활성화에 의한 신호전달경로가 가장 중요한 요소를 구성할 것으로 예상되며 이 방법은 향후 세포성 면역요법(cellular immunotherapy)이나 cellular leukemia vaccine을 개발하기 위한 용도의 수지상세포를 얻는데 매우 유용할 것이다. Background: Recent clinical studies have shown that a high proportion of patients with acute promyelocytic leukemia (APL) achieve complete remission after treatment with all-trans retinoic acid (ATRA). However, most patients who received continuous treatment with ATRA relapse and develop ATRA-resistant leukemia. In this study, the author investigates the strategies to overcome ATRA resistance of acute promyelocytic leukemia (APL) cells by inducing the differentiation of dendritic cells (DCs) from human leukemic cell lines for the development of adoptive immunotherapy. Myeloblastin (mbn) was used as one of the indicator of differentiation in this study. Methods: To study the biochemical and enzymatic charicteristics of human myeloblastin the enzyme was extracted from human leukocytes and purified by a combination of Ultrogel AcA 54 and Bio-Rex 70 chromatographies. To evaluate the mbn protein expression in cells, anti-mbn antibody was prepared by two step procedure including ammonium sulfate precipitation and DEAE-cellulose ion exchange chromatography. HL-60 cells were induced to differentiation by the addition of all-trans retinoic acid (ATRA), dimethyl sulfoxide (DMSO), phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), cholecalcitriol (V_D) to the media for 6 days and the expression of mbn mRNA and mbn protein were determined by RT-PCR method. HL-60 cells, K-562 cells, NC-37 and RPMI 7666 cells were cultured in RPMI 1640 supplemented with 10% fetal calf serum for 7 days, with various agents or ligands such as calcium ionophore (CI), Flt3-ligand (FL) and phorbol 12-myristate-13-acetate (PMA) to generation of dendritic cells from the cell lines. A portion of the each cells were harvested and the rest of the each cells were cultured in the new RPMI 1640 supplemented with 10% fetal calf serum, with Flt3-ligand for 7 more days. RNA was extracted from each cells and gene expression of each cells were determined by RT-PCR method. The morphology of the cells were evaluated from cytospin slide preparations with Wright's stain. Results: 3.8 mg of proteinase-3 was isolated from 67 mg of leukocyte extract. 6 g of anti-mbn polyclonal antibody was raised. PMA induced a significant inhibition of mbn mRNA expression in HL-60 cells. The cells exposed to ATRA or DMSO or VD showed a little change in the mbn mRNA expression. Thus the terminal differention of HL-60 cells and K-562 cells by ATRA, DMSO, VD, and hemin were incomplete and a large fraction of the cells were in undifferentiated or premature states. The promyelocytic leukemic cell line HL-60, B lymphoblast cell lines RPMI 7666 and NC-37 could be induced to dendritic cells in vitro. Treatment of HL-60 with PMA resulted in the expression of myeloid-related DC phenotypes, while treatment of RPMI 7666 with FL and treatment of NC-37 with PMA and FL led to the expression of lymphoid-related DC phenotypes. Conclusion: In conclusion, myeloid-related DC phenotypes and lymphoid- related DC phenotypes can be generated from HL-60, NC-37 and RPMI 7666 cell lines, respectively. These DC phenotypes can potentially be used as a cellular leukemia vaccine in vivo or to generate antileukemic T cells in vitro for adoptive immunotherapy.

