Bacillus subtilis 포자 표면에서 coat protein들을 이용한 녹색형광단백질의 발현 비교

이동훈 동국대학교 2019 국내석사

The eGFP was expressed on the surface of the Bacillus subtilis spore by CotB, CotC and CotG, known as outer coat of Bacillus subtilis. The eGFP was displayed by sub-cloning CotC and CotG in CotB-GFP-pUB19-2 made in a previous study. The effectiveness of eGFP expression according to the anchoring motif was compared by measuring the Mean Fluorescence Intensity (MFI) through flow cytometry. As a result, 1.5×104 MFI was measured when using CotB-GFP-pUB19-2, which is 6.5 times, 3.4 times higher than the CotC(2.3×103 MFI), CotG(4.4×103 MFI) respectively. This result shows that eGFP expression according to the anchoring motif has different effectiveness. In order to check the stability of eGFPs displayed by 3 different anchoring motifs, we treated them with various conditions of temperature, pH, proteinase K and trypsin. Stability of eGFP has been increased when spore display system was applied. In addition, the eGFP expressed by CotC or CotG as anchoring motif Showed higher stability than the eGFP expressed by CotB. However, expression efficiency of eGFP with CotB is 3.4 times higher than with CotC or CotG. In conclusion it has been considered that CotB as an anchoring motif would be a better option for eGFP expression than CotC or CotG. Among the various factors for a successful spore display system, the results of this study comparing the effectiveness of the anchoring motif will be an important study for determining the anchoring motif in the spore display system study.

생쥐 간세포에서 siRNA를 이용한 두가지 다른방법에 의한 EGFP유전자의 사일런스 패턴의 비교

최호준 건국대학교 대학원 2005 국내석사

한글초록:RNAi는 transcription 이후 특정 sequence에서 작용하는 유전자 silencing으로 유전자 기능을 조사하기 위해 사용할 수 있는 powerful genetic tool이다. 또한, 다른 gene targeting 방법보다 값싸고, 간편한 방법이다. 본 실험은 특정 유전자를 silencing 시킨 형질전환동물을 생산하기 위한 기본적인 방법을 확립하기 위해 수행되었다. 생쥐 간 세포에서 construct transfection과 virus infection의 두가지 다른 방법으로 생쥐 U6 promotor를 연결시킨 retroviral vector pQCXIN과 pLXIZ를 통하여 siRNA expression을 시킨 후, EGFP 유전자의 silencing 양상을 비교하였고, EGFP 유전자의 발현을 다양한 시간별로 조사하였다. 지속적이고 안정적으로 EGFP를 발현하는 세포주를 생산하기 위해 생쥐 간 세포에 pEGFP-C1 constuct를 도입하였다. 이들 EGFP 발현 세포들에 EGFP siRNA를 발현시키는 retrovirus와 plasmid vector를 도입하였고, EGFP의 발현 정도를 정확히 측정하기 위해 도입 후, 24 시간 동안 3 시간 별로 RT-PCR을 수행하였다. 도입 효율을 비교하면, virus가 plasmid 보다 효율이 더 좋았다. Virus를 infection 시킨 세포에서의 EGFP 발현 정도는 infection 후, 9 시간째부터 유의적으로 감소하였고, vector를 transfection 시킨 세포에서는 transfection 후, 12 시간째부터 유의적으로 감소하였다 (P<0.05). 그러나 두가지의 다른 retroviral vector인 pRNAi와 pLXIZU6에서는 유의적인 차이를 보이지 않았다. 본 실험은 vector와 virus간의 EGFP gene silencing 정도를 비교하기 위한, 그리고 gene silencing이 일어나기 시작하는 시간을 조사하기 위한 첫번째 실험이었다. 본 실험의 결과들은 유전자의 silencing 효과에서 retrovirus를 infection 하는 방법은 vector constuct를 transfection 하는 방법보다 더 효과적이고, 유용하다는 점을 제시하였다 영문초록:RNAi is a process of sequence-specific posttranscriptional gene silencing and is a powerful genetic tool to analyze gene function. In addition, this technique is more inexpensive and simple than other gene targeting methods. This experiment was performed to establish the fundamental protocol to produce the specific gene silenced clone animal. To compare with gene silencing pattern of EGFP in mouse liver cell by two different methods using siRNA, retroviral vectors, pQCXIN and pLXIZ, with mouse U6 promotor were utilized as a construct and a virus. And the level of EGFP expression was investigated at various time after transfectd with constructs and infected with viruses. To produce the cell line continuously expressing EGFP, mouse liver cells were transfected with the pEGFP-C1 construct. These EGFP expressing cells were transfected with the plasmid vector and in vitro packaged retrovirus expressing EGFP siRNA. To measure the level of EGFP expression, RT-PCR was performed in every 3 hours for 24 hours from the time of transfection. When the transfection efficiency was compared between the plasmid vector and the virus, the virus infected cells was higher efficiency of transfection than the plasmid transfected cells. The level of EGFP expression from the virus infected cells was significantly decreased in 9 hours after infection, the level of EGFP expression from the vector transfected cells was significantly decreased and in 12 hours after transfection (P<0.05). However, the levels of EGFP expression between the two different retroviral vectors pRNAi and pLXIZU6 were not significantly different. This study was first experiment to compare the level of EGFP gene silencing between vector and virus, and to detect the start time of gene silencing. Therefore, results from present study suggest that the infection with in vitro packaged retrovirus is more efficient and convenient than the transfection with the retroviral construct in gene silencing effect