H_(2)O_(2) 및 감마방사선에 의한 HL-60 세포 사멸에서 polyamine의 기능

신광식 경기대학교 대학원 2001 국내석사

최근 H2O2가 세포손상을 일으켜서 apoptosis를 유발하는 것으로 알려져 있다. 본 연구는 사람 백혈병 세포인 HL-60에 H2O2에 의한 caspase-3 활성변화 및 apoptosis 과정에서 polyamine이 어떻게 관여하는지를 밝혀 보고자 한다. ornithin decarboxylase 저해제인 α-difluoronmethyl ornithine (DFMO, 3 mM)을 48시간 동안 처리하여 세포내 putrescine과 spermidine을 고갈된 HL-60 세포에 H2O2 (200 μM)에 의한 apoptosis을 diphenylamine assay, DNA 분절 및, 유동세포 분석기로 측정한 결과, apoptosis는 대조군보다 50 % 정도 억제되었다. 그러나 H2O2에 의한 apoptosis에서의 caspase-3 활성에는 영향이 없었다. DFMO를 처리한 후, putrescine (1 mM)과 spermidine (1 mM)를 첨가시킨 결과, H2O2에 의한 apoptosis는 DFMO를 처리하지 않은 대조군과 유사하게 회복되었다. S-adenosyl methionine decarboxylase 저해제인 methylglyoxal bis-(quamyl hydrasone) (MGBG, 250 μM)를 24시간 동안 처리하여 putrescine의 농도 변화없이 spermine만 고갈된 HL-60 세포에 H2O2 (100 μM)를 처리한 결과, H2O2에 의한 apoptosis는 2배정도 증가되었다. 따라서 putrescine (또는 spermidine)과 spermine은 H2O2에 의해 유도되는 apoptosis에서 서로 다른 역할을 한다고 볼 수 있다. 결론적으로 putrescine 및 spermine은 caspase-3에 관계없이 H2O2에 의해 유도되는 apoptosis의 신호전달에 있어 중요한 기능을 할 것으로 사료된다. DFMO를 처리하여 polyamine이 고갈된 HL-60 세포는 감마방사선 (20 Gy, 1 Gy/min)에 의한 apoptosis가 지연되었다. 이 결과는 cell cycle arrest에 의한 현상으로 볼 수 있다. Putrescine과 spermidine 고갈된 세포는 G1 arrest가 감마방사선에 의해 유도되었고, 이어서 G2 arrest가 약 20~24시간 정도 지연되었다. 그러나 MGBG를 처리하여 spermine이 고갈된 HL-60 세포를 감마방사선을 조사하여 유동세포 분석기로 측정한 결과, cell cycle arrest는 유도되지 않았고 apoptosis가 대조군보다 2배정도 증가되었다. 결론적으로 putrescine (또는 spermidine)과 spermine는 H2O2 및 감마방사선에 의한 apoptosis를 서로 다르게 조절하는 것으로 사료된다. Apoptosis의 기작에 있어서 polyamine의 기능은 계속적으로 더 연구되어야 할 것이다. Recent studies indicate that H2O2 can damage cells and then induce apoptosis. In this study, we determined whether polyamines were capable of affecting caspase-3 activity by H2O2 and subsequently apoptotic response in leukemia HL-60 cell. α-Difluoromethyl ornithine (DFMO) treatment (3 mM, 48 hours), that depleted intracellular putrescine and spermidine by inhibiting ornithine decarboxylase, suppressed apoptotic response by H2O2 in HL-60 cells. By contrast, it did not affect caspase-3 activity by H2O2 in HL-60 cells. Apoptotic induction of putrescine and spermidine-depleted cells with H2O2 (200 μM) was by 50 % lower than that in the control cells, as determined by flow cytometry, DNA fragmentation and diphenylamine assay. Following the exogenous addition of putrescine (1 mM) and spermidine (1 mM), apoptotic induction by H2O2 was restored to similar level with DFMO untreated control cells. Inhibition of S-adenosyl methionine decarboxylase by methylglyoxal bis (quanyl hydrasone) (MGBG, 250 μM, 24 hours), which led to a reduction of spermine without a significant change of putrescine, showed an increase by 300% in apoptosis by H2O2, suggesting that putrescine (or spermidine) and spermine differently act in the H2O2 induced apoptotic process. In conclusion, it may be that putrescine or spermindine play a critical role in signaling transducers of apoptosis by H2O2 through the caspase-3 independent event We found that polyamine depletion by DFMO delay the apoptosis by γ-irradiation (20 Gy, 1 Gy/min) in HL-60 leukemia cells. It may be that this phenomenon is resulted from cell cycle arrest. In the putresince and spermidine depleted cells, G1 arrest was induced by γ-irradiation and subsequently G2 phase arrest are delayed about 20~24 hours. By contrast, spermine depletion by MGBG did not induce cell cycle arrest by γ-irradiation and sensitize apoptotic response by γ-irradiation, as determined by flow cytometry. Apoptotic responses in cells with MGBG are two folds as sensitive as untreated cells after γ-irradiation. In conclusion, it may be that putrescines (or spermidine) and spermines play a different role in modulation of apoptosis by H2O2 and γ-radiation. However, the role polyamines, putrescine and spermidine, play in the mechanism of apoptotic induction should be further investigated.