돌연변이 EGFP를 이용한 변형된 AMES test

김건희 전남대학교 대학원 2012 국내석사

The Ames test is a short-term bacterial reverse mutation assay specifically designed to detect a wide range of chemical substances using Salmonella typhimurium that can that lead to gene mutations and is used world-wide as an initial screen to determine the mutagenic potential of chemicals and drugs. Enhanced GFP (EGFP) has increased fluorescence, photostability and folding efficiency. I created mutant EGFP by base substitution (Leu138Pro, EGFPmut1) or by deletion of one G (5G, EGFPmut2) or addition of one G (7G, EGFPmut3) at Gly52 Gly53 which are encoded by a string 6 Gs. Mutant EGFP failed to emit fluorescence upon exposure to blue light. TA100 and TA98 are renowned Ames test strains that have been used to detect base pair substitution and frame shift mutation respectively. These two strains were individually transformed with EGFPmut1 and EGFPmut2/3, and then were subject to mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) and ICR-191. Bacterial cultures were spread on nutrient agar plates and incubated at 37 ? C. Subsequently EGFP+ colonies were counted under a fluorescent microscope. The reversion to EGFP+ was further confirmed by DNA sequencing. The rate of EGFP+ reversion in the bacteria transformed with the mutant EGFP constructs was comparable to the rate of His+ reversion. All the revertants from EGFPmut1 had Ser (TCG) substituting for Pro138 (CCG). The EGFP+ revertants from EGFPmut2 carried additional G and no A, T or C even though insertion of any type of nucleotide could confer reversion due to Wobble phenomenon. The EGFP+ revertants from EGFPmut3 were found to carry 6Gs elicited by a single base pair deletion. Taken together, these results demonstrated that the mutant EGFP constructs can be used as an alternative to the Ames test. The modified Ames test described here has several advantages over Ames test. First, the modified Ames test is less sensitive that Ames test. Second, it does not have spontaneous reversion and does not need to confirm genotypes. Lastly, its readout can be scored by presence of fluorescence, which could be of great use in animal experiments.

돼지 부종병 예방을 위한 재조합 mStx2e 단백질 백신의 개발 및 평가

유정희 전북대학교 대학원 2024 국내박사

Yeast, Mouse, Human의 D-Amino Acid Oxidase와 Enhanced Green Fluorescent Protein, S-layer를 융합한 재조합 단백질의 특성

안민경 영남대학교 대학원 2014 국내석사

D-amino acid oxidase present in human liver, kidney, and brain (DAAO) is known to decompose the D-amino acids, which are accumulated with the progress of aging, and to control the concentration of D-serine, a neurotransmitter in the brain. The high activity of DAAO in the human brain causes to decrease the D-Serine level, which would induce depression, brain metastasis disease, and schizophrenia. In contrast, the low activity of DAAO in the spinal cord causes to increase the D-Serine level, which might lead to Amyotrophic Lateral Sclerosis(ALS) and amyotrophic lateral sclerosis. Recombinant proteins with histidine tags have been easily purified using Ni-NTA resins. The His-Ni affinity columns, however, would not be economical for a scale-up process because of the high costs of the commercial Ni-NTA resins. Accordingly, this study focused on developing more economical process of purification for the large scale production of recombinant D-amino acid oxidases. Bioreporters of the Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) from jellyfish and the S-layer protein of Lactobacillus brevis were used to make a fusion protein with each D-amino acid oxidase of yeast (Rhodosporidium toruloides), mouse, and human. All the recombinant genes were expressed in Escherichia coli BL21(DE3) by being cloned in pET200/D-TOPO vector (Invitrogen). Specific activities of each recombinant D-amino acid oxidase were tested with D-Alanine, D-Leucine, D-Phenylalanine, D-Methionine, and D-Serine as major substrates. The results were summarized as follows: (a) Compared with the activities of YeastDAAO, those of a fusion protein of EGFP::YeastDAAO (EY) resulted in increasing 25% activity toward D-Alanine and 3% toward D-Serine, but decreasing 13% activity toward D-Leucine, and those of a fusion protein of S-layer::Yeast DAAO (SY) resulted in increasing 29% activity toward D-Alanine, but decreasing 12% activity toward D-Leucine. (b) Compared with the activities of MouseDAAO, those of a fusion protein of EGFP::MouseDAAO (EM) resulted in increasing 11% activity toward D-Alanine and 14% toward D-Phenyl alanine, but decreasing 5% activity toward D-Serine, and those of a fusion protein of S-layer::Yeast DAAO (SY) resulted in increasing 29% activity toward D-Alanine, but decreasing 12% activity toward D-Leucine, and those of a fusion protein of S-layer::MouseDAAO (SM) resulted in increasing 14% toward D-Phenyl alanine, but decreasing 13% activity toward D-Serine, and 15% activity toward D-Alanine. (C) Compared with the activities of HumanDAAO, those of a fusion protein of EGFP::HumanDAAO (EH) resulted in increasing 8% toward D-Phenyl alanine, but decreasing 2% activity toward D-Serine, and those of a fusion protein of S-layer::HumanDAAO (SH) resulted in increasing 4% toward