HL-60 세포의 c-myc 발현에 대한 Phorbol ester와 Calcium ionophore의 상승작용

배진척 전남대학교 1990 국내박사

백혈병과 같은 경우에는 세포들의 분화과정중에 이상이 생겨 미분화세포 상태로 머물게 되는데 이러한 미분화 상태는 가역적이다. 그래서 세포분화 유도물질의 단독 또는 병합사용시 인체 전골수구성 백혈병 (promyelocytic leukemia) 환자에서 얻어진 HL-60세포의 분화정도 및 c-myc 유전자의 발현 정도를 알아 보고, 분화유도물질의 세포내 자극 전달 방법을 알아 보고자 본 실험을 수행하였다. 1. HL-60세포를 배양하면서 세포내 칼슘이온을 증가시키는 calcium ionophore A23187. 세포내로의 칼슘이온 이동을 억제하는 diltiazem, calmodulin 억제제인 trifluoperazine을 각각 처리하면 세포의 형태에는 변화가 없었으나, 12-0-tetradecanoyl phorbol-13-acetate(TPA, phorbolester) 처리시에는 분화된 모양을 볼 수 있었다. 세 약제 각각에 TPA틀 병합처리하면 세포는 분화가 되었으며, 그 중 calcium ionophore와의 병합시에 분화가 가장 현저하였다. 이 때 HL-60세포의 증식은 대조군에 비해 모두 억제되었다. 2. 분화유토물질로 24시간 내지 72시간 처리한 HL-60세포를 nitrocellulose filter에 고정하여 c-myc probe로 dot blot hybridization을 실시하였던 바, TPA로 처리한 세포에서는 c-myc RNA양이 감소하였고, calcium ionephore로 처리한 세포에서는 증가하였으며, 상기 두 약제를 병합처리한 세포에서는 현저히 감소하였다. Trifluoperazine처리시에는 c-myc RNA양이 증가하였다. 3. 분화유도물질로 24시간 처리한 HL-60세포에서 poly(A^(+)) mRMA를 추출하여 Northern blot hybridization을 실시하였던 바, dot blot hybridization때와 같이 TPA처리시에는 감소하였고 TPA와 calcium ionophore의 병합처리시에는 상승작용을 보여 c-myc 발현이 더욱 감소하였다. frifluoperazine처리시에는 c-myc발현이 현저히 증가하였다. The effect of differentiation inducers alone or in combination on the degree of cellular differentiation and the level of c-myc expression was a>sessed in human promyelocytic leukemia cell line HL-60. And the method of signal transduction in the cell was investigated in the same cell. 1.TPA (12-0- tetradecanoyl phorbol-l3-acetate)-treated HL-60 cells showed the morphological differentiation, while either calcium ionophore A23187-, trifluoperazine-, or diltiazem-treated cells didn't. Among the three combinations of TPA and other agents, the calcium ionophore and TPA combination revealed the greatest effect on the cellular differentiation. Compared with control, the proliferation of cells treated with the inducers was suppressed. 2.Cells that. had been treated kith the inducers, fixed onto nitro cellulose filter, and assessed by the method of dot blot hybridization showed that the c-myc RNA level of TPA-treated cells decreased and that of calcium ionophorP-treated tells increased, while cells treated with the combination of these two agents produced a significant reduction in that level. And the c-myc RNA level of trifluoperazine-treated cells increased noticeably. 3.Poly(A^(+)) mRNA was extracted from cells treated with the inducers for 24 hours. Northern blot analysis showed that, the c-myct expression of TPA-treated cells decreased and that of cell treated with the combination of calcium ionophore and TPA decreased more, while the c-myc expression of trifluoperazine-treated cells increased significantly.

폴리아민 억제제 처리에 의한 HL-60 세포의 방사선 및 H₂O₂의 감수성 조사

이진 忠南大學校 大學院 2002 국내석사

Methylglyoxal-bis (guanylhydrazone) (MGBG), one of the polyamine analogue, is known to inhibit biosynthesis of polyamines, which are participated in numerous cellular processes including cell proliferation and protein synthesis, In this study, we first showed that the MGBG treatment significantly affected intracellular redox states. It decreased NADP^(+) dependent isocitrate dehydrogenase and glucose-6-phosphate dehydrogenase producing NADPH that is essential reducing equivalent for the regeneration of reduced glutathione (GSH) by glutathione reductase and the GSSG/GSSG+GSH ratio was accordingly increased. We also showed that MGBG treatment decreased the intracelluar thioredoxine level, which is closely associated with protection against -radiation-induced damage. The above results resulted in changes of reactive oxygen species levels such as superoxide anion (·O_(2)^(-)) and hydrogen peroxide (H_(2)O_(2)) in HL-60 leukemia cells. To combat against the cytotoxicity by increasing ·O_(2)^(-), intracellular Cu,Zn superoxide dismutase (SOD), converting ·O_(2)^(-) into H_(2)O_(2) into water, was not. On the contrary, catalase was greatly decreased. As a subsequent result, it increased the protein carbonylation content, an established marker of oxidative damage. In conclusion, the imbalance of intracellular redox state induced by MGBG treatment led to the enhancement of the efficiency of H_(2)O_(2)-and ionizing radiation-induced cell death.

HL-60 세포 분화유도중 DNA Topoisomerase Ⅰ 발현에 대한 세포 분화유도제의 영향

최병한 충남대학교 대학원 1993 국내석사

Effects of the differentiation inducers on DNA replication and DNA topoisomerase I (Topo I) gene expression have been investigated during the differentiation of human promyelocytic leukemia cell line HL-60. All-trans retinoic acid (retinoic acid) and dimethyl sulfoxide (DMSO) decreased DNA synthesis at 24 hours and 12-0- tetradecanoylphorbol 13-acetate (TPA) decreased at 12 hours after exposure, respectively. The Topo I mRNA was slowly reduced to 24 hours in retinoic acid-exposured HL-60 cell, DMSO and TPA transiently increased Topo I mRNA at 2-4 hours, and the gene expression was prolonged to 24 hours by TPA and rapidly reduced at 24 hours by DMSO, respectively. The specific activity of Topo I in retinoic acid or DMSO-exposured HL-60 cells was gradually decreased, TPA showed maximal increment at 4 hours and rapid decrease at 24 hours. All of three differentiation inducers reduced the Topo I expression in proportion to the concentration. The Topo I mRNA in DMSO- and TPA-exposured cells was elevated by cycloheximide treatment and in retinoic acid-exposured cell was constant. These results suggest that Topo I gene expression is variable according to the kinds of the differentiation inducers in HL-60 cells.