D-Phenyl alanine, but decreasing 3% activity toward D-Serine. It was shown in this study that the EGFP fusion proteins were easily monitored during various steps of isolation, purification and concentration of proteins due to their green fluorescent color and the S-layer fusion proteins extracted from cellular membranes with LiCl solution were also easily isolated by centrifugation because of their self-assembling characteristics. Analysis with scanning electron microscope (FE-SEM) was proved that the S-layer fusion proteins were adhered well on the surface of both positive and negative charged surfaces as well as hydrophobic surfaces, strongly indicating that the S-layer fusion proteins could be very useful to attach human DAAO enzyme to internal cell surfaces of human body. 인간의 간, 신장, 뇌에 분포되어 있는 D-amino acid oxidase(DAAO)는 노화가 진행됨에 따라 축적된 D-amino acids를 분해시키고, 뇌에서 신경전달물질인 D-serine을 조절하는 것으로 알려져 있다. 인체 뇌에서 D-Serine의 정도에 따라 우울증, 뇌전증, 정신분열증을 유발하며, 척수에서 DAAO의 활성이 저하되면 D-Serine을 증가시키고 축적하기 때문에 근육 위축을 일으켜, 근위축성측삭경화증(ALS,루게릭병)을 일으키는 것으로 보고되었다. 재조합 단백질의 정제 방법으로는 재조합 단백질 말단에 붙힌 여러 개 histidine의 Nickel ion에 대한 선택적 결합능을 이용하여 재조합단백질 정제를 간편하게 할 수 있으나, 재조합 단백질을 대량으로 생산하기에는 고가의 Ni-NTA resine 으로 인해 경제성이 떨어진다. 본 연구는 이러한 질병에 관한 연구를 위하여 Human D-amino acid oxidase를 경제적이고 효율적으로 분리, 정제 할 수 있도록, Bioreporter로 사용되는 해파리 유래의 Enhanced Green Fluorescent protein(EGFP)과 Lactobacillus brevis 유래의 S-layer protein을 이용하여 DAAO의 융합단백질을 개발하여 대량생산, 정제를 용이하게 하고자 하였다. Yeast DAAO, Mouse DAAO, Human DAAO와 S-layer(S-), EGFP(E-)를 각각Yeast, Mouse, Human DAAO에 융합한 모든 유전자는 pET200/D-TOPO vector(Invitrogen)에 클로닝하여 E.coli BL21에서 발현 시켰다. 융합단백질 제조에 따른 기질 특이성 변화를 조사하기 위해 D-Alanine, D-Leucine, D-Phenylalanine, D-Methionine, D-Serine 5가지 기질에 따른 활성을 비교 하였다. EGFP::Yeast DAAO(EY)는 D-Alanine에 대한 상대 활성은 25%증가 하였고, D-Leucine에 대한 활성은 13%감소하였으나, D-Serine에 대한 활성은 3%증가된 것으로 확인 되었다. EGFP::Mouse DAAO(EM)의 경우 D-Alanine에 대한 상대 활성이 11% 감소하였고, D-Phenyl alanine에서 14%증가 하였다. 반면,D-Serine에 대해서는 5% 감소하였다. EGFP::Human DAAO(EH)의 경우 D-phenyl alanine에 대한 상대 활성이 8% 증가 하였고, D-serine에 대해서는 2% 감소하였다. S-layer::Yeast DAAO(SY)는 D-Alanine에 대한 상대 활성이 29%증가 하였고, D-Leucine에 대해서는 12%감소하였으나 D-Serine에 대한 활성은 동일하였다. S-layer::Mouse DAAO(SM)의 경우 D-Alanine에 대한 상대 활성이 15%감소하였고, D-Phenyl alanine에 대해서는14%증가 하였으나 D-Serine에 대해서는 13%감소하였다. S-layer::Human DAAO(SH)의 상대 활성은 D-Phenyl alanine에 대해 4%증가하였고, D-Serine에 대해서는 3%감소하였다. EGFP fusion protein은 융합단백질의 분리, 정제 과정에서 형광색의 발색 정도로 단백질의 발현, 정제, 농축 정도를 간편하게 모니터링 할 수 있었다. S-layer와 fusion된 Protein의 경우 Cell membrane에서 단백질을 직접 추출 하였고, self-assembly기능을 이용하여 단백질을 쉽게 분리정제 할 수 있었다. S-layer융합단백질은 주사전자현미경(FE-SEM)을 통해 관찰 한 결과 양전하와 음전하를 띄는 CM, DEAE resine, 소수성인 Phenly SP resine에 잘 점착됨을 확인 하였다. 본 연구에서 개발한 S-layer와 fusion된 DAAO가 체내로 들어갔을 때, 세포내 점착성을 증진 시킬 것으로 예상되며, S-layer를 지지체로 하여 DAAO 효소 고정을 용이 하게 하여 인체 질환관련, D-amino acids에 대한 연구에 응용 될 수 있다.

Overexpression of eGFP in Bacillus subtilis DB104 using cry2Aa and cyt1Aa promoters

박진호 동국대학교 일반대학원 2022 국내석사

Strong promoters for overexpression of recombinant proteins in Bacillus subtilis have been developed. In this study, the cry2Aa promoter (Pcry2Aa) and cyt1Aa promoter (Pcyt1Aa), which are known to be strongly expressed in B. thuringiensis, were introduced into B. subtilis DB104. Pcry2Aa was replaced with a σE consensus promoter sequence, and the three Shine-Dalgarno (SD) of the cry2Aa operon were individually compared. A dual promoter was constructed cyt1Aa Bt II promoter and cry2Aa promoter (Pcyt1Aa-Pcry2Aa) with SD sequence of the cry2Aa structure gene (SD3). The protein expression ability of each promoter was compared using the eGFP reporter gene. As a result, when the σE consensus promoter sequence was applied to -35 promoter of Pcry2Aa, protein expression was increased 4.09-fold. Among the SD sequences constituting the cry2Aa operon, SD3 showed the highest protein expression ability. However, the σE consensus promoter sequence and SD3 were simultaneously applied, a synergistic effect was not observed. In case of the dual promoter, the fluorescence intensity increased 10.71-fold. Therefore, these results suggest that the engineered promoter using cry2Aa and cyt1aa promoter can be applied for recombinant protein production. Bacillus subtilis를 활용한 recombinant protein 생산을 위해 다양한 engineered promoter가 개발되어 왔다. 본 연구에서는 B. thuringiensis에서 강하게 발현되는 것으로 알려진 cry2Aa promoter (Pcry2Aa)와 cyt1Aa promoter (Pcyt1Aa)를 B. subtilis DB104에 도입하고, eGFP의 형광측정을 통해 promoter engineering에 의한 단백질 발현량를 비교한다. Pcry2Aa를 B. subtilis에서 sigma E dependent promoter에 대한 consensus sequence로 대체하였고, cry2Aa operon을 구성하는 3개의 Shine-Dalgarno (SD)서열을 개별적으로 비교하였다. 결과적으로 Pcry2Aa의 -35 서열을 변형하였을 때 4.09배, cry2Aa structure gene 발현을 조절하는 SD서열을 독립적으로 적용하였을 때 6.67배 promoter activity가 증가하였다. 하지만 변형된 -35 promoter sequence에 cry2Aa structure gene 발현을 조절하는 SD서열을 함께 적용한 경우, eGFP 발현이 감소하였다. 따라서 dual promoter 구성은 cyt1Aa의 Bt II promoter와 cry2Aa promoter에 (Pcyt1Aa-Pcry2Aa) cry2Aa structure gene SD서열을 함께 적용하였으며, 이 때 형광세기는 10.71배 증가하여 가장 높은 promoter activity를 나타냈다. 따라서 cry2Aa와 cyt1Aa의 promoter를 이용하여 B. subtilis DB104에서 recombinant protein overexpression system 개발 가능성을 확인하였다.

Overproduction of recombinant proteins using Bacillus subtilis sdp promoter in Escherichia coli

신세희 동국대학교 일반대학원 2025 국내석사

재조합 단백질 발현에서 프로모터는 발현 수준, 시점, 조절 등을 결정하는 핵심 요소로, 적절한 프로모터 선택은 단백질 생산 최적화에 중요하다. 본 연구는 Bacillus subtilis의 sdp 프로모터를 활용하여 재조합 단백질 생산량을 증대시키고자 하였다. 연구에 사용된 sdp 프로모터는 본 연구실에서 개발된 가장 강력한 단백질 발현 카세트인 Psdp-4로, 해당 카세트의 샤인-달가노(SD) 서열을 SD1로 명명하였다. In-silico 분석으로 도출한 새로운 SD 서열 SD2를 SD1과 치환하여 녹색형광단백질(eGFP)과 인간 표피성장인자(hEGF)의 발현 플라스미드를 제작했다. 각각 pUB19-Psdp-SD2-egfp, pUB19-Psdp-SD1-His6-TEV-hegf, pUB19-Psdp-SD2-His6-TEV-hegf로, 이를 E. coli DH5α와 B. subtilis DB104에 형질전환하였다. eGFP의 형광 세기를 통해 프로모터의 세기를 비교한 결과, SD2는 SD1에 비해 E. coli DH5α와 B. subtilis DB104에서 각각 2.6배 높은 형광 세기를 나타냈다. 두 균주간 최대 형광 세기를 비교했을 때, SD2에서 E. coli DH5α의 24시간 형광 세기가 B. subtilis DB104의 36시간 형광 세기보다 1.1배 더 높았다. 또한, 를 적용한 sdp 프로모터는 IPTG 유도성 프로모터보다 더 높은 형광 세기를 나타냈다. hEGF 발현에서도 SD2는 SD1보다 더 높은 발현량을 나타냈고, 특히 SD2에서 E. coli DH5α가 B. subtilis DB104보다 11.1배 더 높은 발현량을 보였다. 이러한 결과는 sdp 프로모터에서 SD2가 E. coli DH5α와 B. subtilis DB104에서 모두 효과적이었으며, 특히 E. coli DH5α에서 더 높은 발현을 유도했음을 시사한다. 본 연구는 B. subtilis의 sdp 프로모터가 재조합 단백질의 대량 생산을 위한 발현 시스템의 최적화에 기여할 수 있음을 확인했으며, 이는 산업적 규모에서 단백질 생산성을 크게 향상시킬 수 있는 잠재력을 보여준다.

외래 단백질이 발현하는 형질전환 닭의 생산

노지열 충북대학교 2014 국내박사

At present, most available biopharmaceutics are produced from cultured animal cells. However, one of the big problems of this producing systems is high production cost due to the difficulty of purification of pharmaceutics from the complex ingredients of culture medium. As a promising solution for this problem, use of “bioreactors” to address the growing demand for large quantities and increasing number of biopharmaceuticals is of prime strategic relevance to medical advancement. Most recently, chickens have been proposed as a highly efficient animal for the production of pharmaceutical proteins versus mammary gland based bioreactors. Some of the advantages of a chicken bioreactor system over its mammalian counterpart include shorter generation time, lower breeding expense and fecundity of chickens. Transgenic chicken studies have been performed for this doctorate dissertation. In the fist study, tetracycline-inducible expression system was examined to determine whether it could regulate expression of a foreign protein in a transgenic chicken model. This is because uncontrolled constitutive expression of foreign proteins has been known to cause serious physiological disturbances in transgenic animals. The use of a tetracycline-inducible expression system in transgenic chickens represents a potentially viable approach to two competing endpoints: maximal transgene expression with minimal physiological dysfunctions. I have demonstrated successful inducible expression of a transgene encoding green fluorescent protein (GFP) in transgenic chickens by feeding with doxycycline, a tetracycline derivative, and complete reversion of the induced GFP expression to pre-induction level when the inducer was removed from the diet. In addition, stable germline transmission of the exogenous transgene was confirmed in progeny chickens. In the second study, I have designed recombinant secretory EGFP (EGFPSec) in which the signal peptide sequence of the rat follicle-stimulating hormone (FSH) β-subunit was fused upstream of EGFP. Efficient secretion of the modified EGFP has been found in several cell types. Consequently, the level of the gene expression was able to be easily quantified. Application of our modified EGFP expression cassette will also be very helpful in the study of transgenic livestock intended to use as bioreactors for mass production of pharmaceuticals. The results obtained from this two main studies demonstrate the possible use of chicken as bioreactor producing foreign proteins. In addition, these results also significantly provide basic scientific knowledge in avian reproductive physiology.

바이러스와 세포간 상호작용 분석을 위해 EGFP를 발현하는 마우스 레트로바이러스 제조

박상민 단국대학교 2008 국내석사

Moloney murine leukemia virus (MoMLV) env 유전자의 PRR (proline rich region) 부분에 Green Fluoresecence Protein (GFP)을 삽입할 경우 wild type MoMLV와 비슷한 수치로 바이러스가 발현을 한다고 보고되었다. 이를 이용하여 두 가지 실험을 시행하였다. 첫째, MoMLV와 env유전자의 82번째 아미노산이 치환되어 wild type과는 달리 합포체 (syncytium)를 일으키는 MoMLV (S82F)의 PRR 부분에 GFP를 삽입하여 GFP가 지속적으로 발현하는 GFP-env chimeric 마우스 레트로바이러스인 pBR322.2+GFP를 만들어 주었고, 마우스 레트로바이러스의 수용체인 dCAT-1을 발현하는 인간 세포주에 감염시켜 합포체가 형성되는 것을 확인하였다. 또한 S82F가 pseudotype assay를 통하여 m-CAT이 발현하는 NIH3T3 세포주에서는 감염되지 않고, d-CAT이 발현하는 M. dunni 세포주에서는 감염된다고 보고되었다. Replication competent virus인 pBR322.2+GFP를 NIH3T3 세포주에 감염시킨 결과, GFP가 발현하지 않는 것을 확인하였고, 이 바이러스가 NIH3T3 세포 주에 감염 될 수 없는 것을 알 수 있었다. 둘째, gag 유전자의 110번,114번째의 아미노산을 제거한 AKV는 바이러스의 restriction factor인 Fv1에 대하여 감수성이 있다고 보고되었다. 두 가지 아미노산이 제거된 AKV gag 유전자를 chimeric 마우스 레트로바이러스인 MoMLV+GFP, MoMLV (S82F)+GFP의 gag 유전자와 치환시켜 Fv1을 발현하는 마우스 세포주에 감염 후, GFP를 통해 저항여부를 관찰하였다. 감염 결과, gag 유전자가 치환된 MoMLV+GFP는 Fv1에 대하여 저항성이 있는 것을 GFP의 발현을 통해 확인할 수 있었다. 자세한 기작에 대해선 알 수 없었고, Gag 유전자 외에도 여러 가지 다른 요인에 의하여 tropism이 결정될 수 있다고 예상하였다. Sequences encoding the GFP were inserted into the Env of Molony murine leukaemia virus. Insertion of these sequences into the proline-rich region (PRR) of Env resulted in GFP-Env protein that allowed retrovirus vector transduction of murine cells with titres similar to wild-type Env. Mutagenesis of Molony murine leukemia virus demonstrated that syncytium formation could be attributed to a single amino acid substitution within VRA, S82F. Sequences encoding the GFP were inserted into the Env of mutant moloney murine leukaemia virus(S82F); pBR322.2+GFP. I have observe that these virus induce cell to cell fusion in ecotropic murine leukemia virus receptor (dCAT-1) expressed 293 human cell lines. The Fv1 gene inhibits murine leukemia virus infection in mice, but the mechanism of Fv1-mediated restriction is poorly understood. The previous studies had demonstrated that Fv1-mediated viral tropism can be determined within the capsid protein at position 110 and 114(NN). The gag gene of M+GFP, 2+GFP is replaced gag gene of AKV(NN); M+GFP-NN, 2+GFP-NN. The constructions are infected NIH3T3 cell line. The result indicated that substitution of amino acids in MLV replicate in Fv1-expressing cells. This mutant virus would be useful for studying the mechanism of Fv1-mediated restriction.

세포 내 고효율 유전자 편집을 위한 CRISPR-Cas9 발현용 나노반응체 개발

신선혜 명지대학교 대학원 2021 국내석사

본 연구에서는 X모양의 DNA 구조체를(X-DNA라 명명) building block으로 삼아서, X-DNA와 linearization 된 plasmid를 함께 ligation시켜 DNA hydrogel을 만들었다(P-Gel이라 명명). P-Gel(Protein producing DNA hydrogel)은 유전정보를 담고 있기 때문에 세포의 핵 안에 들어가서 특정 단백질을 생성할 수 있다. 또한 3차원의 그물구조를 가지기 때문에 그 자체적으로 nano particle이라 볼 수 있다. 우리는 Delivery 효율을 증가시키기 위해 liposomal transfection reagent를 사용하여 세포에 P-Gel을 delivery 하였다. 우선 delivery가 잘 되는지를 확인하기 위해 P-Gel에 atto488 fluorescent를 달아 여러 모델의 세포주에 delivery해보았다. 좋은 delivery 효율을 보여주었기 때문에 다음으로는, 간단한 단백질인 eGFP(enhanced green fluorescent protein)를 발현하는 plasmid를 P-Gel의 재료로 사용하여 P-Gel을 통한 eGFP단백질의 형성을 확인하였다. 더 복잡한 단백질을 형성할 수 있는지 확인하기 위하여 우리는 CRISPR-Cas9 시스템을 P-Gel에 도입했다. CRISPR-Cas9는 혁신적인 유전자 편집 기술이다. 우리는 eGFP를 타겟으로 하는 sgRNA와 Cas-RFP단백질을 모두 발현하는 all-in-one vector를 P-Gel의 재료로 사용하였다. Cas9단백질에RFP(red fluorescent protein)가 붙어 빨간색 형광을 보이기 때문에 Cas9의 발현을 확인할 수 있었다. plasmid를 이용한 Cas9의 비바이러스식 delivery는 바이러스식 delivery에 비해 안전성이 높다. 많은 연구에서 바이러스를 이용한 delivery 보다 비바이러스식 delivery의 중요성을 강조하고 있다. 이러한 P-Gel을 이용한 단백질의 발현은 비 바이러스식 cell delivery platform의 종류를 더 다양하게 하는 데에 기여한다.